CN104101704A - 一种免疫层析试纸卡定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸卡定量检测方法，包括以下步骤：(1)将待测免疫层析试纸卡，放置在第一光源的检测光路中，获取第一图像数据矩阵Pic1；(2)将所述待测免疫层析试纸卡，放置在第二光源的检测光路中，获取第二图像数据矩阵Pic2；(3)选定基准区计算图像差分矩阵aPic(4)采用色谱峰检测算法计算特征值；(5)标定待测物浓度。本发明提供的免疫层析试纸卡定量检测方法，可以消除因光路光照不均、检测器镜头暗角等原因导致的基线偏移问题，同时能有效抑制阴影、杂质颗粒干扰物等带来的伪信号峰，从而提高色谱峰识别的准确率，增强免疫标记物色谱峰的信噪比，改善免疫层析试纸卡定量检测方法的准确性与灵敏度。

Description

一种免疫层析试纸卡定量检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体地，涉及一种免疫层析试纸卡定量检测方法。

背景技术

免疫层析试纸卡快速检测技术是一种简单、快速的现场快速检测方法，可在5～15分钟内完成一次免疫测试，在医学诊断、食品安全检测、环境监测等领域应用广泛。根据免疫标记物各类不同，目前有胶体金试纸卡、乳胶微粒层析卡、金磁复合微粒层析试纸卡等多种产品，其中以胶体金试纸卡的应用最为广泛。

为了实现对免疫层析试纸卡的定量检测，需要使用特定的光学检测设备，通过光源照射试纸卡，利用光敏元件采集反射光信号或者试纸卡的显色图像，获取检测线(T线)和质控线(C线)的信号，再根据相关数据计算得到待测物浓度，从而实现定量检测。

传统的免疫层析试纸卡光学检测方法，一般采用钨灯、白色LED等复合光源。此类连续光源获得的图像最接近肉眼观察的结果，但对免疫标记物没有选择性，导致图像数据对比度不高，灵敏度有限。采用与免疫标记物特征吸收波长相对应的单色光源，虽然可以增加检测物与背景的对比度，但因光照均匀度、样品杂质以及卡片阴影等因素导致的基线偏移、背景干扰及伪信号峰等问题依然会影响免疫层析试纸卡的定量检测。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种免疫层析试纸卡定量检测方法，其目的在于通过双光源检测及加权相减处理来消除干扰，由此解决免疫层析试纸卡定量检测中基线偏移、伪信号峰干扰以及信噪比偏低的技术问题。

为实现上述目的，提供了一种免疫层析试纸卡定量检测方法，包括以下步骤：

(1)获取特征图像：将检测线T线和质控线C线将出现在试纸卡观测窗中的待测免疫层析试纸卡，放置在第一光源的检测光路中，通过图像传感器获取第一图像数据矩阵Pic1；所述第一光源为试纸卡免疫标记物的特征吸收单色光源；

(2)获取对比图像：将所述待测免疫层析试纸卡，放置在第二光源的检测光路中，通过图像传感器获取第二图像数据矩阵Pic2；所述第二光源为试纸卡免疫标记物的非特征吸收光源；第二光源与第一光源产生光强的空间分布一致；

(3)计算图像差分矩阵ΔPic：其计算公式如下：

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

其中，Pic1和Pic2分别为步骤(1)和(2)中获取的第一图像数据矩阵和第二图像数据矩阵；RefB1和RefD1分别为第一图像亮场基准值和暗场基准值；RefB2和RefD2分别为第二图像亮场基准值和暗场基准值；亮场基准值为亮场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；暗场基准值为暗场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；

(4)计算特征值：在图像差分矩阵ΔPic中，选取待测免疫层析试纸卡中包含T线和C线的观测窗区域，通过色谱峰检测算法分别获得T线和C线的特征值TV和CV；

(5)标定待测物浓度：根据步骤(4)中获得的所述待测免疫层析试纸卡TV和CV值以及TV值、CV值或两者的商值与待测物含量Conc的标准曲线，标定所述待测免疫层析试纸卡所检测的待测物含量。

所述第一光源为特征吸收光源，优选地，第一光源所产生的单色光最大发射波长与免疫层析试纸卡标记物的最大特征吸收峰的峰值波长相同。

所述第二光源为非特征吸收光源。优选地，第二光源所产生的光为单色光或复合光，且第二光源在免疫标记物最大特征吸收峰的波长范围内没有发射光。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，其图像数据为图像中像素点的灰度值、亮度值、RBG值或相对光强值，优选为图像中像素点的灰度值。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，所述基准区是对不同波长光源不存在选择性吸收的固定区域；所述暗场基准区为其亮度低于试纸卡检测区域平均值的图像区域；所述亮场基准区为其亮度高于试纸卡检测区域平均值的图像区域。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，暗场基准区为试纸卡边框阴影图像区域或者标准黑块在相同条件下获取的图像区域。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，亮场基准区为暗场基准区附近的无阴影区或者标准白块在相同条件下成像获得的图像区域。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，步骤(4)所述特征值为色谱峰的峰高值、峰面积值或者峰体积值。

优选地，所述免疫层析试纸卡定量检测方法，TV和CV值与待测物含量Conc的标准曲线，按照如下方法获取：首先，用n个与所述待测免疫层析试纸卡相同的免疫层析试纸卡分别检测n种已知浓度的待测物溶液，n为2至10之间的自然数；然后，按照与所述待测免疫层析试纸卡相同的方式获得TV和CV值；最后，拟合得到TV值、CV值或两者的商值与待测物含量Conc的标准曲线。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于对于试纸卡观测窗内的C线、T线而言，免疫标记物对第一光源会有选择性强吸收；而对第二光源则正好相反，免疫标记物是弱吸收，因此通过图像的加权相减处理后得到的差分数据ΔPic中，T线和C线信号将得到加强。而对于标准色块、边框阴影、杂质颗粒等灰色、黑色干扰物以而言，由于对第一光源和第二光源都没有选择性吸收，在以选定的明暗基准区为依据经过加权相减运算后，这些干扰信号被抵消。而光源在物理空间上的不均匀性和图像传感器镜头的边缘暗角，也会在加权相减后被消除。因此，以选定的明暗基准区为依据对两幅图像进行加权相减处理后获得的差分数据进行定量，不仅可以消除因光路光照不均、检测器镜头暗角等原因导致的基线偏移问题，而且可以有效抑制阴影、杂质颗粒等干扰物带来的伪信号峰，从而提高色谱峰识别的准确率，增强免疫标记物色谱峰的信噪比，改善免疫层析试纸卡定量检测方法的准确性与灵敏度。

附图说明

图1是本发明提供的免疫层析试纸卡定量检测方法流程示意图；

图2是免疫层析试纸卡基准区选择示意图；

图3是实施例1光源结构示意图；

图4是实施例1检测光路结构示意图；

图5是实施例1图像数据，其中图5(A)是第一图像数据，图5(B)是第二图像数据；

图6是实施例1加权相减前后各测量值与像素点位置的曲线分布图；

图7是实施例2免疫层析试纸卡基准区选择示意图；

图8是实施例2加权相减前后各测量值与像素点位置的曲线分布图。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：1为待测的免疫层析试纸卡；2为光源板；3为一对紧密相邻焊接的LED光源；4为图像传感器；5是免疫层析试纸卡的观测窗口，测试线T和质控线C将出现在观测窗中；6是由边框阴影构成的基准区，其中观测窗边框形成的深色阴影部分作为暗场基准区，观测窗左侧的无阴影部分作为亮场基准区；7是由两个标准色块组成的基准区，黑色标准色块作为暗场基准，白色标准色块作为亮场基准。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供的免疫层析试纸卡定量检测方法，如图1所示，包括以下步骤：

(1)获取特征图像：将检测线T线和质控线C线将出现在试纸卡观测窗中的待测免疫层析试纸卡，放置在第一光源的检测光路中，通过图像传感器获取第一图像数据矩阵Pic1；所述第一光源为免疫层析试纸卡免疫标记物的特征吸收单色光源，优选地，第一光源所产生的单色光最大发射波长与免疫层析试纸卡标记物的最大特征吸收峰的峰值波长相同。；

所述免疫层析试纸卡，其特征在于试纸卡所采用的免疫标记物载体，可以是胶体金颗粒，也可以是彩色乳胶颗粒、金磁复合微粒等其它具有特征颜色吸收峰的载体材料。

所述图像传感器，位于免疫层析试纸卡观测窗中轴线的正上方，成像范围包含了整个试纸卡观测窗和基准区，用于在特定光源照射下获取免疫层析试纸卡的图像数据，它可以是线阵或面阵的固定式传感器阵列，也可以是带有机械运动部件的扫描式成像系统。线阵图像传感器获得的是一维矩阵数据，面阵图像传感器获得的是二维矩阵数据。二维矩阵数据可以通过对每列数据取算术平均值的方式转换成一维矩阵数据。

所述图像数据为图像中像素点的灰度值、亮度值、RBG值或相对光强值，优选为图像中像素点的灰度值。

(2)获取对比图像：将所述待测免疫层析试纸卡，放置在第二光源的检测光路中，通过图像传感器获取第二图像数据矩阵；所述第二光源为试纸卡免疫标记物的非特征吸收光源，优选地，第二光源在免疫标记物最大特征吸收峰的波长范围内没有发射光，且在光源最大发射波长处的免疫标记物吸光系数应尽可能小；第二光源和第一光源产生光强的空间分布一致；

(3)计算图像差分矩阵ΔPic：其计算公式如下：

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

其中，Pic1和Pic2分别为步骤(1)和(2)中获取的第一图像数据矩阵和第二图像数据矩阵；RefB1和RefD1分别为第一图像亮场基准值和暗场基准值；RefB2和RefD2分别为第二图像亮场基准值和暗场基准值；亮场基准值为亮场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；暗场基准值为暗场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；

基准区是在检测光路中人为指定的与T线、C线无关的一个固定区域，一般选择阴影、灰色或黑白色块等对光源波长变化不敏感的区域。基准区包括亮场基准区和暗场基准区两部分，如图2所示。暗场基准区为其灰度值高于试纸卡检测区域平均值的图像区域，可采用固定的深色阴影区或是黑色色块的图像区域；亮场基准区为其灰度值低于试纸卡检测区域平均值的图像区域，可采用暗场基准区附近的无阴影区或者标准白块在相同条件下成像获得的图像区域。基准区应避开免疫层析试纸卡观测窗中C线和T线，并尽量选择光照相对均匀的固定区域。基准区的位置一旦选定就不再更改。

设置基准区是为了使图像传感器在不同光源照射下所获得的检测信号具有可比性，消除不同光源下图像亮度、对比度等方面的差异，最大限度地降低背景干扰。亮场基准区的检测值RefB1、RefB2和暗场基准区的检测值RefD1、RefD2是对不同波长光照下获得的图像数据Pic1和Pic2进行加权相减的重要依据。

(4)计算特征值：在图像差分矩阵ΔPic中，选取待测免疫层析试纸卡包含T线和C线的观测窗区域，通过色谱峰检测算法分别获得T线和C线的特征值TV和CV；

采用色谱峰检测算法时，可通过对每列数据取算术平均值的方式将二维矩阵数据转换成一维矩阵数据后再进行数据处理来简化计算，以降低对微处理器速度和数据存贮器的要求。通过色谱峰检测算法，可对一维矩阵数据进行色谱峰识别、基线建立、峰面积和峰高等的测量等处理(《色谱定性与定量》，ISBN9787122011305)，分别获得T线和C线的定量数据TV和CV。特征值TV和CV通常是采用T线色谱峰峰高值和C线色谱峰峰高值，但也可以采用色谱峰峰面积值。

在微处理器性能和存贮空间不受限制的情况下，也可以直接采用二维矩阵数据进行色谱峰检测。此时特征值TV和CV可以是色谱峰高值，也可以是峰体积值。

(5)标定待测物浓度：根据步骤(4)中获得的所述待测免疫层析试纸卡TV和CV值以及TV值、CV值或两者的商值与待测物含量Conc的标准曲线，标定所述待测免疫层析试纸卡所检测的待测物含量。

所述TV、CV值与待测物含量Conc的标准曲线，按照如下方法获取：首先，用n个与所述待测免疫层析试纸卡相同的免疫层析试纸卡分别检测n种已知浓度的待测物溶液，n为2至10之间的自然数；然后，按照与所述待测免疫层析试纸卡相同的方式获得TV、CV值；最后，拟合得到TV值、CV值或两者的商值与待测物含量Conc的标准曲线。

以下为实施例：

实施例1

本实施例涉及一种胶体金免疫层析试纸卡的定量检测方法，所用的免疫层析纸卡是以胶体金颗粒作为免疫标记物载体。具体而言，本实施例是使用的是人绒毛膜促性腺激素(HCG)胶体金免疫层析试纸卡。向HCG免疫层析试纸卡加样孔中滴加150μL待测样品，静置层析10分钟得到待测免疫层析试纸卡,检测线T线和质控线C线将出现在试纸卡的观测窗中。样品中HCG含量越高，T线的颜色越深。

检测光路按照如下方法构建：

由于本实施例所用的胶体金颗粒在515～540nm波长范围内有唯一最大吸收峰(峰值波长525nm)，而在580nm以上波长无明显吸收，因此特征第一光源选用发光峰值在525nm的绿色LED单色光源，非特征第二光源选择发光峰值在595nm的橙色LED光源。光源板上均匀分布了八颗3216贴片封装的绿色LED和八颗3216贴片橙色LED，每一颗LED就是一个发光点。每一对绿色LED和橙色LED紧密相邻焊接，八对LED在光源电路板上以图像传感器为中心呈环形均匀分布，如图3所示。绿色LED和橙色LED可以在8051单片机的控制下独立开关。

图像传感器采用了OV7620CMOS面阵传感器，配合使用18mm CCTV镜头，最大可获取640×480像素的图像信息。在光源电路板中心有圆孔，以便光学镜头穿过。

光源板和图像传感器都被安装在一个固定支架上，在图像传感器正下方约8cm处设有一个定位槽用于固定试纸卡，保证每次测量时三者的相对位置都是固定不变的，如图4所示。光源和图像传感器的都在一个8051单片机系统的控制下协同工作。

胶体金免疫层析试纸卡的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)获取特征图像：将待测免疫层析试纸卡固定在检测光路中，打开第一光源后，通过图像传感器保存图像传感器中心位置231×27像素的图像矩阵灰度数据作为第一图像数据矩阵Pic1。

(2)获取对比图像：关闭第一光源，打开第二光源后，通过图像传感器保存图像传感器中心位置231×27像素的图像矩阵灰度数据作为第二图像数据矩阵Pic2。

Pic1和Pic2的检测数据经图形化显示如图5所示。将Pic1和Pic2的左上角的坐标定义为(0,0)，则去掉阴影部分后的观测窗对应的图像数据是由(20,0)、(205,0)、(205,26)以及(20,26)四点围成的矩形区域。

(3)计算图像差分矩阵ΔPic：其计算公式如下：

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

其中，Pic1和Pic2分别为步骤(1)和(2)中获取的第一图像数据矩阵和第二图像数据矩阵；RefB1和RefD1分别为第一图像亮场基准值和暗场基准值；RefB2和RefD2分别为第二图像亮场基准值和暗场基准值。

暗场基准值为暗场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；亮场基准值的为亮场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值。

由于胶体金试纸卡外壳具有一定厚度，每次光照时都会在边框边缘的固定位置形成一圈黑色阴影。在本实施例中，选择将胶体金试纸卡观测窗边框附近的阴影区域作为基准区，如图5中所示：将观测窗边框在光照下形成的深色阴影，即在Pic1和Pic2中的相对坐标为(7,0)、(9,0)、(9,26)以及(7,26)四点围成的矩形区域，定义为暗场基准区，该区域内81个象素点检测信号值的算术平均值即为RefD1和RefD2；将观测窗边框左侧的无阴影，即在Pic1和Pic2中的相对坐标为(0,0)、(2,0)、(2,26)以及(0,26)四点围成的矩形区域定义为亮场基准区，该区域内81个象素点检测信号值的算术平均值即为RefB1和RefB2。

(4)计算特征值：在图像差分矩阵ΔPic中，将包含所述待测免疫层析试纸卡T线和C线的观测窗区域，即相对坐标为(20,0)、(205,0)、(205,26)以及(20,26)四点围成的186×27的矩形区域内的数据提取出来，通过色谱峰检测算法分别获得T线和C线的特征值TV和CV。

在本实施例中，为简化计算，通过对观测窗区域中每列的27个数据点取算术平均值的方法，将186×27观测窗区域数据压缩成186×1的一维矩阵数据；根据色谱峰检测算法得到T线和C线的峰高值，即定量数据TV和CV：

TV＝35.6，CV＝24.3，其商TV/CV＝1.465。

(5)标定待测物浓度：根据步骤(4)中获得的所述待测免疫层析试纸卡TV、CV值及TV/CV值与HCG含量Conc的标准曲线，标定所述待测免疫层析试纸卡所检测的HCG含量为967IU/L。

所述TV/CV值与待测物含量Conc的标准曲线，按照如下方法获取：首先，用5个与所述待测免疫层析试纸卡相同的免疫层析试纸卡分别检测5种已知浓度的HCG溶液，HCG溶液浓度分别为1、10、100、500、5000IU/L；然后，按照与所述待测免疫层析试纸卡相同的方式获得TV、CV值；最后，采用对数拟合得到TV/CV值与待测物含量Conc(IU/L)的标准曲线：

TV/CV＝0.2114×ln(Conc)+0.0118。

为了进一步直观展示Pic1、Pic2和ΔPic的变化趋势，通过纵向列取算术平均值的方法，将231×27点阵的二维数据压缩为231×1的一维数据，绘制得到图6。图中：

Pic1`＝Pic1-RefB1

$\mathrm{Pic}2`=\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)=\mathrm{Pic}1`-\mathrm{Pic}2`$

从图6可以非常直观的看出，在加权相减后的ΔPic上，与光源无关的阴影峰被有效抑制，原始数据中因光源不均匀导致的基线倾斜与背景信号已基本消除，而T线与C线检测峰得到了最大限度的保留。相比原始数据，加权相减后的ΔPic基线平直且干扰峰少，有利于色谱峰检测算法中特征峰识别与峰高、峰面积的定量。

实施例2

本实施例涉及一种乳胶颗粒免疫层析试纸卡的定量检测方法，所用的免疫层析纸卡是以蓝色乳胶颗粒作为免疫标记物载体。具体而言，本实施例是使用的是氯霉素(CAP)免疫竞争层析试纸卡。向CAP免疫层析试纸卡加样孔中滴加150μL待测样品，静置层析15分钟得到待测免疫层析试纸卡,检测线T线和质控线C线将出现在试纸卡的观测窗中。样品中氯霉素含量越高，测试线T线的颜色越浅。

检测光路按照如下方法构建：

由于本实施例所用的蓝色乳胶颗粒在585～630nm波长范围内有唯一最大吸收峰(峰值波长607nm)，而在540nm以下波长无明显吸收，因此特征第一光源可选择红色LED单色光源，非特征第二光源可选择蓝色光源。市售的5050封装RGB三色LED在一个贴片元件中同时封装了红(615nm)、绿(540nm)、蓝(460nm)三种颜色的单色光，可以满足本实施例对光源的要求。在本实施例中，在光源板上均匀分布了十颗5050贴片LED芯片，每一个LED芯片就是一个发光点，可在数字逻辑电路控制下分别发出红、绿、蓝色光。由于采用了5050封装的三色LED光源，各色光源发光点的空间一致性更好。由于有RGB三种颜色可供自由选择，通过简单修改测量控制软件，本实施例很容易扩展成为一种能同时兼顾多种颜色载体试纸卡测量的通用型检测系统。

图像传感器采用了MT9T001型CMOS传感器，配合使用16mm CCTV镜头，最大可获取2048×1536像素的图像信息。在光源电路板中心有圆孔，以便光学镜头穿过。

光源板和图像传感器都被安装在一个固定支架上，在图像传感器正下方设有一个定位槽用于固定试纸卡，保证每次测量时三者的相对位置都是固定不变的。光源和图像传感器的都在一个STM32F407嵌入式系统的控制下协同工作。

蓝色乳胶颗粒免疫层析试纸卡的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)获取特征图像：将待测免疫层析试纸卡固定在检测光路中，打开第一光源后，通过图像传感器保存图像传感器中心位置1447×368像素的图像矩阵灰度数据作为第一图像数据矩阵Pic1。

Pic1的检测数据经图形化显示如图7所示。将图像左上角的坐标定义为(0,0)则去掉阴影部分后的观测窗对应的图像数据是由(485,170)、(700,170)、(700,215)以及(485,215)四点围成的矩形区域。

(2)获取对比图像：关闭第一光源，打开第二光源后，通过图像传感器保存图像传感器中心位置1447×368像素的图像矩阵灰度数据作为第二图像数据矩阵Pic2。

(3)计算图像差分矩阵ΔPic：其计算公式如下：

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

其中，Pic1和Pic2分别为步骤(1)和(2)中获取的第一图像数据矩阵和第二图像数据矩阵；RefB1和RefD1分别为第一图像亮场基准值和暗场基准值；RefB2和RefD2分别为第二图像亮场基准值和暗场基准值。暗场基准值为暗场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；亮场基准值的为亮场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值。

在本实施例中，在检测光路中预先固定了一黑一白两个标准色块作为基准区，如图5中深色虚线框所示：将黑色块，即在Pie和Pic2中的相对坐标为(1380,170)、(1425,170)、(1425,215)以及(1380,215)四点围成的矩形区域，定义为暗场基准区，该区域内2116个象素点检测信号值的算术平均值即为RefD1和RgfD2；将白色块，即在Pic1和Pic2中的相对坐标为(1300,170)、(1345,170)、(1345,215)以及(1300,215)四点围成的矩形区域定义为亮场基准区，该区域内2116个象素点检测信号值的算术平均值即为RefB1和RefB2。

(4)计算特征值：在图像差分矩阵ΔPic中，将包含所述待测免疫层析试纸卡T线和C线的观测窗区域，即相对坐标为(485,170)、(700,170)、(700,215)以及(485,215)四点围成的216×46的矩形区域内的数据提取出来，通过色谱峰检测算法分别获得T线和C线的特征值TV和CV。

通过对观测窗区域中每列的46个数据点取算术平均值的方法，将216×46观测窗区域数据压缩成216×1的一维矩阵数据；根据色谱峰检测算法得到T线和C线的峰面积值，即定量数据TV和CV。在本实施例中，只需要根据T线进行定量，因此将T线的峰面积值TV值作为特征值，CV值仅用于判断试纸卡是否失效，未用于定量计算。图7所示的试纸卡实测TV＝99.6。

(5)标定待测物浓度：根据步骤(4)中获得的所述待测免疫层析试纸卡TV值以及TV值与CAP含量Conc的标准曲线，标定所述待测免疫层析试纸卡所检测的CAP含量为0.4ng/mL。

所述TV值与待测物含量Conc的标准曲线，按照如下方法获取：首先，用3个与所述待测免疫层析试纸卡相同的免疫层析试纸卡分别检测3种已知浓度的CAP溶液，CAP溶液浓度分别为0、0.5、5ng/mL；然后，按照与所述待测免疫层析试纸卡相同的方式获得TV值；最后，采用分段线性拟合得到TV值与待测物含量Conc(ng/mL)的标准曲线：

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{Conc}=\frac{82.8-\mathrm{TV}}{14.2}(\mathrm{TV}\≤75.7)\\ \mathrm{Conc}=\frac{203.2-\mathrm{TV}}{255.0}(\mathrm{TV}>75.7)\end{array}\right.$

为了进一步直观展示Pic1、Pic2和ΔPic的变化趋势，通过纵向列取算术平均值的方法，将图7白色虚线框所示的300×46点阵二维数据压缩为300×1的一维数据，并绘制得到图8。图中：

Pic1`＝Pic1-RefB1

$\mathrm{Pic}2`=\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)=\mathrm{Pic}1`-\mathrm{Pic}2`$

从图8可以非常直观的看出，相比原始数据，加权相减后的ΔPic不仅可以削除阴影干扰峰、提高信噪比，而且有效抑制了T线和C线之间的黑色杂质颗粒造成的伪信号峰，提高色谱峰识别的准确率。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取特征图像：将检测线T线和质控线C线将出现在试纸卡观测窗中的待测免疫层析试纸卡，放置在第一光源的检测光路中，通过图像传感器获取第一图像数据矩阵Pic1；所述第一光源为免疫层析试纸卡免疫标记物的特征吸收单色光源；

(2)获取对比图像：将所述待测免疫层析试纸卡，放置在第二光源的检测光路中，通过图像传感器获取第二图像数据矩阵Pic2；所述第二光源为非特征吸收光源；第二光源与第一光源产生光强的空间分布一致；

(3)计算图像差分矩阵ΔPic：其计算公式如下：

$\mathrm{\ΔPic}=(\mathrm{Pic}1-\mathrm{RefB}1)-\frac{\mathrm{RefD}1-\mathrm{RefB}1}{\mathrm{RefD}2-\mathrm{RefB}2}\×(\mathrm{Pic}2-\mathrm{RefB}2)$

其中，Pic1和Pic2分别为步骤(1)和(2)中获取的第一图像数据矩阵和第二图像数据矩阵；RefB1和RefD1分别为第一图像亮场基准值和暗场基准值；RefB2和RefD2分别为第二图像亮场基准值和暗场基准值；亮场基准值为亮场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；暗场基准值为暗场基准区内所有像素点图像数据的算术平均值；

(4)计算特征值：在图像差分矩阵ΔPic中，选取待测免疫层析试纸卡包含T线和C线的观测窗区域，通过色谱峰检测算法分别获得T线和C线的特征值TV和CV；

(5)标定待测物浓度：根据步骤(4)中获得的所述待测免疫层析试纸卡TV和CV值以及TV值、CV值或两者商值与待测物含量Conc的标准曲线，标定所述待测免疫层析试纸卡所检测的待测物含量。

2.如权利要求1所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述第二光源所产生的光为单色光或复合光，为非特征吸收光源。

3.如权利要求1所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述图像数据，为图像中像素点的灰度值、亮度值、RGB值或相对光强值，优选为图像中像素点的灰度值。

4.如权利要求1所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述基准区是对不同波长光源没有选择性吸收的区域；所述暗场基准区为其灰度值高于试纸卡检测区域平均值的图像区域；所述亮场基准区为其灰度值低于试纸卡检测区域平均值的图像区域。

5.如权利要求4所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述暗场基准区为试纸卡边框阴影图像区域或者标准黑块在相同条件下获取的图像区域。

6.如权利要求4所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述亮场基准区为暗场基准区附近的无阴影区或者标准白块在相同条件下成像获得的图像区域。

7.如权利要求1所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，步骤(4)所述特征值为色谱峰的峰高值、峰面积值或者峰体积值。

8.如权利要求1所述的免疫层析试纸卡定量检测方法，其特征在于，所述TV、CV值与待测物含量Conc的标准曲线，按照如下方法获取：首先，用n个与所述待测免疫层析试纸卡相同的免疫层析试纸卡分别检测n种已知浓度的待测物溶液，n为2至10之间的自然数；然后，按照与所述待测免疫层析试纸卡相同的方式获得TV、CV值；最后，拟合得到TV值、CV值或两者的商值与待测物含量Conc的标准曲线。