CN104127255A - 用于实验动物的血液灌流装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于实验动物的血液灌流装置。本发明所提供的装置，包括通过导管顺次连接的动脉留置针、三通阀、恒流泵、灌流器、排空气管、输液加热器和静脉留置针。本发明以家兔为实验动物，通过局部麻醉经耳中央动脉和耳缘静脉建立血管通路，简化了血液灌流操作，减轻了实验动物痛苦，减少了对实验结果的影响。留置针软质，不损伤血管内壁，可长时间保留，方便多次血液灌流。动脉端连三通阀方便采血和注射抗凝剂等药物。灌流器内部容积20ml，家兔在血液灌流中血容量的减少对基本生命体征无明显影响，灌流束后系统中的血液通过恒流泵回输动物体内，减少失血。在静脉端设置输液加温器，对体外循环血液温度的损失进行补偿，维持实验动物体温恒定。

Description

用于实验动物的血液灌流装置

技术领域

本发明属于医疗器材领域，涉及一种用于实验动物的血液灌流装置。 

背景技术

血液灌流(hemoperfusion,HP)是临床上常用的血液净化方式之一，它是通过穿刺等方法将患者血液从体内引出进行体外循环，利用体外循环灌流器中的吸附剂的吸附作用清除外源性和内源性毒物的血液净化治疗手段。中毒治疗的血液灌流一般采用活性炭或者树脂作为吸附材料。活性炭由纵横交错的空隙组成，大量的微孔构成了巨大的比表面积，溶质通过液相到达活性炭颗粒表面，然后被吸附于空隙之中，这种吸附是非特异性的，对多种有机物都具有吸附作用。树脂主要通过本身与被吸附分子之间的范德华力，或是化学键连接而发挥吸附作用。血液灌流除直接清除外源毒物以外还可以清除内生代谢产物：肌酐、尿酸、吲哚等，发挥一定肝肾功能替代作用。 

早在1948年，Muirhead最早使用树脂吸附剂对实验用犬进行了血液灌流。以往血液灌流实验以犬为实验动物，全身麻醉后在呼吸机支持下，经股动/静脉插管后连接灌流器，进行血液灌流。由于杂种犬遗传、携带微生物背景复杂；而实验用比格犬成本较高、饲养条件要求苛刻，以犬为实验动物不便于实验开展。也有血液灌流实验以家兔为实验动物，全身麻醉后经颈动/静脉插管进行血液灌流，需手术分离颈部大血管，创伤较大，术后存活时间短，实验操作复杂。全麻药物也可能干扰毒物代谢和血液灌流效果，影响了对血液灌流效果的客观评价。另外，手术创面易发生感染、出血，增加了动物的痛苦和意外死亡，增大了动物使用量，也有悖于动物伦理和“3R”原则。 

因此，亟待开发一种操作简便、对动物生理状态影响较小、经济实用的血液灌流动物模型。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于实验动物的血液灌流装置。 

本发明所提供的用于实验动物的血液灌流装置，包括通过导管顺次连接的动脉留置针、三通阀、恒流泵、灌流器、排空气管、输液加热器和静脉留置针。 

在所述装置中，所述动脉留置针可为20G动脉留置针(如美国BD公司生产的20G动脉留置针)。 

在本发明中，所述三通阀具体为美国BD公司产生的输液三通阀。 

在所述装置中，所述灌流器的罐体容积可为20mL。在本发明中，所述灌流器具体为珠海健帆生物科技股份有限公司生产的罐体容积为20mL的灌流器，该灌流器与珠海健帆生物科技股份有限公司生产的HA树脂血液灌流器结构一致，仅规格变小(其分解示意图、侧视图、俯视图、分解照片和整体照片参见图1-图5)。 

在所述装置中，所述排空气管可为静脉输液器上的排空气管。在本发明中，所述排空气管具体为青岛海诺生物工程有限公司生产的静脉输液器上的排空气管。 

在本发明中，所述恒流泵具体为保定兰格恒流泵有限公司产生的BT-100型号的恒流泵。 

在本发明中，所述输液加热器具体为河南省孟州市水星电器厂产生的wk-1型输液加热器。 

在所述装置中，所述静脉留置针可为24G静脉留置针(如美国BD公司生产的24G静脉留置针)。 

在所述装置中，所述导管可为输液管(如青岛海诺生物工程有限公司产品)。 

在所述装置中，所述灌流器内填充有吸附树脂。 

所述吸附树脂具体为HA230吸附树脂(珠海健帆生物科技股份有限公司产品)。 

所述装置还可包括灌流器支架和/或实验动物固定架。 

所述实验动物可为兔子等小型实验动物。在本发明中，所述实验动物具体为日本大耳白兔，具体为成年的日本大耳白兔，体重2500g±200g。 

另外，含有所述的血液灌流装置的试剂盒也属于本发明的保护范围。 

所述试剂盒中还含有血液抗凝剂、麻醉剂和/或说明书；所述说明书中记载如下(1)和/或(2)和/或(3)： 

(1)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物(如兔子)进行血液灌流的过程中，控制所述恒流泵的流速为2-10mL/min(如3mL/min)； 

(2)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物进行血液灌流时，将所述动静脉留置针对所述实验动物(如兔子)的一侧耳中央动脉穿刺并固定，将所述静脉留置针对所述实验动物(如兔子)的另一侧耳缘静脉穿刺并固定； 

(3)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物进行血液灌流时，对所述实验动物进行全身肝素化。 

在本发明中，所述血液抗凝剂为肝素，具体为肝素钠注射液(江苏万邦生化制药有限公司产品)。所述麻醉剂为氯已定-利多卡因喷雾剂(山东京卫制药有限公司产品)。 

所述全身肝素化，在本发明中具体为：肝素首次2mg/kg体重，首次后0.5h(即灌流前)追加2mg/kg体重，灌流期间每0.5h追加1mg/kg体重。 

实验证明，本发明以家兔为实验动物，通过局部麻醉经耳中央动脉和耳缘静脉建立血管通路，简化了血液灌流操作，减轻了实验动物痛苦，减少了对实验结果的影响。动脉和静脉留置针为软质，不损伤血管内壁，可较长时间保留，方便进行多次血液灌流。20G动脉留置针长约45cm，可经由耳中央动脉深入颈动脉分支，保证了血液灌流 的血流量。动脉端连接三通阀方便采集血液样本和注射抗凝剂等药物。特制血液灌流管内部容积约20ml，填充吸附树脂后整个灌流系统容积约25mL，家兔在血液灌流中血容量的减少对基本生命体征无明显影响，灌流结束后灌流系统中的血液会通过恒流泵回输动物体内，减少失血对动物的影响。在静脉端设置输液加温器，对体外循环血液温度的损失进行补偿，维持实验动物体温恒定。 

附图说明

图1为本发明灌流器的分解示意图。 

图2为本发明灌流器的侧视图。 

图3为本发明灌流器的俯视图。 

图4为本发明灌流器的实物分解照片。其中，1：密封螺栓，2：封头，3：密封垫圈，4：过滤网固定环，5：过滤网，6：罐体。 

图5为本发明灌流器的实物整体照片。 

图6为本发明家兔血液灌流装置动物模型的示意图。 

图7为本发明家兔血液灌流装置动物模型的实物照片。 

图8为体外实验中不同灌流速度随时间进程对5mg/L CPF的清除效果图。 

图9为体外实验中不同灌流速度随时间进程对10mg/L CPF的清除效果图。 

图10为体内实验中各时点HP组和对照组血液中CPF含量图。其中，A为对照组；B为HP组。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

1、主要仪器和材料： 

灌流器：珠海健帆生物科技股份有限公司生产的罐体容积为20mL的灌流器，该灌流器与珠海健帆生物科技股份有限公司生产的HA树脂血液灌流器结构一致，仅规格变小。灌流器由一个罐体，以及位于罐体两侧的过滤网、过滤网固定环、密封垫圈、封头和密封螺栓组成，其分解示意图、侧视图、俯视图、分解照片和整体照片分别参见图1至图5。 

HA230吸附树脂：珠海健帆生物科技股份有限公司产品。 

恒流泵：保定兰格恒流泵有限公司产品，型号为BT100。 

GI54TW高压灭菌器：美国ZEALWAY公司产品。 

JHL-SD-1500超净工作台：北京赛福科技有限公司产品。 

20G动脉留置针：美国BD公司产品。 

24G静脉留置针：美国BD公司产品。 

输液三通阀：美国BD公司产品。 

wk-1型输液加热器：河南省孟州市水星电器厂产品。 

静脉输液器：青岛海诺生物工程有限公司产品。 

2、主要药品和试剂 

有机磷杀虫剂毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)标准品：德国Dr.Ehrenstorfer公司产品。 

CPF原药：美国陶氏益农公司产品。 

480g/L CPF农药：美国陶氏益农公司产品。 

乙酸乙酯：北京化工厂产品。 

二甲苯：北京化工厂产品。 

新鲜猪全血：北京艾联联合发展科技有限公司产品。 

生理盐水：华北制药股份有限公司产品。 

氯已定-利多卡因喷雾剂：山东京卫制药有限公司产品。 

戊二醛消毒液：体积分数为2-2.5％，山东瑞泰奇洗涤消毒有限公司产品。 

肝素钠注射液：江苏万邦生化制药有限公司产品。 

3、实验动物 

健康成年白色日本大耳白兔，性别不限，体重2500g±200g，实验动物质量合格证号：SCXK(京)2012-0004。实验前动物经检疫程序在动物房环境中适应3天时间。动物房环境条件符合国家有关农药检验的相应规定，动物饲养和实验期间供应常规饲料，饮用过滤纯净水且不限制饮用量。 

实施例1、血液灌流装置的组装及家兔动物模型的建立 

一、用于实验动物的血液灌流装置的组装 

1、灌流器各部件的灭菌处理 

将20ml灌流器的罐体于120℃，高压灭菌15min，干燥后备用。过滤网、过滤网固定环、密封垫圈、封头和密封螺栓置于体积分数为2-2.5％的戊二醛溶液中浸泡60min消毒，大量无菌水冲洗备用。 

2、灌流器的装配 

在超净台内进行，取20ml HA230吸附树脂装入步骤1灭菌后的灌流器罐体内，罐体两端置入过滤网、过滤网固定环、密封垫圈和封头，旋紧两端密封螺栓。注意无菌操作。剩余吸附树脂密封后置于4℃冰箱冷藏备用。 

3、血液灌流装置的组装 

通过输液管将20G动脉留置针、输液三通阀、恒流泵、步骤2装配好的灌流器、排空气管(静脉输液器上自带)、输液加热器和静脉留置针顺次连接，组成血液灌流装 置。示意图见图6。 

二、家兔血液灌流装置动物模型的构建 

1、预冲 

预冲液1：含有2-3IU/ml(相当于10-15mg/500ml)肝素的生理盐水。 

预冲液2：不含肝素的生理盐水。 

将步骤一组装的血液灌流装置的动脉端连接50ml预冲液1，打开恒流泵，控制流速为10ml/min，使预冲液1自动脉端向静脉端预冲包括灌流器在内的整个管路，以保证HA吸附树脂充分肝素化。当50ml预冲液1使用完毕后，继续用50ml预冲液2按照如上进行预冲，以排除其中含有肝素的预冲液1。预冲过程中轻拍灌流器及管路排净其中的气体。 

2、家兔血液灌流装置动物模型的构建 

将灌流器的动脉端(即与三通阀相连的一端)朝下，静脉端(即与排空气管相连的一端)向上垂直固定于支架上。同时将排空气管也固定于支架上，与灌流器相连的一端朝上。 

将日本大耳白兔置于兔盒中固定，双侧耳脱毛备皮，表面喷涂氯已定-利多卡因喷雾剂进行麻醉和消毒，采用步骤一的血液灌流装置的动静脉留置针对一侧耳中央动脉穿刺并固定，然后通过静脉留置针经另一侧耳缘静脉回输体内。恒流泵泵速控制为3ml/min，为体外循环提供动力。 

进行血压灌流时全身肝素化，肝素首次按照2mg/kg体重的剂量进行静脉注射，灌流前(首次后0.5h)追加2mg/kg体重(静脉注射)，灌流期间通过三通阀每0.5h追加1mg/kg体重。 

结果显示，成功构建了经耳中央动脉、耳缘静脉血液灌流的家兔动物模型，如图7所示。这证明通过表浅血管穿刺建立的灌流通路可以满足血液灌流实验的需求。该方法避免了手术分离血管，大大减轻了实验动物的痛苦。 

实施例2、血液灌流对毒死蜱清除效果的体外实验 

本实施例以有机磷杀虫剂毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)为例，通过体外实验模拟动物血液灌流系统对血液中毒物的清除效果。 

一、CPF猪血溶液的制备 

取新鲜猪全血500mL，加入10000IU肝素，进行抗凝，使猪血溶液中肝素的终浓度约为20IU/ml，然后加入2.5mg CPF原药，配置成5mg/L的CPF猪血溶液。 

另取新鲜猪全血500mL，加入10000IU肝素，进行抗凝，使猪血溶液中肝素的终浓度约为20IU/ml，然后加入5mg CPF原药，配置成10mg/L的CPF猪血溶液。 

二、体外血液灌流实验 

1、血液灌流装置的预处理 

采用的血液灌流装置为实施例1步骤一组装而成的血液灌流装置，具体的预处理方法同实施例1的步骤二1。 

2、5mg/L CPF猪血溶液 

取螺口试剂瓶4只，每只置入100ml的5mg/L CPF猪血溶液，将螺口试剂瓶置入39.4℃水浴中，然后与经步骤1预处理过的实施例1中得到的血液灌流装置管路连接。分别以2mL/min、5mL/min和10mL/min进行血液灌流4h。其中，1#瓶的灌流器内不装吸附剂，作为空白对照。在灌流开始前，灌流后每隔30min取试剂瓶中全血1.0ml，检测其中的CPF含量。对灌流组和对照组各时间点的CPF浓度进行重复测量，并对数据进行方差分析。 

其中，猪血溶液中CPF含量的测定采用的是液相萃取-气相色谱法。具体如下： 

(1)样品前处理：肝素抗凝全血1.0mL，4℃低温离心机4000rpm离心10min，取0.5mL血浆加入2mL乙酸乙酯，震荡5min，4000rpm离心5min取上层有机相，再次加入2mL乙酸乙酯震荡5min，取上层有机相，合并上清液，氮气吹干，加入0.5mL乙酸乙酯定容。 

(2)色谱条件：HP-5(5％苯基-甲基聚硅氧烷，30m×0.32mm×0.25μm)毛细管柱；氮磷检测器(NPD)，柱温300℃。氮气22.4mL/min(载气)，氢气4.0mL/min，空气60mL/min；柱流量2mL/min，恒压模式；升温程序：进样口温度280℃；柱初温180℃，保持2min，然后以20℃/min的速度升至270℃，保持1min；不分流进样，进样量1μL。配置不同浓度CPF标准品溶液绘制标准曲线，采用外标法，峰时间定性，峰面积定量。 

采用的色谱仪是美国安捷伦科技公司生产的6890N气相色谱仪，自动氢气、氮气发生器为北京中惠普分析技术研究所产品，WD-12氮吹仪为苏州盖通科技有限公司产品。CPF标准品为德国Dr.Ehrenstorfer公司产品。 

3、10mg/L CPF猪血溶液 

与步骤2相比，仅将10mg/L CPF猪血溶液替换5mg/L CPF猪血溶液，其余均同步骤2。 

4、结果 

(1)不同灌流速度对5mg/L CPF吸附能力体外实验结果 

不同灌流速度随时间进程对5mg/L CPF的清除效果图如图8所示。对灌流组和对照组各时间点的CPF浓度进行重复测量资料的方差分析示：各速度灌流组和对照组之间各时点CPF浓度差别有统计学意义(P<0.05)，2mL/min、5mL/min和10mL/min灌 流组之间各时点CPF浓度差别无统计学意义(P>0.05)。 

(2)不同灌流速度对10mg/LCPF吸附能力体外实验结果 

不同灌流速度随时间进程对10mg/L CPF的清除效果图如图9所示。对灌流组和对照组各时间点的CPF浓度进行重复测量资料的方差分析示：各速度灌流组和对照组之间各时点CPF浓度差别有统计学意义(P<0.05)，2mL/min、5mL/min和10mL/min灌流组之间各时点CPF浓度差别无统计学意义(P>0.05)。 

由(1)和(2)可见，体外实验表明实施例1获得的血液灌流装置对血中的CPF具有吸附能力，通过灌流可以降低血中CPF的浓度，不同的灌流速度对灌流效果并无明显影响，在较低流速下进行灌流仍能达到清除CPF的效果。 

实施例3、血液灌流对毒死蜱清除效果的动物实验 

本实施例以有机磷杀虫剂毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)为例，以白色日本大耳白兔为实验动物，应用毒物代谢动力学指标评价动物血液灌流系统对血液中毒物的清除效果。 

一、模型制备及分组 

12只日本大耳白兔禁食12h后，按照CPF300mg/kg体重的剂量给日本大耳白兔灌胃480g/L的CPF农药，灌胃1次进行染毒。按随机数字表法将动物分为2组，每组6只。 

对照组：染毒后不予血液灌流； 

HP组：染毒后1h开始进行血液灌流，灌流持续2h。 

二、体内血液灌流实验 

1、血液灌流装置的预处理 

采用的血液灌流装置为实施例1步骤一组装而成的血液灌流装置，具体的预处理方法同实施例1的步骤二1。 

2、灌流 

将灌流器的动脉端(即与三通阀相连的一端)朝下，静脉端(即与排空气管相连的一端)向上垂直固定于支架上。同时将排空气管也固定于支架上，与灌流器相连的一端朝上。 

将HP组的日本大耳白兔置于兔盒中固定，双侧耳脱毛备皮，表面喷涂氯已定-利多卡因喷雾剂进行麻醉和消毒，采用经步骤1预处理过的实施例1获得的血液灌流装置的动静脉留置针对一侧耳中央动脉穿刺并固定，然后通过静脉留置针经另一侧耳缘静脉回输体内。开启恒流泵，泵速控制为3ml/min，为体外循环提供动力。 

进行血压灌流时全身肝素化，肝素首次按照2mg/kg体重的剂量进行静脉注射， 灌流前(首次后0.5h)追加2mg/kg体重(静脉注射)，灌流期间通过三通阀每0.5h追加1mg/kg体重。 

3、检测指标和方法 

对实验动物的呼吸、心率、口鼻分泌物和肌颤等一般情况进行观察并记录。 

灌流开始前及开始后5、15、30、45、60、90、120min从灌流器动脉端的三通阀处采集抗凝血1ml，参照实施例2中的气相色谱法对其CPF含量进行检测。灌流开始后4h、8h、12h、20h、24、48、72h后通过耳中央动脉处的动脉留置针采集动脉血，参照实施例2中的气相色谱法对其CPF含量进行检测。检测结果通过DAS3.0软件(上海中医药大学)计算代谢动力学参数。 

4、结果 

(1)实验动物的一般情况 

结果显示，HP组和对照组的日本大耳白兔的呼吸、心率、口鼻分泌物和肌颤等情况出现的时间和程度无明显差别。 

(2)各时点HP组和对照组血液中CPF含量 

各时点HP组和对照组血液中CPF含量图如图10所示。 

(3)血液灌流对CPF代谢动力学参数的影响 

如表1所示。 

表1 300mg/kg灌胃染毒的CPF代谢动力学参数 

注：^*表示与对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。 

由(1)-(3)可见，HP对动物体内的CPF有一定的清除能力，可以影响CPF在家兔体内的代谢动力学特征，使CPF达峰时间延后、清除率增加、峰浓度降低。 

Claims (10)

1.用于实验动物的血液灌流装置，包括通过导管顺次连接的动脉留置针、三通阀、恒流泵、灌流器、排空气管、输液加热器和静脉留置针。

2.根据权利要求1所述的血液灌流装置，其特征在于：所述动脉留置针为20G动脉留置针。

3.根据权利要求1或2所述的血液灌流装置，其特征在于：所述灌流器的罐体容积为20mL。

4.根据权利要求1-3中任一所述的血液灌流装置，其特征在于：所述静脉留置针为24G静脉留置针。

5.根据权利要求1-4中任一所述的血液灌流装置，其特征在于：所述导管为输液管。

6.根据权利要求1-5中任一所述的血液灌流装置，其特征在于：所述灌流器内填充有吸附树脂。

7.根据权利要求6所述的血液灌流装置，其特征在于：所述吸附树脂为HA230吸附树脂。

8.根据权利要求1-7中任一所述的血液灌流装置，其特征在于：所述装置还包括灌流器支架和/或实验动物固定架。

9.根据权利要求1-9中任一所述的血液灌流装置，其特征在于：所述实验动物为兔子。

10.含有权利要求1-9中任一所述的血液灌流装置的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有血液抗凝剂、麻醉剂和/或说明书；所述说明书中记载如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物进行血液灌流的过程中，控制所述恒流泵的流速为2-10mL/min；

(2)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物进行血液灌流时，将所述动静脉留置针对所述实验动物的一侧耳中央动脉穿刺并固定，将所述静脉留置针对所述实验动物的另一侧耳缘静脉穿刺并固定；

(3)在采用所述血液灌流装置对所述实验动物进行血液灌流时，对所述实验动物进行全身肝素化。