CN104099358B - 一种脂肪酸产量提高的重组蓝藻、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂肪酸产量提高的重组蓝藻，其中乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)被同时过表达。本发明还公开了制备所述重组蓝藻的方法和利用所述重组蓝藻生产生物柴油的方法。上述技术改造的脂肪酸含量提高的转基因藻株可以用于工业二氧化碳吸收、废水净化和生物质能源生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种脂肪酸产量提高的重组蓝藻、其制备方法及其应用。
背景技术
目前全球正面临能源危机和环境问题的双重挑战，绿色环保型可再生能源的开发利用成为各国追逐的焦点。利用光合微藻生产的生物柴油具备与柴油、石油相近的性能，可部分替代化石能源成为工业及交通运输所需的燃料。大多数微藻光合效率高，繁殖快，可调控及易于其他工程技术集成等优点，同时微藻生长固定大量CO2，是实现经济和环境和谐发展一举两得的途径。
蓝藻，又称蓝细菌，是一种可以进行光合作用的原核微生物，可以直接利用太阳能、二氧化碳和水生长，具有生长速度快、光合作用效率高等优点。因此，蓝藻作为一种基因工程的模式宿主微生物，在生物能源领域具有广泛的应用前景。周杰等向色球藻科蓝藻中导入丁醇合成相关基因，利用重组蓝藻将CO2转化为清洁能源丁醇。Melis Anastasios等人向蓝藻Synechocystis sp.中引入包含异戊二烯合酶的核酸表达盒从而生产异戊二烯。
中国专利申请号200810239558公开了一种重组蓝藻；而中国专利申请号200780024683使用经遗传工程改造的微观藻类、蓝细菌或细菌生产短链挥发烃类。现有技术中提及的这些转基因藻株大多用于清洁能源生产，如丁醇、异戊二烯，均为向目的藻细胞导入产物合成基因，实现蓝藻从无到有产生目的产物。
利用基因工程和转基因技术提高蓝藻脂肪酸的生物合成，主要涉及脂合成代谢的相关酶系，主要包括柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰辅酶A-ACP转酰基酶、丙二酸单酰辅酶A-ACP转酰基酶、酮酰基-ACP合成酶、酮酰基-ACP还原酶、脱水酶、烯脂酰-ACP还原酶、去饱和酶、酰基转移酶、磷脂酸磷酸酶等。然而，由于脂合成代谢涉及的基因众多并且各代谢途径之间的复杂相互作用，所以无法预期过量表达其中的一个或多个基因是否将会影响蓝藻的正常生长，更不能预测到必然可以提高蓝藻脂肪酸的生物合成。
发明内容
本发明的发明构思：合理选择、组合相关的关键酶，并构建高效的基因表达结构是成功获得脂肪酸高表达突变株的关键。①乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)催化乙酰辅酶A羧化成丙二酸单酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物。蓝藻中ACCase为异质型ACCase，包含4个亚基，即生物素羧化酶(biotincarboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)以及羧基转移酶的2个亚基α-CT和β-CT，其中前2个亚基组成BC和BCCP域，后2个亚基构成CT催化域。②磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphatase，PAP)催化磷脂酸脱磷酸生成二酰基甘油。磷脂酸是二酰基型甘油酯的生物合成前体，PAP存在于细菌到高等动植物的所有生物中。PAP是生物合成脂类途径中的关键酶，通过这一途径将脂肪酸储存在合成的磷脂、糖脂等脂类当中。本专利中使用蓝藻中原有的ACCase基因，对其四个不同亚基进行了排列组合，利用同一启动子驱动使各基因转录翻译效率基本一致，提高ACCase不同亚基的组装效率。本专利中也创造性引入PAP基因，加速二酰基甘油合成速度，从而使脂肪酸更快储存在磷脂、糖脂中。磷脂酸磷酸酶参与反应将脂肪酸储存在磷脂等脂类中。增强乙酰辅酶A羧化酶和磷脂酸磷酸酶基因的表达，可促进脂肪酸合成反应正向进行。
因此，在一个方面，本发明提供了一种质粒，其包含编码乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因和编码磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因。
在一个优选实施方案中，在本发明的质粒中，所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)的表达位于同一启动子控制之下，优选所述启动子为光敏启动子。
在另一个优选实施方案中，在本发明的质粒中，编码所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的乙酰辅酶A羧化酶基因AccA、AccB、AccC和AccD与编码所述磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因PAP顺序串联在同一个表达盒上。
在一个更优选的实施方案中，所述质粒为PsbA2AccABCD-PAP-T1T2-aadA。
另一方面，本发明提供一种重组蓝藻，其可由上述的任何质粒转化得到，其中乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)被同时过表达。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种重组蓝藻，其中乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和磷脂酸磷酸酶(PAP)的表达位于同一启动子控制之下，优选所述启动子为光敏启动子，更优选编码所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的乙酰辅酶A羧化酶基因AccA、AccB、AccC和AccD与编码所述磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因PAP顺序串联在同一个表达盒上。
在另一个优选实施方案中，本发明提供一种重组蓝藻，其中编码所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因和编码所述磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因通过同源重组被整合到所述蓝藻的基因组中，优选编码所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因和编码所述磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因是内源性或外源性ACCase基因和PAP基因，更优选是内源性ACCase基因和PAP基因。
在一个优选实施方案中，本发明的重组蓝藻包含PsbA2AccABCD-PAP-T1T2-aadA的DNA序列。
在另一个优选实施方案中，所述的重组蓝藻是保藏号为CGMCC No.6447的ENN81-1。
在还有的另一方面，本发明提供一种制备上述的任何重组蓝藻的方法，所述方法包括：将额外拷贝的编码所述乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的基因和编码所述磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。
在还有的另一个方面，本发明提供一种生产脂肪酸的方法，所述方法包括：
1)按照本发明的方法，制备根据本发明的重组蓝藻；
2)培养根据以上步骤1)获得的重组蓝藻，并回收藻粉；
3)从以上步骤2)获得的藻粉中提取脂肪酸。
在还有的另一个方面，本发明提供根据本发明的重组蓝藻、根据本发明的方法制备的重组蓝藻或根据本发明的质粒在生产脂肪酸中的用途。
更具体地，本发明提供一种提高蓝藻脂肪酸含量的方法，其步骤如下：
1)PCR克隆相关基因PsbA2、AccA、AccB、AccC、AccD、PAP和T1T2，将各基因按顺序依次连接到载体pUC19，形成载体PsbA2ABCD。PCR抗性基因aadA，酶切后连接至PsbA2ABCD，最终得到载体PsbA2AccABCD-PAP-T1T2-aadA；PsbA2序列含有光敏感启动子，可随着光强的增加，增强外源基因的转录效率，同时该序列也可作为同源臂，将外源基因定向整合到蓝藻基因组中。T1T2是双终止子序列，能有效终止转录反应。
2)将载体转化蓝藻细胞，利用壮观霉素抗性平板筛选转化克隆；
3)转化藻株均质化，基因水平鉴定；
4)优良转基因藻株室内评价；
5)转基因突变株藻粉脂肪酸含量分析。
本发明通过将乙酰辅酶A羧化酶基因AccABCD和PAP顺序串联在同一个表达盒，由高效的光敏启动子PsbA2调控，构建高效基因表达质粒，协同表达AccA、AccB、AccC、AccD和PAP基因，进而构建了基因工程藻株ENN81-1。
通过利用本专利中乙酰辅酶A羧化酶ABCD基因和PAP基因组合及排列方式，加快了蓝藻细胞中脂肪酸合成速度，最终提高藻粉中脂肪酸含量。该基因组合和排列方式亦可用于真核藻类脂代谢基因工程改造。
可以利用本发明保护的基因工程藻株ENN81-1，进行环境或工业生产中二氧化碳吸收，生物质能源生产。
附图简述
图1.微藻脂肪酸合成代谢图；
图2.蓝藻基因组整合质粒图谱；
图3.脂肪酸合成增强型蓝藻构建流程；
图4.质粒PsbA2ACCABCD；
图5.ENN81-1总DNAPCR鉴定结果；
图6.野生型藻株和转基因突变株ENN81-1室内养殖生长曲线；
图7.转基因藻株脂肪酸含量提高比例。
序列表
SEQ ID NO.1：载体PsbA2AccABCD-PAP-T1T2-aadA的全序列；
SEQ ID NO.2：PsbA2上游同源臂序列；
SEQ ID NO.3：AccA基因序列；
SEQ ID NO.4：AccB基因序列；
SEQ ID NO.5：AccC基因序列；
SEQ ID NO.6：AccD基因序列；
SEQ ID NO.7：PAP基因序列；
SEQ ID NO.8：T1T2序列；
SEQ ID NO.9：aadA基因序列；
SEQ ID NO.10：PsbA2下游同源臂。
具体实施方式
以下实施例主要是用于进一步说明本发明，而不是限制本发明的范围。
实施例1 构建基因组整合质粒平台
提取Synechocystis sp.基因组DNA(提取方法参考：黄晓丹等(2006).高质量植物基因组DNA的提取.植物生理学通讯.)，以其为模板，通过PCR，克隆Synechocystis sp.相关基因PsbA2(GenBank Accession No.BA000022.2)、AccA(GenBank AccessionNo.AP012278.1)、AccB(GenBank Accession No.AP012277.1)、AccC(GenBank AccessionNo.AP012276.1)、AccD(GenBank Accession No.AP012205.1)、和PAP(GenBank AccessionNo.AP012495.1)。以大肠杆菌DNA为模板，PCR相关DNA片段T1T2(GenBank AccessionNo.AB598835.1)。DNA抗药性筛选标记aadA(GenBank Accession No.JQ974028.1)片段来自已有的相载体质粒pCDFDuet-1 Vector(购自Novagen)的PCR产物。通过酶切，获得带有相关粘性末端的所需各基因DNA片段。以上使用的引物序列如下：
PsbA2：
PsbA2-F(gctgcagagcgttccagtggatat)，PsbA2-R(cgaattcgatcgccttggcaaaacaac)
AccA：
AccA-F(taaccatatgagtaaaagtgagcgtcgt)，AccA-R(agctcttacaccgccgtttct)
AccB：
AccB-F(taattcgtggctattaactttacggaac)，AccB-R(aattctagggtttaatccacattag)
AccC：
AccC-F(tgggccaatgcaattcgccaaaatt)，AccC-R(tagactagggtgttaaatgctcttcga)
AccD：
AccD-F(aatatgtctctatttgattggttt)，AccD-R(gatctttaaccatcttgattgacgga)
PAP：
PAP-F(caaatggccctatgcttaaaaattgtca)，PAP-R(ctagcttactgagattttaaatagac)
aadA；
aadA-F(gcgtatgcgctcacgcaactggtc)，aadA-R(gacattatttgccgactaccttggt)。
通过载体构建将AccA与AccB连接形成带有AccA-B的质粒，将AccC与AccD连接形成带有AccC-D的质粒，进而连接AccA-B与AccC-D片段形成带有DNA片段AccA-B-C-D的质粒。将PCR产物PsbA2克隆到中质粒Puc19中，形成Puc19-PsbA2质粒，通过PCR方法获得PsbA2(5’端)-Puc19-PsbA2(3’端)，与DNA片段AccA-B-C-D连接，获得包含两个PsbA2同源臂与ACC四个亚基的质粒pPsbA2AccABCD(质粒图谱见图4)。
利用内切酶将pPsbA2AccABCD质粒AccD与PsbA2(3’端)之间切开，与带有相关粘性末端的PAP基因片段、T1T1终止子DNA片段和addA筛选标记DNA片段混合，用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，利用壮观霉素进行筛选，获得转化菌株，带有所构建质粒PsbA2AccABCD-PAP-T1T2-aadA(图2)。将质粒提取纯化后，DNA测序验证，证明所构建质粒DNA序列正确。
实施例2：转化子的获得
通过同源重组，将ACC与PAP整合到蓝藻基因组DNA上，并使之表达(每条染色体含至少1个ACC和PAP拷贝)。
转化：收集处于对数生长期的蓝藻细胞，调整藻液浓度OD730＝0.8，将质粒pPsbA2ACCABCD-PAP-T1T2-aadA(2-5ug/ml)加入到蓝藻培养液中混匀，光照下静置培养3小时，摇床震荡培养三小时。
筛选：在含有壮观霉素的固体BG11培养基平板上筛选重组子，壮观霉素筛选浓度为8.5ug/ml。经多次传代选择均质化转化子，将筛选到的重组子命名为ENN81-1。
基因水平鉴定：设计引物accpap-F、accpap-R，使扩增片段包含AccABCD四亚基基因和PAP基因；提取蓝藻ENN81-1总DNA；分别以accpap-F(TAGTCAGTTCCAATCTGAACATCGAC)、accpap-R(CACCAAGATAAATTTGCCAACGG)为引物，进行PCR扩增。结果如图1所示，在ENN81-1中用引物accpap-F、accpap-R扩增到特异性条带，与目标产物大小(4728bp)相符，经DNA测序为正确序列，表明ENN81-1含有目的基因片段ACC和PAP。(图4中，泳道1为DNA Maker-Takara100-6000，泳道2为ENN81-1，泳道3为对照组Synechocystis sp.野生型藻株)。
发明人已将所述Synechocystis sp.转化藻株ENN81-1于2012年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，简称CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.6447。
实施例3：转化子ENN81-1的室内养殖和脂肪酸含量测定
将处在对数生长期的蓝藻藻株ENN81-1接种在配制好的BG11培养基(配方见表1)中，使细胞密度达到OD730为0.8。培养过程光照强度控制在50-200umol/m2.s，在培养期内，通过向培养液中通入1.5-2％的二氧化碳和空气的混合气体，将培养基的pH值调节在7-9之间，温度调控在25-30℃范围内。培养所使用的反应器为40mm内径、长度600mm的柱式反应器。培养过程中，定时取样测定干重，结果见图5。培养进行到第10天，藻株生物量不再增长时，将藻液收集，通过离心获得藻泥，将藻泥进行真空冷冻干燥。
表1BG11培养基配方
| NaNO3 | 1.5g/l |
| K2HPO4·3H2O | 0.04g/l |
| MgSO4·7H2O | 0.075g/l |
| CaCl2·2H2O | 0.036g/l |
| citric acid | 0.006g/l |
| FeCl3·6H2O | 0.00315g/l |
| Na2EDTA·2H2O | 0.00436g/l |
| Na2CO3 | 0.02g/l |
| A5Trace element* | 1ml |
*A5Trace element的组成成分
加到1000ml去离子水中
| H3BO3 | 2.86g |
| MnCl2·H2O | 1.81g |
| ZnSO4·7H2O | 0.222g |
| CuSO4·5H2O | 0.079g |
| Na2MoO4·2H2O | 0.390g |
| Co(NO3)2·6H2O | 0.0494g |
干燥完成后，测定Synechocystis sp.野生型藻株油脂组分含量如下表2，测定ENN81-1油脂组分含量如下表3分析方法如下：
1)脂肪酸提取：
取50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml10％DMSO-Methanol溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚、正己烷4-8ml4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-Methanol、乙醚、正己烷)体积比例为1∶1∶1∶1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。
2)脂肪酸分析：
照上面方法进行提取后，用正己烷溶解，使用Agilent6820气相色谱仪进行气相色谱分析(色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，分流比：4∶1。分析方法：内标法(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)。
表2 气相色谱测定的Synechocystis sp.野生型藻株样品总脂组分表
表3 气相色谱测定的ENN81-1样品总脂组分表
利用本专利中ACC与PAP基因组合与排列方式构成的操纵子，可进行蓝藻、细菌、或真核藻类的脂肪酸代谢调控，提高目的藻株脂肪酸合成速度和总脂含量。
藻株ENN81-1，较Synechocystis sp.野生型藻株总脂肪酸含量提高比例为47.93％。
利用上述技术改造的脂肪酸含量提高的转基因藻株，用于工业二氧化碳吸收、废水净化和生物质能源生产。
利用上述转基因ENN81-1为出发藻株，进行进一步基因工程改造用于以上各应用领域。
Claims (8)
1.一种质粒，其包含编码乙酰辅酶A羧化酶ACCase的基因和编码磷脂酸磷酸酶PAP的基因；
其中所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase和磷脂酸磷酸酶PAP的表达位于同一启动子控制之下；
所述启动子为光敏启动子；
其中编码所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase的乙酰辅酶A羧化酶基因AccA、AccB、AccC和AccD与编码所述磷脂酸磷酸酶PAP的基因PAP顺序串联在同一个表达盒上。
2.根据权利要求1所述的质粒，所述质粒为pPsbA2-AccABCD-PAP-T1T2-aadA。
3.一种重组蓝藻，其由根据权利要求1或2所述的质粒转化得到，其中乙酰辅酶A羧化酶ACCase和磷脂酸磷酸酶PAP被同时过表达。
4.根据权利要求3所述的重组蓝藻，其包含pPsbA2-AccABCD-PAP-T1T2-aadA的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的重组蓝藻，其是保藏号为CGMCC No.6447的ENN81-1。
6.一种制备根据权利要求3-5中任一项所述的重组蓝藻的方法，所述方法包括：将额外拷贝的编码所述乙酰辅酶A羧化酶ACCase的基因和编码所述磷脂酸磷酸酶PAP的基因通过同源重组整合到蓝藻的基因组中。
7.一种生产脂肪酸的方法，所述方法包括：
1)按照权利要求6所述的方法，制备根据权利要求3-5中任一项所述的重组蓝藻；
2)培养根据以上步骤1)获得的重组蓝藻，并回收藻粉；
3)从以上步骤2)获得的藻粉中提取脂肪酸。
8.根据权利要求3-5中任一项所述的重组蓝藻、根据权利要求6所述的方法制备的重组蓝藻或根据权利要求1或2所述的质粒在生产脂肪酸中的用途。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |