CN104147636A - 一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 - Google Patents
一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104147636A CN104147636A CN201410334787.5A CN201410334787A CN104147636A CN 104147636 A CN104147636 A CN 104147636A CN 201410334787 A CN201410334787 A CN 201410334787A CN 104147636 A CN104147636 A CN 104147636A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ti6al7nb
- cell
- minutes
- hours
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title abstract 2
- 238000005530 etching Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005488 sandblasting Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 27
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000005422 blasting Methods 0.000 claims description 18
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 claims description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 12
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 9
- 210000004691 chief cell of stomach Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 9
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 9
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 claims description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 6
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 244000137852 Petrea volubilis Species 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 239000004576 sand Substances 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 3
- 239000001117 sulphuric acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 229910001069 Ti alloy Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 abstract 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229910000883 Ti6Al4V Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000292525 Titanio Species 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000007743 anodising Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 231100000734 genotoxic potential Toxicity 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000007581 slurry coating method Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010301 surface-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
- C23F—NON-MECHANICAL REMOVAL OF METALLIC MATERIAL FROM SURFACE; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL; MULTI-STEP PROCESSES FOR SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL INVOLVING AT LEAST ONE PROCESS PROVIDED FOR IN CLASS C23 AND AT LEAST ONE PROCESS COVERED BY SUBCLASS C21D OR C22F OR CLASS C25
- C23F1/00—Etching metallic material by chemical means
- C23F1/10—Etching compositions
- C23F1/14—Aqueous compositions
- C23F1/16—Acidic compositions
- C23F1/26—Acidic compositions for etching refractory metals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/02—Inorganic materials
- A61L27/04—Metals or alloys
- A61L27/06—Titanium or titanium alloys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C22—METALLURGY; FERROUS OR NON-FERROUS ALLOYS; TREATMENT OF ALLOYS OR NON-FERROUS METALS
- C22C—ALLOYS
- C22C14/00—Alloys based on titanium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
- A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Metallurgy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
Abstract
本发明属于生物医用钛合金表面制备技术领域，首次将喷砂/酸蚀的表面处理工艺应用于Ti6Al7Nb表面的处理方法，发明出一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法。喷砂酸蚀后Ti6Al7Nb表面在微米级的孔洞中偶尔可见纳米级孔洞位于其中，增加了表面的多孔形态；促进成骨细胞在样品表面的增殖、黏附，促进成骨细胞分化；喷砂与酸蚀工艺均不需要高温、高压环境，设备简单，操作步骤简单易行。
Description
技术领域
本发明属于生物医用钛合金表面制备技术领域，主要涉及的是一种促进Ti6Al7Nb合金表面成骨细胞增殖、黏附和分化的表面处理方法。
背景技术
商业纯钛及钛合金的发展先后经过了以纯钛和Ti6Al4V为代表的第一个时代，以Ti5Al2.5Fe和Ti6Al7Nb为代表的第二个时代。随着钛及钛合金在临床应用的增加，在临床应用中的弊端也逐渐显露，如：纯钛的强度较低，耐磨性较差；Ti6Al4V具有较高的硬度、良好的表面性能、优越的微观结构，耐磨性优于2、3级纯钛，但是存在与周围组织结合不佳以及缓慢释放合金中的V、Al等有潜在毒性的物质。种植体植入人体后，与骨组织最理想的结合方式为材料与骨组织在分子水平的化学键合，即骨键结合，又称生物活性结合，是在临床意义下的植入体与骨组织之间无软组织中介的、光学显微镜水平下的直接接触，其应力传递是连续的，也是需长期存在体内的植入物的最佳结合模式。
近年来材料表面工艺制备理论及技术不断完善和发展，目前，钛合金种植体表面改性的方法达几十种，有些已经成功应用于临床，如表面加成法(钛浆涂层、羟基磷灰石涂层)和表面减少法(喷砂/酸蚀、可吸收性研磨介质)，有些正处于研究阶段，如表面轰击法和表面氧化法。每种表面处理方法因其原料与工艺不同表现出不同的优缺点，如羟基磷灰石(HA)涂层可以明显促进种植体周围成骨，但是存在结合强度不够，涂层剥脱的问题；阳极氧化使钛氧化层表面的分子黏合能力高并具有亲骨性，但是阳极氧化法所形成的氧化膜与钛基体结合强度仍然有待进一步提高。喷砂/酸蚀复合处理是目前商业用钛种植体最广泛采用的处理方法，钛基种植体喷砂/酸蚀复合处理后粗糙多孔的表面有利于引导成骨细胞趋化，加速骨结合，增强了种植体的抗扭矩的性能，其优越性已经通过临床实践证实。
发明内容
本发明针对上述技术内容的缺陷，首次将喷砂/酸蚀的表面处理工艺应用于Ti6Al7Nb表面的处理方法，发明出一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法。
本发明采取的技术方案：
第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15分钟，然后选取一个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室温保存待用；
第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250-300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上，使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°，将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；
第三步进行酸蚀处理：先将盐酸(HCl)、硫酸(H2SO4)和水(H2O)体积比按2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止盐酸HCl的挥发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb置于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变成紫色；
第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；
第五步细胞增殖：调整细胞密度为1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells/disc，100ul培养基，接种4h后每孔补加1ml完全培养基，37℃，孵育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培养基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ulDMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔100ul(约每孔转移96孔板中的6个孔)，测OD值(490nm、570nm)；
第六步细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×104cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片表面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基(每接种一个钛片前都要将细胞吹打均匀)，2小时后，每孔补加500ul完全培养基(沿壁缓慢滴加)，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱水50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检，喷金；
第七步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液，计数浓度调整至1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells，100ul培养基，待4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧培养基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein-AM1mmol/l，37℃下孵育15分钟；
第八步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计数调整细胞密度为6×104cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2-3分钟，加培养基终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破碎，将离心管置于超声水浴锅中每3-5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值。
有益效果：喷砂酸蚀后Ti6Al7Nb表面在微米级的孔洞中偶尔可见纳米级孔洞位于其中，增加了表面的多孔形态；微米级多孔表面促进成骨细胞在样品表面的增殖、黏附，促进成骨细胞分化；喷砂与酸蚀工艺均不需要高温、高压环境，设备简单，操作步骤简单易行。
附图说明
图1Ti6Al7Nb预处理后表面形貌
图2Ti6Al7Nb打磨和喷砂酸蚀之后样品形貌
图3Ti6Al7Nb喷砂酸蚀后的表面形貌
图4成骨细胞在Ti6Al7Nb表面的增殖，TA1:纯Ti，TC20：Ti6Al7Ni，SLA：喷砂酸蚀处理，Polishing:光滑表面(**P<0.01)
图5成骨细胞在纯Ti和Ti6Al7Ni表面黏附的形态，(a)Ti×500,(b)Ti6Al7Ni×500,(c)Ti×1000,(d)Ti6Al7Ni×1000,(e)Ti×2000,(f)Ti6Al7Ni×2000,(g)Ti×3000,(h)Ti6Al7Ni×3000
图6成骨细胞在Ti6Al7Nb表面黏附的数量，(a)Ti,(b)Ti6Al7Ni
图7成骨细胞在样品表面生长时的碱性磷酸酶的OD值，TA1:纯Ti，TC20Ti6Al7Ni，SLA：喷砂酸蚀处理，Polishing:光滑表面(**P<0.01)
具体实施方式
本发明结合附图1、附图2、附图3、附图4、附图5、附图6、附图7进行实施例中所述的一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法，本发明采取的技术方案：
第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15min，然后选取一个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室温保存待用，如图1；
第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250-300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上，使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°，将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；
第三步进行酸蚀处理：先将盐酸(HCl)、硫酸(H2SO4)和水(H2O)按体积比2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止HCl的挥发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb置于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变成紫色，如图2、图3；
第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；
第五步成骨细胞增殖：调整细胞密度为1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells/disc，100ul培养基，接种4小时后每孔补加1ml完全培养基，37℃，孵育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培养基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ulDMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔100ul(约每孔转移96孔板中的6个孔)，测OD值(490nm、570nm)，如图4；
第六步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×104cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片表面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基(每接种一个钛片前都要将细胞吹打均匀)，2小时后，每孔补加500ul完全培养基(沿壁缓慢滴加)，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱水50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检，喷金，如图5；
第七步观察成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液，计数浓度调整至1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells，100ul培养基，待4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧培养基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein-AM1mmol/l，37℃下孵育15分钟，如图6；
第八步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计数调整细胞密度为6×104cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2-3分钟，加培养基终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破碎，将离心管置于超声水浴锅中每3-5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值，如图7。
Claims (1)
1.一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法，其特征在于：本发明采取以下步骤：
第一步进行预处理：将Ti6Al7Nb棒材切割成为Φ10mm×10mm的圆柱形试块，用分析纯丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗各15分钟，然后选取一个平整的底面，在自动旋转打磨仪上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂纸将选取的平面逐级打磨，直到获得划痕均匀一致的光滑表面，然后用无水乙醇超声波清洗15分钟，将经过打磨后的Ti6Al7Nb烘干后，放入干燥箱内以室温保存待用；
第二步进行喷砂处理：将吸入式干喷砂机固定在台虎钳上，喷砂介质为白刚玉砂，粒度为60#，尺寸约为250-300μm，将Ti6Al7Nb固定在平口钳上，使吸入式干喷砂机的枪头和Ti6Al7Nb表面保持一定的距离，喷射角度选择75°，将喷砂机的气压调至为0.3MPa气压，对Ti6Al7Nb表面进行喷砂处理，喷砂时间30秒，然后将喷砂处理后的Ti6Al7Nb用去离子水冲洗，再用无水乙醇和去离子水各超声清洗10分钟，烘干，得到喷砂处理的Ti6Al7Nb；
第三步进行酸蚀处理：先将盐酸、硫酸和水按体积比2：12：11的比例混合，配制溶液过程中注意密封处理以防止HCl的挥发，然后将配好的酸蚀溶液加热至沸腾状态，保持温度不变；再将Ti6Al7Nb置于温度为50℃的蒸馏水中保温2分钟；然后置于加热的酸蚀溶液中，当将Ti6Al7Nb放入酸蚀溶液初期时，Ti6Al7Nb表面会有气泡产生，随着酸蚀时间的不断增加，Ti6Al7Nb表面产生的气泡越来越多，并且观察到酸蚀溶液由无色变成紫色；
第四步进行清洗处理：将酸蚀处理后的Ti6Al7Nb用去离子水超声清洗10分钟，烘干，得到酸蚀出来的Ti6Al7Nb；
第五步细胞增殖：调整细胞密度为1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells/disc，100ul培养基，接种4小时后每孔补加1ml完全培养基，37℃，孵育1天、3天、5天，弃旧培养基，每孔添加50ul MTT与450ul的无血清培养基的混合液，MTT浓度5mg/ml，37℃孵育4小时，弃培养基，每孔加750ulDMSO，吹打使结晶溶解后，37℃孵育10分钟，将溶解液转移至96孔板中每孔100ul，每孔转移96孔板中的6个孔，测OD值是490nm、570nm；
第六步观察细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形态：消化细胞，制备细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×104cells/ml，将调整好的细胞轻缓的接种到每个钛片表面，尽量不要溢出周边，每个钛片接5000个cells，100ul培养基，每接种一个钛片前都要将细胞吹打均匀，2小时后，每孔补加500ul完全培养基，沿壁缓慢滴加，待3天后2.5％戊二醛4℃固定4小时，弃戊二醛，无水乙醇梯度脱水50％、70％、90％、100％，两次，每个梯度脱水30分钟，完全干燥后送检，喷金；
第七步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化细胞，制备细胞悬液，计数浓度调整至1×105cells/ml，每个钛片表面接种1×104cells，100ul培养基，待4小时后每孔添加1ml完全培养基，待12小时、24小时、48小时后去除旧培养基，PBS冲洗三次，每孔加500ul染色剂calcein-AM1mmol/l，37℃下孵育15分钟；
第八步成骨细胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化细胞，制备细胞悬液，计数调整细胞密度为6×104cells/ml，每个钛片表面接种6000cells/disc，100ul培养基，每组3个样品，待4小时后补加全培养基2ml/每孔，37℃孵育1天、7天，待1天、7天后将钛片表面的细胞用0.25％的胰酶消化2-3分钟，加培养基终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体转移至离心管中，然后1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，再加入1ml PBS轻轻吹打，再次离心1500r/min，5分钟，弃上清，留沉淀细胞，在沉淀细胞中加入0.4ml PBS轻轻吹打，超声破碎，将离心管置于超声水浴锅中每3-5秒，超声一次，间隔4次，每次间隔时间30秒左右，去100μl细胞破碎悬液，置于酶标板上测量520nm波长下的OD值。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410334787.5A CN104147636B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410334787.5A CN104147636B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104147636A true CN104147636A (zh) | 2014-11-19 |
| CN104147636B CN104147636B (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=51873395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410334787.5A Expired - Fee Related CN104147636B (zh) | 2014-07-14 | 2014-07-14 | 一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104147636B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102145192A (zh) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | 财团法人金属工业研究发展中心 | 金属植入物及其表面处理方法 |
| CN102345134A (zh) * | 2011-09-13 | 2012-02-08 | 蔺增 | 润湿性可控的钛及钛合金表面多孔结构的制备方法 |
-
2014
- 2014-07-14 CN CN201410334787.5A patent/CN104147636B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102145192A (zh) * | 2010-02-05 | 2011-08-10 | 财团法人金属工业研究发展中心 | 金属植入物及其表面处理方法 |
| CN102345134A (zh) * | 2011-09-13 | 2012-02-08 | 蔺增 | 润湿性可控的钛及钛合金表面多孔结构的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LYNDON F. COOPER: ""A role for surface topography in creating and maintaining bone at titanium endosseous implants"", 《J PROSTHET DENT》 * |
| 么远: ""纯钛表面不同处理对成骨细胞生长的影响"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
| 吴义舟等: ""生物医用钛合金发展和研究现状"", 《材料开发与应用》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104147636B (zh) | 2016-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102732898B (zh) | 在医用钛或钛合金表面制备微纳米复合结构的方法 | |
| Zheng et al. | Hierarchical micro-nano topography promotes cell adhesion and osteogenic differentiation via integrin α2-PI3K-AKT signaling axis | |
| Al Qahtani et al. | Effect of surface modification of zirconia on cell adhesion, metabolic activity and proliferation of human osteoblasts | |
| Guizzardi et al. | Different titanium surface treatment influences human mandibular osteoblast response | |
| RU2385740C1 (ru) | Биоактивное покрытие на имплантате из титана и способ его получения | |
| US9809906B2 (en) | Method and apparatus to coat a metal implant with electrospun nanofiber matrix | |
| CN108795289B (zh) | 一种纳米化钛表面负载Si、Cu-TiO2抗菌型生物活性膜层的制备方法 | |
| Mastrangelo et al. | Effects of Novel Laser Dental Implant Microtopography on Human Osteoblast Proliferation and Bone Deposition. | |
| Sarraf et al. | Structural and mechanical characterization of Al/Al2O3 nanotube thin film on TiV alloy | |
| WO2023193704A1 (zh) | 一种表面具有微孔结构的金属及其制备方法与应用 | |
| Pensabene et al. | Flexible polymeric ultrathin film for mesenchymal stem cell differentiation | |
| Zhang et al. | Amorphous carbon modification on implant surface: a general strategy to enhance osteogenic differentiation for diverse biomaterials via FAK/ERK1/2 signaling pathways | |
| RU2476243C1 (ru) | Способ получения кальцийфосфатного покрытия на имплантате из биоинертного материала (варианты) | |
| JP2012050426A (ja) | 細胞培養担体及び細胞培養方法 | |
| CN111041490A (zh) | 一种能够促进接触成骨的纯钛表面处理方法 | |
| CN104147636B (zh) | 一种促进成骨细胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面处理方法 | |
| CN109911873A (zh) | 一种钛种植体表面组装纳米级羟基磷灰石的方法 | |
| Chakraborty et al. | Multifunctional gradient coatings of phosphate-free bioactive glass on SS316L biomedical implant materials for improved fixation | |
| EP3027234B1 (en) | Osteoinductive materials | |
| RU2424381C1 (ru) | Способ получения износостойкого покрытия на алюминии и его сплавах | |
| Zhao et al. | Preparation and properties of composite manganese/fluorine coatings on metallic titanium | |
| CN114306730A (zh) | 一种具有接触抗菌效应的针状磷酸钙结构的钛合金表面涂层的制备方法 | |
| Wang et al. | Effect of a hybrid micro/nano-integrated titanium surface on behavior of rat osteoblasts | |
| CN112301399A (zh) | 一种牙科种植体的表面处理方法 | |
| CN112126926A (zh) | 钛表面修饰纳米结构同步加载生物活性锌离子的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160120 |