CN104101587B - 一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，通过基频信号调制激发光源作用于待测标的物上，触发荧光，使荧光成周期性增强与衰减，再通过二倍频方波信号，控制采样周期，将荧光上升周期和衰减周期都一分为二，分别独立采样后计算两部分采样差值并相加得到荧光信号的强度表征值，得到待测标的物的浓度值。本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物的荧光干扰，还可以消除环境背景光、空间电磁波工频干扰等信号，提升检测样品荧光测量信号强度，具备常规时间分辨荧光方法无法完成的优势，可应用于生物、化学、医学等领域标的物的荧光强度检测。

Description

一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法

技术领域

本发明属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料的技术领域，特别涉及一种可以消除样品中底物的荧光干扰、消除环境背景光、消除空间电磁波工频干扰等信号以提升检测样品荧光测量信号强度、提高荧光检测精准度的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法。

背景技术

目前，免疫层析（lateral flow immunoassay, LFIA）快速检测试纸条多以胶体金或者荧光色素作为标记物。近年来免疫荧光检测领域在技术上取得突破，发展了时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence, TRF）免疫分析技术，此技术具有灵敏度高、特异性强、荧光寿命长、稳定性好和无放射性污染等特点，可以广泛应用于现场定量检测，是未来即时检测技术发展的重要方向。

时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence, TRF）免疫分析技术的具体操作过程是：在试纸条上的检测线（T）和质控线（C）区域进行荧光色素染色处理；将试纸条放入检测样品，当检测样品中含有能和荧光色素结合的检测标的物时，即能对样品的测量标的物进行荧光色素染色；然后利用激发光照射样品，激发荧光色素发出荧光，由最终的荧光的强度值分析出测量标的物的种类、浓度等信息。本技术要求在短时间根据荧光信息对测量标的物进行正确的分析。

然而，激发光照射激发出荧光的过程中，除了测量标的物发射的荧光，也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外，还包括两大类干扰荧光，干扰荧光包括环境背景荧光和杂质激发荧光。所谓环境背景荧光，包括有样品底液或试纸条本身的自发荧光、反射的波段较宽的荧光、检测系统的漏光及电磁干扰等；杂质激发荧光主要是由于样品中包含非测量标的物的物质，这类物质也可能会被激发光激发出荧光，只是这类荧光的激发和淬灭过程和测量标的物荧光过程不同。上述这些干扰荧光波段与荧光色素发出的荧光波段相重叠时，如果干扰荧光和荧光色素发出的荧光相比，强度极其微弱，则利用传统的时间分辨荧光检测方法可以测量出标的物的浓度信息，但是，当荧光色素所发出的荧光的强度不足够强时，则会严重影响测量分析的结果。

在传统的时间分辨荧光检测方法中，激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中，在荧光发射最大值时并不检测荧光，而是延迟200μs左右时间，等待杂质激发荧光淬灭，再开始检测荧光，从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响，以得到染色荧光色素所发出的荧光强度，从而获取测量标的物相对准确的信息。在此方法中，虽然能消除干扰物质激发荧光的影响，但是由于干扰物质具有不确定性，控制检测荧光延时也具有不确定性，故不能肯定完全消除所有干扰物质激发荧光，且上述方法并不能消除第一类环境背景光干扰，如背景自发荧光、检测系统漏光和电磁干扰等。

发明内容

本发明解决的技术问题是，现有技术中，激发光照射激发出荧光的过程中，除了测量标的物发射的荧光，也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外，还包括环境背景荧光和杂质激发荧光两大类干扰荧光，而导致的虽然在传统的时间分辨荧光检测方法中，可以在激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中，在荧光发射最大值的时间点延迟200μs左右时间，等待杂质激发荧光淬灭，再开始检测荧光，从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响，以得到染色荧光色素所发出的荧光强度，从而获取测量标的物相对准确的信息，但是由于干扰物质具有不确定性，控制检测荧光延时也具有不确定性，故不能肯定完全消除所有干扰物质激发荧光，且并不能消除第一类环境背景光干扰，如背景自发荧光、检测系统漏光和电磁干扰等的问题，进而提供了一种优化的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法。

本发明所采用的技术方案是，一种采用基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.1：采用基频信号发生器生成频率为X的规则波信号作为基频信号，所述频率为X的规则波信号调制激发光源，光源发射激发光，激发光作用于待测标的物上，触发荧光；

步骤1.2 ：控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样，得到采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i；i>0；30≤N≤80；

步骤1.3：将采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号滤波和AD转换，得到每个时刻的荧光强度信号A_i对应的每个时刻的荧光强度数字信号D_i；i>0；

步骤1.4：将每个时刻的荧光强度信号数字D_i根据采样时间作图得到光谱曲线；所述光谱曲线包括荧光发光周期S和荧光衰减周期R；

步骤1.5：对频率为X的基频信号进行倍频调制，产生频率为X’的倍频信号，X’=2X；根据倍频信号将荧光发光周期S分为时间相等的荧光发光周期S₁和荧光发光周期S₂，将荧光衰减周期R分为时间相等的荧光衰减周期R₁和荧光衰减周期R₂；

步骤1.6：对荧光发光周期S₁、S₂和荧光衰减周期R₁、R₂在光谱曲线上进行积分运算，得到荧光发光周期S₁的积分面积记为Φ1，荧光发光周期S₂的积分面积记为Φ2，荧光衰减周期R₁的积分面积记为Φ3，荧光衰减周期R₂的积分面积记为Φ4；Φ2＞Φ1>0，Φ3>Φ4>0；

步骤1.7：将荧光发光周期S₂的积分面积Φ2减去荧光发光周期S₁的积分面积Φ1，得到S’=Φ2-Φ1，S’记为荧光发光周期的荧光强度值；将荧光衰减周期R₁的积分面积Φ3减去荧光衰减周期R₂的积分面积Φ4，得到R’=Φ3-Φ4，R’记为荧光衰减周期的荧光强度值；将荧光发光周期的荧光强度值S’加上荧光衰减周期的荧光强度值R’，得到ΔΦ=Φ2-Φ1+Φ3-Φ4，记为荧光色素发射的荧光总强度值；S’>0，R’>0；

步骤1.8：荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ即表征待测标的物的荧光信号测量值，通过标定方法得到待测标的物浓度值。

优选地，所述步骤1.1中，采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号为方波信号。

优选地，所述步骤1.1中的激发光源通过双光源调制。

优选地，所述步骤1.2中，N=50。

优选地，所述步骤1.2中，光电传感器件设为光电二极管。

优选地，所述步骤1.3中的信号滤波和AD转换包括以下步骤：

步骤2.1：将以N倍于X的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号放大得到放大荧光强度信号A_i’；

步骤2.2：将放大荧光强度信号A_i’通过高通滤波模块进行滤波，滤除低频噪声和工频干扰；

步骤2.3：将滤波后的放大荧光强度信号A_i’通过模数转换模块进行转换，得到与所述采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号D_i。

优选地，所述步骤1.3中的滤波为中值滤波。

本发明提供了一种优化的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，通过基频信号调制激发光源作用于待测标的物上，触发荧光，使荧光成周期性增强与衰减，再通过二倍频方波信号，控制采样周期，将荧光上升周期和衰减周期都一分为二，分别独立采样后计算两部分采样差值并相加得到荧光信号的强度表征值，得到待测标的物的浓度值。本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物的荧光干扰，还可以消除环境背景光、空间电磁波工频干扰等信号，提升检测样品荧光测量信号强度，具备常规时间分辨荧光方法无法完成的优势，可应用于生物、化学、医学等领域标的物的荧光强度检测。

附图说明

图1为本发明中基频信号和倍频信号的示意图，其中A为基频信号，B为倍频信号；

图2为本发明中步骤1.6的对荧光发光周期S₁、S₂和荧光衰减周期R₁、R₂在光谱曲线上进行积分运算的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细描述，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明涉及一种采用基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.1：采用基频信号发生器生成频率为X的规则波信号作为基频信号，所述频率为X的规则波信号调制激发光源，光源发射激发光，激发光作用于待测标的物上，触发荧光；

步骤1.2 ：控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样，得到采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i；i>0；30≤N≤80；

步骤1.3：将采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号滤波和AD转换，得到每个时刻的荧光强度信号A_i对应的每个时刻的荧光强度数字信号D_i；i>0；

步骤1.4：将每个时刻的荧光强度信号数字D_i根据采样时间作图得到光谱曲线；所述光谱曲线包括荧光发光周期S和荧光衰减周期R；

步骤1.5：对频率为X的基频信号进行倍频调制，产生频率为X’的倍频信号，X’=2X；根据倍频信号将荧光发光周期S分为时间相等的荧光发光周期S₁和荧光发光周期S₂，将荧光衰减周期R分为时间相等的荧光衰减周期R₁和荧光衰减周期R₂；

步骤1.6：对荧光发光周期S₁、S₂和荧光衰减周期R₁、R₂在光谱曲线上进行积分运算，得到荧光发光周期S₁的积分面积记为Φ1，荧光发光周期S₂的积分面积记为Φ2，荧光衰减周期R₁的积分面积记为Φ3，荧光衰减周期R₂的积分面积记为Φ4；Φ2＞Φ1>0，Φ3>Φ4>0；

步骤1.7：将荧光发光周期S₂的积分面积Φ2减去荧光发光周期S₁的积分面积Φ1，得到S’=Φ2-Φ1，S’记为荧光发光周期的荧光强度值；将荧光衰减周期R₁的积分面积Φ3减去荧光衰减周期R₂的积分面积Φ4，得到R’=Φ3-Φ4，R’记为荧光衰减周期的荧光强度值；将荧光发光周期的荧光强度值S’加上荧光衰减周期的荧光强度值R’，得到ΔΦ=Φ2-Φ1+Φ3-Φ4，记为荧光色素发射的荧光总强度值；S’>0，R’>0；

步骤1.8：荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ即表征待测标的物的荧光信号测量值，通过标定方法得到待测标的物浓度值。

本发明提供的方法中，测量标的物通过激发光照射而发出荧光，并对得到的荧光信号进行处理，能够迅速且容易的求出荧光强度值，继而通过标定方法得到标的物浓度值。

本发明中，步骤1.1采用如图1所示的频率为X的基频信号A，完成了控制激发光源并对待测标的物的触发荧光的作业，步骤1.2则是利用N倍于X的频率控制采样动作对被触发的荧光进行采样，其优势在于由于频率较大，可以获得不失真的荧光发光和衰减过程中的荧光强度光谱曲线。步骤1.3是数模转化的过程，并同时完成了采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i的信号解调及滤波，保证去除由于表面粗糙、有背景干扰物等原因会发生的荧光的抖动。步骤1.4中，当每个时刻的荧光强度信号A_i转化为每个时刻的荧光强度信号数字D_i后，实则是每个时刻的电压值，即代表每个时刻的光强，可以用于制作基于荧光检测时间周期和荧光强度数值的光谱曲线，并根据光谱曲线进行积分得到光谱积分曲线，此时曲线有明显的上升段和下降段，光谱曲线的上升段为荧光发光周期S，光谱曲线的下降段为荧光衰减周期R。步骤1.5中，采用如图1所示的频率为2X的倍频信号B进行倍频调制，将荧光发光周期S分为时间相等的两部分，荧光衰减周期R分为时间相等的两部分，并在步骤1.6中对荧光发光周期S的时间相等的两部分和荧光衰减周期R时间相等的两部分在光谱曲线上进行积分运算，得到荧光发光周期S的两部分的积分面积和荧光衰减周期R的两部分的积分面积，荧光发光周期S₁的积分面积记为Φ1，荧光发光周期S₂的积分面积记为Φ2，荧光衰减周期R₁的积分面积记为Φ3，荧光衰减周期R₂的积分面积记为Φ4，如图2所示。在步骤1.7中，将荧光发光周期S的两部分积分面积相减，得到荧光发光周期的荧光强度值Φ2-Φ1，将荧光衰减周期R的两部分积分面积相减，得到荧光衰减周期的荧光强度值Φ3-Φ4，此时的荧光发光周期的荧光强度值和荧光衰减周期的荧光强度值已经消除了同样处于荧光发光周期或荧光衰减周期的样品底物的荧光干扰，亦消除了同样处于荧光发光周期或荧光衰减周期的环境背景光、空间电磁波工频干扰等信号的干扰，且由于采用的荧光发光周期和荧光衰减周期的积分面积分别时间相等，故只需要各减一次即能得到荧光发光周期内的荧光实际强度值和荧光衰减周期内的荧光实际强度值，最后将其相加，得到荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ=Φ2-Φ1+Φ3-Φ4，简便易操作。步骤1.8将荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ通过标定方法，最后得到待测标的物浓度值，完成待测标的物浓度的检测。

本发明采用的方法不仅可以消除待测标的物中底物的荧光干扰，还可以消除环境背景光、空间电磁波工频干扰等信号，提升了待测标的物荧光测量信号强度，更为安全可靠，可行性强，可操作性强，具有常规时间分辨荧光的方法无法具备的优势。

本发明中，设置激发光源按一定频率X开关，使触发荧光成周期性增强与衰减，从而实现控制待测标的物的荧光发射周期和衰减周期的目的。

本发明中，激发光可以为普通光源，如发光二极管，亦可以设置为激光。

本发明中，激发光源的频率X是根据荧光激发物质的激发波长决定的，不同的待测标的物，其激发波长不相同。

本发明中，步骤1.8的标定方法包括以下步骤：

步骤3.1：利用标准浓度样本进行荧光激发；

步骤3.2：测量出标准浓度样本对应的光强值；

步骤3.3：通过分段线性插值对光强值进行换算，得到不同的荧光强度值对应的标的物浓度值；

步骤3.4：对应查询，从荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ对应得到待测标的物的荧光信号测量值。

本发明中，采用标定方法来确定荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ对应的待测标的物的荧光信号测量值，一则是为了使用标准的计量方式对所检测的荧光信号测量值的精度进行检测是否符合标准，适用于精密度较高的测量，二则亦适用于校准，保证荧光信号测量值的精准。

所述步骤1.1中，采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号为方波信号。

本发明中，将采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号设置为方波信号，因为理想的方波是在高和低两个值之间是瞬时变化的，本发明采用方波来作为基频信号并在后续的步骤中利用基频信号产生同为方波信号的倍频信号，整体数据处理更为简便，亦更能直观的显示本发明中涉及到的光谱曲线。

所述步骤1.1中的激发光源通过双光源调制。

本发明中，采用双光源调制激发光源，保证了激发光源的稳定性，使得其在被激发过程中能稳定统一的作用在待测标的物上，触发荧光。

本发明中，不同波长激发光源采用的激发光颜色不同。

本发明中，由于步骤1.1中的激发光源通过双光源调制，故光学检测模块一般设置为双光源反射式的光学检测模块，涉及双共轭结构的光路设计，在实际工作过程中，一般以高稳定性的LED为激发光源，并以光电传感器件检测当前扫描位置的荧光光强，将信息传输回控制电路进行分析处理，最终得到待测标的物的浓度数据。

本发明中，一般采用LED完成激发光源的作业，因LED具有光谱带宽窄，温度系数低，散射角度小等优点。

所述步骤1.2中，N=50。

本发明中，将步骤1.2中控制光电传感器件的对被触发的荧光进行采样N倍于X的频率设置为N为50，一般情况下，N为50时的采样频率可以较好的采样到各点信号，又不会由于采样过于密集导致光谱曲线的失真。

所述步骤1.2中，光电传感器件设为光电二极管。

本发明中，光电传感器件是常用的采用光电元件作为检测元件的传感器，其能将光信号的变化借助光电元件将光信号转换成电信号。本发明中，只要能将光信号转换成电信号的光电传感器件在步骤1.2中均适用。一般情况下，采用光电二极管即能满足发明需求。

所述步骤1.3中的信号滤波和AD转换包括以下步骤：

步骤2.1：将以N倍于X的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号放大得到放大荧光强度信号A_i’；

步骤2.2：将放大荧光强度信号A_i’通过高通滤波模块进行滤波，滤除低频噪声和工频干扰；

步骤2.3：将滤波后的放大荧光强度信号A_i’通过模数转换模块进行转换，得到与所述采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号D_i。

本发明中，信号解调中需要将光源的光信号调制至频率X并转化成有效的电压信号，然后通过放大采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i并通过高通滤波模块，滤除低频噪声和工频干扰，滤除噪声和干扰后，利用频率为X的基频信号和频率为X’的倍频信号进行同步的解调，最后将解调后的结果送入模数转换模块进行转换，得到对应荧光光强的数字信号D_i。

本发明中，模数转换模块可以用过高精度、低噪声的24位Σ-Δ型AD转换芯片来完成。

本发明中，由于由光电传感器件扫描采样的结果仍存在一定的干扰信号，故步骤1.3中将采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号滤波和AD转换，得到每个时刻的荧光强度信号A_i对应的每个时刻的荧光强度数字信号D_i，一般情况下，设置控制电路，满足光电传感器件将扫描采样的信息反馈给CPU，并通过光电信号IV转换模块将光源的光信号调制至一定频率并转化成有效的电压信号，然后通过信号放大滤波模块滤除低频噪声和工频干扰并最后通过AD转换模块荧光强度信号由模拟信号转换成数字信号，得到转换为数字信号的荧光强度并进行后续的分析计算，最终得到待测标的物的实际浓度值。

所述步骤1.3中的滤波为中值滤波。

本发明中，中值滤波是基于排序统计理论的一种能有效抑制噪声的非线性信号处理技术，其基本原理是把数字图像或数字序列中一点的值用该点的一个邻域中各点值的中值代替，让周围的像素值接近的真实值，从而消除孤立的噪声点，其优点在于能保护边缘信息,是经典的平滑噪声的方法。

本发明中，基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法可以通过设置相关的设备来完成，设备可以由本领域技术人员在本发明的方法基础上设置。一般情况下，在设备的壳体内设置光学检测机构和控制电路，设有待测标的物的试纸条自壳体的试纸条插入口插入，控制电路控制光学检测模块对试纸条上的待测标的物的荧光强度进行检测、扫描采样，采集荧光层析试纸条上控制线（C）与测量线（T）的荧光标记物发射光强，记录光谱采样信息曲线并显示，由控制电路对荧光强度进行分析，得到标的物的浓度。

本发明中，可以通过选择基于时间分辨荧光技术的层析试纸条，加入不同浓度的检测样品，待试纸条完全干燥之后多次检测其控制线（C）、测量线信号（T），考察其T/C值的稳定性，由于荧光漂白效果，C线、T线绝对光强都会衰减，而T/C值保持相对稳定，能达到0.5％的检测灵敏度指标。

本发明解决了现有技术中，激发光照射激发出荧光的过程中，除了测量标的物发射的荧光，也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外，还包括环境背景荧光和杂质激发荧光两大类干扰荧光，而导致的虽然在传统的时间分辨荧光检测方法中，可以在激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中，在荧光发射最大值的时间点延迟200μs左右时间，等待杂质激发荧光淬灭，再开始检测荧光，从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响，以得到染色荧光色素所发出的荧光强度，从而获取测量标的物相对准确的信息，但是由于干扰物质具有不确定性，控制检测荧光延时也具有不确定性，故不能肯定完全消除所有干扰物质激发荧光，且并不能消除第一类环境背景光干扰，如背景自发荧光、检测系统漏光和电磁干扰等的问题，通过基频信号调制激发光源作用于待测标的物上，触发荧光，使荧光成周期性增强与衰减，再通过二倍频方波信号，控制采样周期，将荧光上升周期和衰减周期都一分为二，分别独立采样后计算两部分采样差值并相加得到荧光信号的强度表征值，得到待测标的物的浓度值。本发明的方法不仅同样可以消除样品中底物的荧光干扰，还可以消除环境背景光、空间电磁波工频干扰等信号，提升检测样品荧光测量信号强度，具备常规时间分辨荧光方法无法完成的优势，可应用于生物、化学、医学等领域标的物的荧光强度检测。

Claims (7)

1.一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

步骤1.1：采用基频信号发生器生成频率为X的规则波信号作为基频信号，所述频率为X的规则波信号调制激发光源，光源发射激发光，激发光作用于待测标的物上，触发荧光；

步骤1.2：控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样，得到采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i；i>0；30≤N≤80；

步骤1.3：将采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号滤波和AD转换，得到每个时刻的荧光强度信号A_i对应的每个时刻的荧光强度数字信号D_i；i>0；

步骤1.4：将每个时刻的荧光强度信号数字D_i根据采样时间作图得到光谱曲线；所述光谱曲线包括荧光发光周期S和荧光衰减周期R；

步骤1.5：对频率为X的基频信号进行倍频调制，产生频率为X’的倍频信号，X’=2X；根据倍频信号将荧光发光周期S分为时间相等的荧光发光周期S₁和荧光发光周期S₂，将荧光衰减周期R分为时间相等的荧光衰减周期R₁和荧光衰减周期R₂；

步骤1.6：对荧光发光周期S₁、S₂和荧光衰减周期R₁、R₂在光谱曲线上进行积分运算，得到荧光发光周期S₁的积分面积记为Φ1，荧光发光周期S₂的积分面积记为Φ2，荧光衰减周期R₁的积分面积记为Φ3，荧光衰减周期R₂的积分面积记为Φ4；Φ2＞Φ1>0，Φ3>Φ4>0；

步骤1.7：将荧光发光周期S₂的积分面积Φ2减去荧光发光周期S₁的积分面积Φ1，得到S’=Φ2-Φ1，S’记为荧光发光周期的荧光强度值；将荧光衰减周期R₁的积分面积Φ3减去荧光衰减周期R₂的积分面积Φ4，得到R’=Φ3-Φ4，R’记为荧光衰减周期的荧光强度值；将荧光发光周期的荧光强度值S’加上荧光衰减周期的荧光强度值R’，得到ΔΦ=Φ2-Φ1+Φ3-Φ4，记为荧光色素发射的荧光总强度值；S’>0，R’>0；

步骤1.8：荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ即表征待测标的物的荧光信号测量值，通过标定方法得到待测标的物浓度值；

步骤1.8 的标定方法包括以下步骤：

步骤3.1：利用标准浓度样本进行荧光激发；

步骤3.2：测量出标准浓度样本对应的光强值；

步骤3.3：通过分段线性插值对光强值进行换算，得到不同的荧光强度值对应的标的物浓度值；

步骤3.4：对应查询，从荧光色素发射的荧光总强度值ΔΦ对应得到待测标的物的荧光信号测量值。

2.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.1中，采用基频信号发生器生成的频率为X的规则波信号为方波信号。

3.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.1中的激发光源通过双光源调制。

4.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.2中，N=50。

5.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.2中，光电传感器件设为光电二极管。

6.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.3中的信号滤波和AD转换包括以下步骤：

步骤2.1：将以N倍于X的采样频率采样到的每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号放大得到放大荧光强度信号A_i’；

步骤2.2：将放大荧光强度信号A_i’通过高通滤波模块进行滤波，滤除低频噪声和工频干扰；

步骤2.3：将滤波后的放大荧光强度信号A_i’通过模数转换模块进行转换，得到与所述采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i对应的采样周期中每个时刻的荧光强度数字信号D_i。

7.根据权利要求1所述的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，其特征在于：所述步骤1.3中的滤波为中值滤波。