CN104109647A

CN104109647A - 一种复合根瘤菌剂及其制备和应用

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Publication number: CN104109647A
Application number: CN201410322688.5A
Authority: CN
Inventors: 李纪顺; 王贻莲; 魏艳丽; 刘伟; 陈凯; 杨合同
Original assignee: Jinan Agri New Fertilizer Co ltd; BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Current assignee: Jinan Agri New Fertilizer Co ltd; BIOTECHNOLOGY CENTER OF SHANDONG ACADEMY OF SCIENCES
Priority date: 2014-07-08
Filing date: 2014-07-08
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2034-07-08
Also published as: CN104109647B

Abstract

本发明公开了一种复合根瘤菌剂及其制备和应用。本发明以草炭土为载体，钼酸铵、花生秧粉、γ-聚谷氨酸、蔗糖、碳酸钙、有机硅为增效助剂，将花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05发酵液制成粉剂，有效菌数为花生慢生根瘤菌BASWS1～4亿/g，苏云金芽孢杆菌BtR056亿/g，本制剂既能高效防治蛴螬，又能显著提高花生产量。

Description

一种复合根瘤菌剂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及生物菌剂制备技术领域，特别是涉及一种复合根瘤菌剂及其制备和应用。

背景技术

花生在全国各地均有种植，主要分布于辽宁、山东、河北、河南、江苏、福建、广东、广西、四川等省（区）。其中以山东省种植面积最大，产量最多。

近年来，随着花生播种面积的不断扩大，地下害虫的危害也越来越重。其中，蛴螬是目前危害花生最大的害虫。据调查，蛴螬每年给花生带来的产量损失在20%以上，严重的甚至绝产（周帅，苏瑞峰，等.花生地下害虫—蛴螬的综合防治技术[J].种业导刊，2009.）。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BtR05（菌种保藏号CGMCCNO.2823），是山东省科学院中日友好生物技术研究中心实验室保藏菌株，该菌对蛴螬具有良好的防治效果。根瘤菌(Bradyrhizobium arachis）BASWS（菌种保藏号CGMCCNO.9351）分离于花生根瘤，该菌对花生具有很好的增产效果。

众所周知，根瘤菌虽有固氮促生作用，却无防治作物虫害的能力，制约了根瘤菌的推广应用。随着剂型技术研究的不断成熟，复合根瘤菌剂已成为研究热点，如澳大利亚Becker Underwood公司将根瘤菌菌剂中加入枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）制成的生物杀菌剂，对豆科作物增产5～15%，同时还能显著防治部分土传病害。Alosca公司在根瘤菌剂中添加了固氮细菌，也取得明显的效果。本发明将花生慢生根瘤菌BASWS和防治蛴螬的苏云金芽孢杆菌BtR05进行配比研究，确定其在肥效与防治蛴螬的最佳混合比例，并将其制成便于使用的混合粉剂，达到既能有效促进花生的生长，又能高效防治蛴螬，提高花生产量的效果。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种复合根瘤菌剂及其制备和应用。

本发明的一种复合根瘤菌剂及其制备和应用技术方案为，该复合根瘤菌剂，包括花生慢生根瘤菌 (Bradyrhizobiumarachis）BASWS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNO.9351，保藏日期是2014年6月16日和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BtR05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.2823，保藏日期是2008年12月23日。

目前该花生慢生根瘤菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNO.9351，菌种的拉丁文名称是Bradyrhizobium arachis，参据的微生物（株）：BASWS，保藏日期是2014年6月16日。

本发明所述的花生慢生根瘤菌菌株特征：花生慢生根瘤菌，菌落圆形不透明，前期为乳白色，后期为弱粉色。

花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效成分含量的比例为1:6～2:3。

优选的，花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效成分含量的比例为2:3。

花生慢生根瘤菌BASWS在该复合根瘤菌剂中的有效菌数为1～4亿/g。

苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效菌数为6亿/g。

所述的一种复合根瘤菌剂，包括按重量比的以下成分：

草炭土75.7～87.62%

钼酸铵0.5～1.0%

花生秧粉0.5～2.0%

γ-聚谷氨酸0.05～0.5%

蔗糖0.2～1.0%

碳酸钙0.1～0.5%

有机硅0.03～0.3%

花生慢生根瘤菌BASWS1.0～4.0%

苏云金芽孢杆菌BtR05 10.0～15.0%。

所述的一种复合根瘤菌剂的制备方法，花生慢生根瘤菌BASWS培养基为YMA 培养基，包括以下成分：蔗糖10 g，酵母粉1 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，K₂HPO₄ 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl₂0.05 g，0.5%钼酸钠溶液 4.0ml，0.5%硼酸溶液4.0ml，H₂O 1 000 mL，pH 6.8～7.0。

BtR05斜面及摇瓶培养基为LB；BtR05发酵培养基包括按重量比的以下成分：2%玉米粉，6%豆粉，1%蔗糖，0.5%(NH₄)₂SO₄，0.2% K₂HPO₄、0.2% KH₂PO₄，0.03% MgSO₄??7H₂O，pH7.0-7.5。

将发酵好的菌液用无菌注射器注入装有草炭土的塑料袋中，按比例注入花生慢生根瘤菌BASWS 和苏云金芽孢杆菌BtR05，添加钼酸铵，花生秧粉，γ-聚谷氨酸，蔗糖，碳酸钙，有机硅。

所述的一种复合根瘤菌剂在防治花生地下害虫蛴螬和花生增产上的应用。

本发明的有益效果为：本发明以草炭土为载体，钼酸铵、花生秧粉、γ-聚谷氨酸、蔗糖、碳酸钙、有机硅为增效助剂，将花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05发酵液制成粉剂，有效菌数为花生慢生根瘤菌BASWS1～4亿/g，苏云金芽孢杆菌BtR05 6亿/g，本发明的花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05两种菌种按比例混合后有协同作用，制备成的本发明制剂既能高效防治蛴螬，又能显著提高花生产量。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

本发明的复合根瘤菌剂，包括花生慢生根瘤菌 (Bradyrhizobiumarachis）BASWS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNO.9351，保藏日期是2014年6月16日和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BtR05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.2823，保藏日期是2008年12月23日。

实施例1

花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05共存共生配比的研究

（1）花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05的培养

花生慢生根瘤菌BASWS培养基为YMA 培养基，配方为蔗糖10 g，酵母粉1 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，K₂HPO₄ 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl₂0.05 g，钼酸钠 (0.5%溶液) 4.0ml硼酸(0.5%溶液) 4.0ml，H₂O 1 000 mL，pH 6.8～7.0。

BtR05斜面及摇瓶培养基为LB。发酵培养基为：2%玉米粉，6%豆粉，1%蔗糖，0.5%(NH4)2SO4，0.2% K2HPO4，0.2% KH2PO4，0.03% MgSO4??7H2O，pH7.0-7.5。

（2）花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05对蛴螬的毒力测定

采用喷雾法处理蛴螬3 龄幼虫。

喷雾法:用手持喷雾器分别将不同浓度的苏云金芽孢杆菌BtR05和花生慢生根瘤菌BASWS喷遍蛴螬虫体，让其自由爬行片刻后，移入罐头瓶中装土饲养，以清水为对照。每瓶饲养一头蛴螬，置于养虫室内，室温28℃，适当保湿。每处理30 头蛴螬，3 次重复。处理后每天观测一次，记录死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。苏云金芽孢杆菌BtR05和花生慢生根瘤菌BASWS对蛴螬的毒力测定结果见表1，2。

表1 BtR05发酵液对蛴螬3龄幼虫的室内毒力测定

。

注：表中同列数据后跟有字母相同者表示经Ducan新复极差法检验在0.05显著水平上差异不显著，下表同。

由表1可知BtR05发酵液有效成分含量为6.00×10⁸和3.00×10⁸ cfu??mL^-1的浓度对蛴螬3龄幼虫的杀虫效果好，48h校正死亡率分别为98.88%和93.26%。

表2花生慢生根瘤菌BASWS发酵液对蛴螬3龄幼虫的室内毒力测定

。

由表2可知BASWS发酵液对蛴螬3龄幼虫的杀虫效果很弱，在有效成分含量为1.00×10⁹ cfu??mL^-1，48h和72h校正死亡率分别为10.11%和15.27%。

（2）花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05混合配比对蛴螬的毒力测定如表3所示

表3BASWS和BtR05发酵液混合配比对蛴螬3龄幼虫的室内毒力测定

。

由表3可知，在BtR05有效成分含量不变的情况下，BASWS有效成分含量在超过4×10⁸cfu??mL^-1的时候，随着其浓度的增加，混合液对蛴螬3龄幼虫的毒力是明显下降的。表明BtR05有效成分含量为6×10⁸ cfu??mL^-1时，BASWS的添加量应控制在4×10⁸ cfu??mL^-1以下，即BASWS:BtR05有效成分含量的比例应控制在1:6～2:3之间。

（4）花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05增效混合剂量对花生种子萌发及幼苗生长影响

采用种子发芽试验测定BASWS和BtR05增效混合剂量对花生种子萌发及幼苗生长影响。具体方法是在培养皿内铺上一层滤纸为发芽床，25 ℃培养，每处理100粒种子，适时补充蒸发的水分，3次重复。每天观察发芽情况，当胚根突破种皮，长度为种长一半时计为发芽种子。7 ｄ后测定幼苗长度，计算发芽率、发芽指数和活力指数。结果见表4。

表4 BASWS和BtR05的增效混合剂量对花生种子萌发及幼苗生长影响

。

由表4可知，BASWS和BtR05增效混合剂量对花生种子的发芽率，发芽指数和活力指数均与花生慢生根瘤菌BASWS处理相当，差异不显著。与清水对照比。活力指数及幼苗的芽长和根长均高于水对照，表明BASWS和BtR05的增效混合剂量对花生种子萌发及幼苗生长影响有促进作用。

实施例2

花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05的增效混合剂量制剂

一种复合根瘤菌剂，包括按重量比的以下成分：

草炭土75.7～87.62%

钼酸铵0.5～1.0%

花生秧粉0.5～2.0%

γ-聚谷氨酸0.05～0.5%

蔗糖0.2～1.0%

碳酸钙0.1～0.5%

有机硅0.03～0.3%

花生慢生根瘤菌BASWS1.0～4.0%

苏云金芽孢杆菌BtR0510.0～15.0%。

制备与应用

本发明以草炭土为载体，钼酸铵、花生秧粉、γ-聚谷氨酸、蔗糖、碳酸钙、有机硅为增效助剂，将花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05发酵液制成粉剂，有效菌数为（花生慢生根瘤菌BASWS1～4亿/g，苏云金芽孢杆菌BtR05 6亿/g）

菌剂制备方法：将发酵好的菌液用无菌注射器注入装有草炭土（500g）的塑料袋中，按比例注入花生慢生根瘤菌BASWS 和苏云金芽孢杆菌BtR05，添加0.5～1%钼酸铵，0.5～2%花生秧粉，0.05～0.5%γ-聚谷氨酸，0.2～1%蔗糖，0.1～0.5%碳酸钙，0.03～0.3%有机硅。

小区田间试验条件及方法

试验概况：试验在济南市山东省科学院生物中心试验田进行。土壤肥力中等，小区栽培条件、水肥管理均一致。花生品种为山花11号，春播地膜覆盖，播种期4 月28 日，播种10000 穴／ 667m2，每穴播双粒。

供试药剂：本发明的花生慢生根瘤菌BASWS-苏云金芽孢杆菌BtR05混合粉剂（自制）；

对照药剂：3%辛硫磷颗粒剂，山东瑞丰生物化工有限公司

试验设计：花生慢生根瘤菌BASWS粉剂、苏云金芽孢杆菌BtR05粉剂、花生慢生根瘤菌BASWS-苏云金芽孢杆菌BtR05混合粉剂8kg/667m² 3个处理，3 次重复，小区面积50m²，随机排列。施药分两次进行，即播种时随种子穴施1次，开花前期穴施1次。以3%辛硫磷颗粒剂作药剂对照，不施药作空白对照。

调查方法：采取定点调查方法，试验前调查蛴螬基数，每小区均调查5点，每点连续5穴。7月初幼虫期和收获期分别调查田间蛴螬幼虫数量，计算防治效果。收获期每小区取5点，每点取5穴，查出虫果率，并称重折算出产量，计算增产率。

虫口减退率＝（处理前虫口数－处理后虫口数）/处理前虫口数×100％

防治效果＝（药剂处理区虫口减退率－对照区虫口减退率）/ (1－对照区虫口减退率）×100％

增产率＝（药剂处理区产量－对照区产量）/对照区产量×100％

对花生地下害虫蛴螬的防治及其对花生的增产作用（田间小区试验）具体如表5所示。

表5 花生慢生根瘤菌BASWS-苏云金芽孢杆菌BtR05混合粉剂对蛴螬的防治及对花生的增产效果

。

由表5可知，本制剂（BtR05+ BASWS）在8 kg /667m²的使用浓度，在花生幼果期对蛴螬的防效为97.5%，在收获期的防效为90.45%，对花生的增产率达到24.55%。该增产率是单用花生慢生根瘤菌BASWS增产率的2.56倍，是对照药剂3%辛硫磷颗粒剂的5.78倍。表明本制剂既能高效防治蛴螬，又能显著提高花生产量。

Claims

1.一种复合根瘤菌剂，其特征在于，包括花生慢生根瘤菌（Bradyrhizobium arachis）BASWS，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.9351，保藏日期是2014年6月16日;和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）BtR05，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是CGMCCNO.2823，保藏日期是2008年12月23日。

2. 根据权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂，其特征在于，花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效成分含量的比例为1:6～2:3。

3. 根据权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂，其特征在于，花生慢生根瘤菌BASWS和苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效成分含量的比例为2:3。

4. 根据权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂，其特征在于，花生慢生根瘤菌BASWS在该复合根瘤菌剂中的有效菌数为1～4亿/g。

5. 根据权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂，其特征在于，苏云金芽孢杆菌BtR05在该复合根瘤菌剂中的有效菌数为6亿/g。

6. 根据权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂，其特征在于，包括按重量比的以下成分：

草炭土75.7～87.62%

钼酸铵0.5～1.0%

花生秧粉0.5～2.0%

γ-聚谷氨酸0.05～0.5%

蔗糖0.2～1.0%

碳酸钙0.1～0.5%

有机硅0.03～0.3%

花生慢生根瘤菌BASWS 1.0～4.0%

苏云金芽孢杆菌BtR05 10.0～15.0%。

7. 如权利要求6所述的一种复合根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，

花生慢生根瘤菌BASWS培养基为YMA 培养基，包括以下成分：蔗糖10 g，酵母粉1 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，K₂HPO₄ 0.5 g，NaCl 0.1 g，CaCl₂0.05 g，0.5%钼酸钠溶液 4.0ml，0.5%硼酸溶液4.0ml，H₂O 1 000 mL，pH 6.8～7.0；

BtR05斜面及摇瓶培养基为LB；BtR05发酵培养基包括按重量比的以下成分：2%玉米粉，6%豆粉，1%蔗糖，0.5%(NH₄)₂SO₄，0.2% K₂HPO₄，0.2% KH₂PO₄，0.03% MgSO₄??7H₂O，pH7.0-7.5。

8.根据权利要求7所述的一种复合根瘤菌剂的制备方法，其特征在于，将发酵好的菌液用无菌注射器注入装有草炭土的塑料袋中，按比例注入花生慢生根瘤菌BASWS 和苏云金芽孢杆菌BtR05，添加钼酸铵，花生秧粉，γ-聚谷氨酸，蔗糖，碳酸钙，有机硅。

9. 如权利要求1所述的一种复合根瘤菌剂在防治花生地下害虫蛴螬和花生增产上的应用。