CN104147001A

CN104147001A - 五味子乙素在制备nadph氧化酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN104147001A
Application number: CN201310179455.XA
Authority: CN
Inventors: 胡汛; 张彪; 刘振; 高锦明
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明提供五味子乙素在制备NADPH氧化酶抑制剂中的应用，所述NADPH氧化酶包括氧化酶的各种亚型。在体外酶学实验中五味子乙素能抑制NADPH氧化酶催化的超氧离子生成反应，对细胞内NADPH氧化酶相关的活性氧产生也有抑制作用，且五味子乙素分子本身不具有自由基清除功能，因此五味子乙素是一种NADPH氧化酶的抑制剂。同时NADPH氧化酶能改变多个信号传导通路水平，能抑制肿瘤转移的发生，可在制备治疗肿瘤转移药物中的应用。

Description

五味子乙素在制备NADPH氧化酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明属制药领域，主要涉及五味子乙素在制备NADPH氧化酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶）抑制剂的医药用途。

背景技术

五味子乙素是在中药北五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素。多项研究发现，五味子乙素能保护包括心、肝、肾、脑和皮肤在内的许多组织及脏器，使它们免受自由基的伤害。

NADPH氧化酶是一类能在生物膜上转移电子的蛋白。大概地讲，氧气分子（O₂）是电子受体，电子转移反应的产物是超氧离子（?O_2- ^-）。超氧离子（?O_2- ^-）在细胞内会进一步转化成羟基自由基（HO?），过氧化自由基（ROO?），烷氧化自由基（RO?），羟基过氧化自由基（HOO?），及一些具有氧化活性，及/或易于转变成自由基的非自由基，以上统称为活性氧族（reactive oxygen species）。超氧离子（?O_2- ^-）亦能与氮类化合物，如一氧化氮(NO)，反应生成活性氮族（reactive nitrogen species，RNS）。因此，NADPH氧化酶的生物学功能是利用氧气产生活性氧族及一些活性氮族。

活性氧族极易与很多分子发生反应，其中包括DNA,蛋白，脂类，碳水化合物及核苷酸。此类反应可产生一个次生自由基，而放大损伤程度。活性氧族不仅参与细胞损伤过程及病原菌杀伤过程，还参与几乎所有细胞和组织中的可逆调节过程。然而，尽管活性氧族在调节基本生理反应中有重要作用，活性氧族亦可不可逆地破坏或改变目标分子的功能。因而，活性氧族越来越被视为生物体损伤的一个重要因素，称之为“氧化应激”。

NADPH氧化酶家族包括NADPH氧化酶1，NADPH氧化酶2，NADPH氧化酶3，NADPH氧化酶4，NADPH氧化酶5，Dual氧化酶1及Dual氧化酶2。NADPH氧化酶都包含多次跨膜结构域，因而都定位在生物膜上。不同于其他成员，NADPH氧化酶4活性主要依赖其表达量（该酶复合体需要另一个亚基p22，但p22为组成型表达）。多年来的研究发现，NADPH氧化酶与多种疾病模型相关，如肿瘤进展、肺损伤后纤维化、中风后神经损伤及退行，心肌损伤及纤维化等。因此，开发NADPH氧化酶抑制剂用于治疗和预防相关疾病十分迫切。

到目前为止，没有五味子乙素抑制NADPH氧化酶及用于治疗肿瘤转移的报道。

发明内容

本发明的目的是提供五味子乙素在制备NADPH氧化酶抑制剂中的应用，五味子乙素的结构式如下：

所述NADPH氧化酶包括氧化酶的各种亚型，包括NADPH氧化酶1，NADPH氧化酶2，NADPH氧化酶3，NADPH氧化酶4，NADPH氧化酶5，Dual氧化酶1及Dual氧化酶2。优选NADPH氧化酶4。五味子乙素在体外酶学实验中能抑制NADPH氧化酶4催化的超氧离子生成反应，对细胞内NADPH氧化酶4相关的活性氧产生也有抑制作用，且五味子乙素分子本身不具有自由基清除功能，因此五味子乙素是一种NADPH氧化酶的抑制剂。

本发明的另一个目的是提供五味子乙素在制备治疗肿瘤转移药物中的应用。所述肿瘤转移是因NADPH氧化酶所致。NADPH氧化酶4能改变多个信号传导通路水平，NADPH氧化酶4敲低能抑制肿瘤转移的发生。

目前NADPH氧化酶的抑制剂中，小分子化合物主要有吡唑并吡啶类化合物，吡唑嘧啶类化合物，三唑嘧啶类化合物。其具有共同的特性就是与NADPH，即NADPH氧化酶的底物，具有相似的化学结构。与这些化合物相比，五味子乙素的抑制活性虽然适中，但其在生物低毒性上具有较佳优势。因此，本发明提供了一种新的NADPH氧化酶抑制剂，五味子乙素作为NADPH氧化酶抑制剂具有重要的应用前景。也为新药筛选提供了基础。

附图说明

图1为五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用的浓度依赖性关系；其中，酶组分来源于细胞裂解液；Sch B代表五味子乙素；DPI代表二苯碘，作为阳性对照。

图2为五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用的浓度依赖性关系；其中，酶组分来源于细胞分离组分；Sch B代表五味子乙素。

图3为五味子乙素对TGF β因子引起的由NADPH氧化酶4介导的活性氧族升高的抑制关系；其中Sch B代表五味子乙素；TGF β代表转化生长因子β。

图4为五味子乙素的自由基清除实验。

图5为五味子乙素对小鼠4T1乳腺癌转移模型的肺转移的抑制作用；其中Sch B代表五味子乙素。

图6为五味子乙素对乳腺癌小鼠生存期的延长作用；其中Sch B代表五味子乙素。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用有浓度依赖性

实验材料：Siha细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）公司；Siha细胞裂解液作为NAPDH氧化酶4的来源；β-NADPH购自Roche公司；五味子乙素购自中国药品生物制品检定所；光泽精（Lucigenin）、二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司。

实验方法：不同浓度的五味子乙素在反应缓冲液中与100 μM NADPH，5 μM lucigeinin混匀，检测NADPH氧化酶4反应活性。相对酶活是相对于不加五味子乙素的对照组的酶反应活性。

实验结果：实验结果参见图1，可见五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用，随着药物浓度的增长而增大。

实施例2：五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用

实验材料：4T1小鼠乳腺癌细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）公司；4T1细胞经杜恩斯匀浆器匀浆后，经差速离心，分离9000 g组分，作为NADPH氧化酶4来源；β-NADPH购自Roche公司；五味子乙素购自中国药品生物制品检定所；光泽精（Lucigenin）、二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司。

实验结果：实验结果参见图2，实验结果再次证明五味子乙素对NADPH氧化酶4的抑制作用，随着药物浓度的增长而增大。

实施例3：五味子乙素对TGF β因子引起的由NADPH氧化酶4介导的活性氧族升高的抑制关系

实验材料：4T1小鼠乳腺癌细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）公司；TGF β因子购自Peprotech公司；五味子乙素购自中国药品生物制品检定所；二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）购自Sigma公司。

实验方法：10 μM的五味子乙素预处理空载体细胞及NADPH氧化酶4干扰细胞2小时，后加入5 ng/ml TGF β因子处理8小时。使用DCFH-DA检测细胞活性氧族信号值。信号相对值是相对于未处理的空载体细胞的信号之比值。

实验结果：实验结果参见图3，实验结果证明TGF β引起的活性氧族信号值增加是由NADPH氧化酶4介导的。五味子乙素能抑制TGF β引起的活性氧族信号值增加，提示五味子乙素能抑制细胞内NADPH氧化酶4的酶学活性。

实施例4：五味子乙素的DPPH自由基清除实验

实验材料：维生素C、谷胱甘肽、五味子乙素，1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）购自Sigma公司。

实验方法：维生素C、谷胱甘肽、五味子乙素均溶于甲醇中。0.5 ml DPPH溶液（200 μM，用60%甲醇/40% 0.1 M柠檬酸缓冲液，pH 5.5，新鲜配制）与0.5 ml的检测溶液（40 μM维生素C；40 μM 谷胱甘肽；40 μM五味子乙素溶液）在一比色杯中混匀。混匀后迅速于Beckman DU 730分光光度计测定520 nm的吸收值变化，测定时长为90分钟。DPPH是一种自由基，维生素C和谷胱甘肽用作阳性对照。

实验结果：实验结果参见图4，实验结果证明五味子乙素分子本身不具备自由基清除能力。

实施例5：五味子乙素对小鼠4T1乳腺癌转移模型的肺转移的抑制作用

实验材料：4T1小鼠乳腺癌细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）公司；五味子乙素购自中国药品生物。

实验方法：第0天在小鼠右侧第二乳垫位置皮下注射5×10⁴ 4T1细胞。第3-9天每天以灌胃方式对褐瘤小鼠进行100 mg/kg剂量的五味子乙素给药，共7次。第10天手术切除皮下接种的原位瘤，并继续饲养。

实验结果：实验结果参见图5，实验结果证明五味子乙素对小鼠乳腺癌肺转移的抑制作用明显。

实施例6：五味子乙素对乳腺癌小鼠生存期的延长作用

实验材料：4T1小鼠乳腺癌细胞株购自American Type Culture Collection （ATCC）公司；五味子乙素购自中国药品生物制品检定所。

实验方法：第0天在小鼠右侧第二乳垫位置皮下注射5×10⁴ 4T1细胞。第3-9天每天以灌胃方式对褐瘤小鼠进行100 mg/kg剂量的五味子乙素给药，共7次。第10天手术切除皮下接种的原位瘤，并继续饲养。第90天终止实验。

实验结果：实验结果参见图6，实验结果证明五味子乙素对乳腺癌小鼠的生存期延长作用明显。

Claims

1.一种五味子乙素在制备NADPH氧化酶抑制剂中的应用，所述五味子乙素的结构式为：

其特征在于，所述NADPH氧化酶为NADPH氧化酶1，NADPH氧化酶2，NADPH氧化酶3，NADPH氧化酶4，NADPH氧化酶5，Dual氧化酶1及Dual氧化酶2。

2.一种五味子乙素在制备治疗肿瘤转移药物中的应用，所述五味子乙素的结构式为：

其特征在于，所述肿瘤转移是因NADPH氧化酶所致。

3.根据权利要求1所述的一种五味子乙素在制备NADPH氧化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述NADPH氧化酶为NADPH氧化酶4。

4.根据权利要求2所述的一种五味子乙素在制备治疗肿瘤转移药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤转移是因NADPH氧化酶4所致。