CN104145947A - 一种大豆花粉的真空保存方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大豆花粉的真空保存方法及应用。该方法的具体操作步骤：将花蕾放入真空袋中，将袋中空气抽干净，真空袋封口，将真空袋放于4℃保存。本发明通过实验证明，采用真空保存方法对大豆花粉进行保存，使花粉活力保存时间由原来的2-4小时延长至48小时，延长了有效授粉的时间，增加了授粉时间的自由度，避开了受精卵发育的不利环境，降低了劳动强度，提高了工作效率，为杂交制种、遗传研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物生理学领域，具体为一种大豆花粉的真空保存方法及其应用。
背景技术
杂交育种是作物改良的主要途径之一。大豆为自花授粉植物，杂交制种均通过人工去雄授粉完成。通常采用的方法是：授粉前一天下午16-19时或授粉当天上午8-11时于母本植株上选取次日即将开花的花蕾，用镊子除去萼片、花冠和雄蕊，授粉当天上午7-8时于父本植株上取当天即将盛开的花朵，取出雄蕊，将花粉点在已去雄的母本雌蕊上。常规方法的缺陷在于：1)大豆花粉活力在自然条件下仅能维持2-4个小时，因此大豆杂交的授粉时间仅限于授粉当天上午的2-4个小时，如遇到阴雨、露水天气，授粉时间也会缩短，影响授粉效率。2)授粉后的雌蕊要经过整个下午的日晒，特别是在南方高温高湿的夏季，白天高温持续时间长，裸露的雌蕊由于没有花冠的保护容易干枯死亡。因此，如果能延长大豆花粉活力的保持时间，在授粉后避开白天的高温时段，则可以有效提高杂交成活率。
植物生理学研究表明：植物细胞在真空低温环境下，呼吸作用接近停滞，但其活力仍能保持一段时间。当植物细胞回到适宜环境中时，其活力恢复，细胞重新行使其原有的功能。花粉真空低温保存是植物异地授粉、花期不遇授粉以及种质资源保存的方法之一，但由于真空要求高，且低温通常在-70℃以下，保存成本昂贵，通常花粉真空低温保存方法仅用于珍稀植物，在常规作物杂交制种中并不普及。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种大豆花粉的真空保存方法。
本发明所提供的大豆花粉的真空保存方法包括如下步骤：将花蕾放入真空袋中，将袋中空气抽干净，真空袋封口，将真空袋放于4℃保存。
上述所述的方法中，将袋中空气抽干净是通过使用家用真空包装机实现的。
上述方法中，所述的花蕾为当天即将开放的花蕾。
上述所述的方法中，在将花蕾放入真空袋前，用吸水纸将花蕾水分吸干。
上述所述的方法中，在将花蕾放入真空袋中前还包括如下步骤：将所述花蕾置于培养皿中，再一起装入真空袋。
上述所述的方法中，每个所述真空袋中放50个花蕾，50个花蕾全部置于一个培养皿内，真空袋的规格为15*15cm，培养皿的规格为9*2.5cm。
上述所述大豆的品种为天隆1号、豫豆1号、中豆40号或巴西10号。
上述所述的方法中，花粉的保存时间为1-60小时、1-48小时、1-36小时或1-24小时。
上述所述的方法在大豆杂交制种中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种植物杂交制种的方法。
本发明的所提供的植物杂交制种的方法的具体步骤包括：
(1)按照上述任一所述的方法保存大豆花粉；
(2)将花蕾从真空袋中取出，置60W白炽灯下20cm处照射20分钟，然后检查花粉是否已从花药中散出，用花粉已从花药中散出的花蕾中的花粉进行授粉，如没有散出，则继续用白炽灯照射。
上述所述检查花粉是否已从花药中散出为每隔5分钟检查一次。
上述所述植物为豆科植物；所述豆科植物具体为大豆。
本发明与常规花粉保存方法相比具有如下优点：
(1)简单易行、经济实惠：常规花粉保存需要超低温冰箱以及工业真空机，设备要求高，保存成本高；本发明中所采用的真空机和冰箱均为家用，不需要任何昂贵设备和特殊保存条件，任何育种单位均能够接受，适合学校、研究所和基层育种单位应用。
(2)花粉活力保存时间长：大豆花粉在常温下活力仅能维持3-4个小时，而采用本发明方法保存的花粉活力能够保持48小时。
(3)延长了大豆授粉时间：大豆雌蕊于开花前24小时就已发育成熟，在开花后的48小时内仍具有良好的接受花粉的能力，但大豆花粉在常温下的活力仅能维持3-4个小时，使得大豆授粉时段非常有限，仅限于上午7-11时，这个时段外花粉因活力迅速丧失而无法成功授粉，限制了授粉的规模。真空低温花粉保存延长了花粉活力，大豆花粉活力的延长使大豆授粉时段增加了3-4倍，使得授粉时段由原来的7-11时延长到下午19时，组合配制数量也相应增加3-4倍，有利于集中人力大规模配制杂交组合。扩大了大豆授粉时间的自由度，有效避开不利授粉的环境条件。
(4)降低劳动强度：大豆花期为盛夏季节，在常规杂交制种方法中，操作者的授粉时间只限定上午7-11时，高温增加了操作者的劳动强度；真空保存方法使花粉活力保持时间大大延长，操作者可根据当地气候的条件灵活选取授粉时间，避开高温时段，降低劳动强度。
(5)提高授粉效率：常规大豆杂交，授粉限定于上午7-11时，授粉后的柱头需经过整个下午的高温过程，特别是在高温高湿的南方地区，人工授粉后的柱头由于缺少萼片和花冠的保存极易干枯死亡，采用真空保存的花粉授粉，可将授粉改至下午气温降低后进行，为授粉提供一个相对温和的环境，有利于提高授粉效率。
附图说明
图1为在自然条件下不同保存时间的大豆花粉活力的观察结果。1、采集3小时后；2、采集6小时后；3、采集24小时后；4、采集48小时后。
图2为在真空低温条件下不同保存时间的大豆花粉活力的观察结果。1、保存后1小时；2、保存后6小时；3、保存后24小时；4、保存后36小时；5、保存后48小时；6、保存后60小时。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
春大豆品种：天隆1号和中豆40公众可从中国农业科学院油料作物研究所大豆室购得；豫豆22号公众可从河南省农业科学院作物所购得；巴西10号公众可从华南农业大学大豆改良中心购得。
实施例1、本发明花粉保存的方法及保存后花粉活力的检测
一、保存方法
在武汉地区，选取春大豆品种天隆1号和豫豆22号，于4月3号播种，5月20号进入盛花期。于早上7-8时在父本植株上选取当天即将开放的花蕾，放于9*2.5cm培养皿中，取回的花蕾用吸水纸将花蕾上的水分吸干，每皿50个花蕾。
将装有花蕾的培养皿放入15*15cm的真空袋中，用Prestige家用真空包装机将袋中空气抽干净、封口，将真空袋放于4℃冰箱保存。
二、花粉活力检测
于不同时间后从真空袋中取出花粉，置于载玻片上，滴上一滴培养液(200mg/L的硼酸溶液+2％的蔗糖溶液)，10分钟后在显微镜下检查花粉萌发率，每个时间段检测10朵花，取平均值为该时间点的花粉萌发率，以自然条件下保存的花朵为对照。各处理的花粉活力的观察情况如图1-2所示、花粉萌发率如表1所示。结果表明：自然条件下花粉活力仅能维持3个小时左右，之后花粉萌发率急剧下降(图1)；而在真空低温状态下，花粉萌发率在48小时后仍可达到70％左右(图2)，表明真空低温处理对花粉活力的保持起着重要的作用。
表1 花粉萌发率(％)
| 自然条件 | 真空低温 | |
| 1h | 98.6 | 98.0 |
| 3h | 98.7 | 97.8 |
| 6h | 32 | 97.5 |
| 24h | 8.9 | 98.1 |
| 36h | 2.1 | 85 |
| 48h | 0 | 70 |
| 60h | 0 | 1.2 |
| 72h | 0 | 0 |
实例2、本发明花粉保存方法及杂交效率：
在武汉地区，选取春大豆天隆1号和豫豆1号，4月初播种，5月下旬进入盛花期，以豫豆1号为父本，天隆1号为母本。按照实施例1中一所述方法进行保存花粉。
在授粉前进行如下操作：将花蕾从真空袋中取出，置60W白炽灯下20cm处照射20分钟，20分钟后每隔5分钟取出3个花蕾，剥去萼片、花冠，检查花粉是否已从花药中散出，如已散出，则可用于授粉；如没有散出，则继续用白炽灯照射。于花粉采集后不同时间段对母本进行授粉，每个时段授粉50朵，连续做3天，7天后检测成活率。
成熟时将杂交荚从母本植株上取下，随机取50粒杂交种子萌发后，根据黄豆下胚轴颜色确定真假杂种，豫豆1号为紫花品种，紫花与紫色下胚轴性状连锁且受显性基因控制，以豫豆1号为父本与白花品种杂交时，真杂种均表现为紫色，平均杂交成功率如表2所示。由F1表现可以看出，真空低温保存方法延长了花粉活力的持续时间，延长了大豆授粉的时间，增加了授粉时间选择的灵活度，有利于提高杂交效率。
表2 真空低温保存花粉的杂交成功率检测(真杂种数/杂交总数)
| 自然条件 | 真空低温 | |
| 当日上午 | 23/50 | 34/50 |
| 当日下午 | 0/50 | 41/50 |
| 次日上午 | - | 32/50 |
| 次日下午 | - | 27/50 |
| 2日后上午 | - | 0/50 |
实例3、不同基因型杂交效率的检测
在武汉地区，选取春大豆中豆40号和巴西10号，4月初播种，5月下旬进入盛花期。以巴西10号为父本，中豆40为母本。按照实施例1中一所述方法进行保存花粉。
在授粉前进行如下操作：将花蕾从真空袋中取出，置60W白炽灯下20cm处照射20分钟，20分钟后每隔5分钟取出3个花蕾，剥去萼片、花冠，检查花粉是否已从花药中散出，如已散出，则可用于授粉；如没有散出，则继续用白炽灯照射。于花粉采集后分别于当日上午和下午对母本进行授粉，每个时段授粉50朵，连续做3天，7天后检测成活率。
成熟时将杂交荚从母本植株上取下，随机取50粒种子萌发15天后，根据幼苗下胚轴颜色确定真假杂种。巴西10号为棕毛品种，中豆40为灰毛品种，大豆棕色茸毛色受显性基因控制，以巴西10号为父本与灰毛品种杂交时，真杂种茸毛色均表现为棕色，平均杂交成功率如表3所示。由F1表现可以看出，真空低温保存方法在延长花粉活力持续时间、提高杂交效率等方面没有基因型依赖性。
表3 真空低温保存花粉的杂交成功率检测(真杂种数/杂交总数)
| 自然条件 | 真空低温 | |
| 当日上午 | 25/50 | 32/50 |
| 当日下午 | 0/50 | 44/50 |
Claims (10)
1.一种大豆花粉的真空保存方法，包括如下步骤：将花蕾放入真空袋中，将袋中空气抽干净，真空袋封口，将真空袋放于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述花蕾为当天即将开放的花蕾。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在将花蕾放入真空袋前，用吸水纸将花蕾水分吸干。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述将花蕾放入真空袋中前还包括如下步骤：将所述花蕾置于培养皿中，再一起装入真空袋。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述将袋中空气抽干净通过使用家用真空包装机实现。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：每个所述真空袋中放50个花蕾，50个花蕾全部置于一个培养皿内，真空袋的规格为15*15cm，培养皿的规格为9*2.5cm。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述大豆的品种为天隆1号、豫豆1号、中豆40号或巴西10号。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述保存的时间为1-60小时、1-48小时、1-36小时或1-24小时。
9.权利要求1-8任一所述的方法在大豆杂交制种中的应用。
10.一种植物杂交制种的方法，该方法的具体步骤包括：
(1)按照权利要求1-8中任一所述方法保存大豆花粉；
(2)将花蕾从真空袋中取出，置60W白炽灯下20cm处照射20分钟，然后检查花粉是否已从花药中散出，用花粉已从花药中散出的花蕾中的花粉进行授粉，如没有散出，则继续用白炽灯照射。
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