CN104099255B - 菌根真菌菌剂及其在降解残留四环素类抗生素方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菌根真菌菌剂及其在降解残留四环素类抗生素方面的应用，该菌剂包括培养基质以及混于所述培养基质中的丛枝菌根真菌的孢子和/或菌丝。所述菌根真菌菌剂在降解残留四环素类抗生素方面的应用具体为在四环素类抗生素污染的土壤中接种上述菌根真菌菌剂，然后再在该土壤中播种宿主植物，从而构建四环素类抗生素污染的土壤修复体系。宿主植物生长90‑120天收获后测定土壤中四环素类抗生素的浓度，其降解率可达20‑60％。本发明方法为丛枝菌根真菌用于降解土壤中高浓度四环素类抗生素残留提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及污染土壤修复领域，具体而言，涉及一种菌根真菌菌剂及其在降解残留四环素类抗生素方面的应用。
背景技术
人类和畜禽大量使用的抗生素最终会进入环境，成为新型污染物和前沿研究课题。尤其是畜禽废物作为有机肥用于农业生产，可能造成土壤抗生素污染，危及农产品安全。据统计，美国每年动物养殖业中抗生素的用量约为11,000多吨，约占抗生素总用量的70％左右；欧共体每年养殖业中抗生素的消耗量已达5000多吨。我国每年也大约有成千上万吨的抗生素类药物作为饲料添加剂等被用于畜禽养殖业中。据报道2003年我国规模化养殖场畜禽粪便产生量达22.1亿吨，2010年全国畜禽粪便的排放量达45亿吨。四环素类抗生素是世界上使用量最大的一类抗生素，张树清等对我国7省、市、自治区的典型规模化养殖场畜禽粪便的主要成分分析结果表明，猪粪中土霉素平均含量为9.09mg/kg，最高达134.75mg/kg，四环素平均含量为5.22mg/kg，最高达78.57mg/kg，金霉素平均含量为3.57mg/kg，最高达121.78mg/kg。由于大多抗生素难于降解，导致抗生素在土壤中的大量累积，土壤中的抗生素可通过植物吸收进入食物链，影响人体健康。而且，抗生素类兽药极易诱导产生大量抗药菌，并可能诱导产生群落抗性(Pollution-Induced CommunityTolerance，PICT)，将对包括人类在内的生态系统健康产生深远影响。因此，土壤中抗生素的环境行为与相关修复技术已经成为当前环境科学研究的热点，引起了人们广泛的关注。
菌根是自然界中一种普遍的植物共生现象，它是土壤中的菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。菌根真菌是土壤中唯一直接在土壤和植物根系之间起钮带作用的微生物，植物-微生物联合可提高土壤有机污染物的修复效率。菌根作为成功的协同修复体系已被应用于重金属污染土壤的生物修复，近几年菌根生物技术在有机物污染土壤修复中的研究与应用也日益增加。然而，目前未见有关丛枝菌根真菌对于土壤中四环素类抗生素的降解作用和植物吸收的影响的报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种菌根真菌菌剂。
本发明的第二目的在于提供上述菌根真菌菌剂的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述菌根真菌菌剂在降解残留四环素类抗生素方面的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种菌根真菌菌剂，包括培养基质以及混于所述培养基质中的丛枝菌根真菌的孢子和/或菌丝；其中：所述培养基质为相同体积的沸石与河沙的混合物，所述丛枝菌根真菌为幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、扭形球囊霉(Glomustortuosum)中的一种或多种。
在上述菌剂中，作为一种优选实施方式，所述菌剂中含菌量为50-80个孢子/克菌剂。
上述菌根真菌菌剂的制备方法，先将灭菌后的培养基质装至盆中，再将丛枝菌根真菌菌种接种剂均匀平铺在所述培养基质上一薄层，然后再在所述菌种接种剂上覆盖2-4cm灭菌培养基质，浇水后播种高粱(Sorghum bicolor)种子或三叶草(Trifolium)种子，之后再覆盖0.5-1cm的灭菌培养基质，于温室中培养3-4个月后收获播种的高粱或三叶草的植物根系、菌丝和孢子与所述培养基质的混合物，即为所述菌根真菌菌剂。
在上述制备方法中，作为一种优选实施方式，所述温室培养的条件为：白天光照14-18h，白天温度23-27℃，夜间光照6-10h，夜间温度16-20℃，白天与夜间光照强度均为500-600μEm-2s-1；每周浇一次霍格兰氏Hoagland’s营养液，每次用量为30-100mL/盆，并人工适量浇水以使所述培养基质干湿交替；在播种的14、21天分别补施N肥，N肥总用量为每盆80-150mg。以上培养条件非常有利于丛枝菌根真菌的大量繁殖，从而可以提高本发明菌根真菌菌剂中的含菌量。
上述菌根真菌菌剂在降解土壤中残留四环素类抗生素方面的应用。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述应用的具体方法如下：在四环素类抗生素污染的土壤中接种上述菌根真菌菌剂，然后再在该土壤中播种宿主植物，从而构建四环素类抗生素污染的土壤修复体系。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述四环素类抗生素为土霉素、四环素和金霉素中的一种或多种。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述菌根真菌菌剂在所述四环素类抗生素污染的土壤中的用量为：每1.0kg土壤接种20-50g所述菌根真菌菌剂。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述四环素类抗生素污染的土壤中四环素类抗生素含量为1-50mg/kg。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述宿主植物为玉米(Zea mays)或苜蓿(Erba medica)。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，播种完的所述宿主植物生长90-120天后收获。更优选地，所述宿主植物在同一片土壤中播种2个以上生长季，这样对土壤中四环素类抗生素的降解效果或者说对土壤的修复效果更好。
本发明的有益效果：
1)本发明利用丛枝菌根-植物的互惠共生体，种植在高浓度四环素类抗生素污染土壤中，可达到降低土壤中四环素类抗生素的残留量的效果。土壤中菌丝体的形成，可以改善土壤的结构及增强土壤微生物活性，菌丝体的生成扩大了植物的根际范围，产生新的植物/土壤界面，增加了植物根与土壤的接触面积。菌根的存在增加了土壤微生物的活性。上述这些作用可以直接或间接改变土壤中四环素类抗生素的降解、传输和植物吸收，可以有效降低土壤中高浓度四环素类抗生素的残留。并且具有修复效果好、操作简单、处理量大等特点，为土壤中四环素类抗生素的修复提供了有效的方法。
2)本发明菌剂对于四环素类抗生素浓度为1-50mg/kg的土壤降解效果较好，降解率在20-60％之间，解决了现有技术的缺陷。
因此，本发明的利用丛枝菌根-植物降低土壤中高浓度四环素类抗生素的方法，可为开发菌根生物技术修复抗生素污染土壤提供科学依据和指导。
附图说明
图1为接种幼套球囊霉后土壤中残留土霉素的降解效果图；
图2为接种幼套球囊霉后土壤中残留四环素的降解效果图；
图3为接种幼套球囊霉后土壤中残留金霉素的降解效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将采用实施例的方式对本发明进行详细说明。
本发明中所述降解率的计算方法均为：
实施例1菌根真菌菌剂的制备
本发明中使用的丛枝菌根菌剂即菌根真菌菌剂是通过将菌种接种剂在温室扩繁制得的，其中所述菌种接种剂(幼套球囊霉(XJ03C)、摩西球囊霉(NM03D)、扭形球囊霉(NM03A))均购自“中国丛枝菌根真菌种质资源库”，菌剂具体制备方法如下：
扩繁培养在温室中进行，温室中条件为：在控制环境的生长室中进行，白天光照16h左右，温度25℃左右，夜间光照8h左右，温度18℃左右，白天和夜间均采用Osram日光灯进行光照，的光照强度均为550μEm-2s-1左右。将灭菌后的培养基质(沸石:河沙＝1:1，体积比)装至塑料盆2/3处，将菌种接种剂均匀平铺在基质上一薄层，再覆盖灭菌培养基质2cm，浇水适量，播种高粱种子25粒左右，再覆盖0.5cm灭菌基质，然后培养3个月后收获所有培养物，包括植物根系、菌丝和孢子与培养基质，即为本发明菌根真菌菌剂，其由培养基质以及混于所述培养基质中的丛枝菌根真菌的孢子和/或菌丝组成，本实施例制备的幼套球囊霉菌剂中含菌量约为80个孢子/克菌剂；摩西球囊霉菌剂中含菌量约为70孢子/克菌剂；扭形球囊霉含菌量约为50孢子/克菌剂。
实施例2幼套球囊霉对土霉素污染土壤中不同初始浓度土霉素的降解效果实验
将土霉素初始含量为1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg的土霉素污染土壤1.0kg分别装在不同的花盆里，并分别混入实施例1制备的幼套球囊霉菌剂30g，同时设置不接种任何菌剂的对照处理，四种处理方式中每个处理设置3个平行样，调节土壤含水量为最大田间持水量的60％，静置过夜，将苜蓿或玉米种子用10wt％H2O2消毒和催芽后，播种于已接种幼套球囊霉菌剂的土壤中，玉米每盆播3粒，苜蓿每盆播9粒，分别播种于不同盆中，出苗后3天进行间苗，每盆留2株玉米，7株苜蓿；然后按照普通农作物的管理方式管理，90天以后采集土壤和宿主植物样品进行分析测定，评价降解效果，具体测定方法参见马丽丽等(郭昌胜,胡伟,沙健,朱兴旺,阮悦斐,王玉秋,固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素,分析化学,2010,38(1):21-26)在固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素中记载的方法，降解效果参见图1。
从图1中可以看出，经过90天的培养，土霉素含量为10mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到51.6％。
实施例3摩西球囊霉对土霉素污染土壤中不同初始浓度土霉素的降解效果实验
将土霉素初始含量为1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg的土霉素污染土壤1.0kg分别装在不同的花盆里，并分别混入实施例1制备的摩西球囊霉菌剂30g，同时设置不接种任何菌剂的对照处理，四种处理方式中每个处理设置3个平行样，调节土壤含水量为最大田间持水量的60％，静置过夜，将苜蓿或玉米种子用10wt％H2O2消毒和催芽后，播种于已接种摩西球囊霉菌剂的土壤中，玉米每盆播3粒，苜蓿每盆播9粒，分别播种于不同盆中，出苗后3天进行间苗，每盆留2株玉米，7株苜蓿。然后按照普通农作物的管理方式管理，90天以后采集土壤和玉米等植物样品进行分析测定，评价降解效果，测定方法同实施例2。
结果表明，经过90天的培养，土霉素含量为10mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到46.7％；土霉素含量为1mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到31.7％；土霉素含量为50mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到22.5％。
实施例4扭形球囊霉对土霉素污染土壤中不同初始浓度土霉素的降解效果实验
将土霉素初始含量为1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg的土霉素污染土壤1.0kg分别装在不同的花盆里，混入实施例1制备的扭形球囊霉菌剂30g，同时设置不接种任何菌剂的对照处理，四种处理方式中每个处理设置3个平行样，调节土壤含水量为最大田间持水量的60％，静置过夜，将苜蓿或玉米种子用10wt％H2O2消毒和催芽后，播种于已接种扭形球囊霉菌剂的土壤中，玉米每盆播3粒，苜蓿每盆播9粒，分别播种于不同盆中，出苗后3天进行间苗，每盆留2株玉米，7株苜蓿。然后按照普通农作物的管理方式管理，90天以后采集土壤和玉米等植物样品进行分析测定，评价降解效果，测定方法同实施例2。
结果表明，经过90天的培养，土霉素含量为10mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到37.4％；土霉素含量为1mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到29.2％；土霉素含量为50mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中土霉素的降解率可达到21.6％。
实施例5幼套球囊霉对四环素污染土壤中不同初始浓度四环素的降解效果实验
将四环素初始含量为1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg的四环素污染土壤1.0kg分别装在不同的花盆里，并分别混入实施例1制备的幼套球囊霉菌剂30g，同时设置不接种任何菌剂的对照处理，四种处理方式中每个处理设置3个平行样，调节土壤含水量为最大田间持水量的60％，静置过夜，将苜蓿或玉米种子用10wt％H2O2消毒和催芽后，播种于已接种幼套球囊霉菌剂的土壤中，玉米每盆播3粒，苜蓿每盆播9粒，分别播种于不同盆中，出苗后3天进行间苗，每盆留2株玉米，7株苜蓿；然后按照普通农作物的管理方式管理，90天以后采集土壤和宿主植物样品进行分析测定，评价降解效果，测定方法同实施例2，降解效果参见图2。
从图2中可以看出，经过90天的培养，四环素含量为10mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中四环素的降解率可达到48.7％。
实施例6幼套球囊霉对金霉素污染土壤中不同初始浓度金霉素的降解效果实验
将金霉素初始含量为1mg/kg、10mg/kg、50mg/kg的金霉素污染土壤1.0kg分别装在不同的花盆里，并分别混入实施例1制备的幼套球囊霉菌剂30g，同时设置不接种任何菌剂的对照处理，四种处理方式中每个处理设置3个平行样，调节土壤含水量为最大田间持水量的60％，静置过夜，将苜蓿或玉米种子用10wt％H2O2消毒和催芽后，播种于已接种幼套球囊霉菌剂的土壤中，玉米每盆播3粒，苜蓿每盆播9粒，分别播种于不同盆中，出苗后3天进行间苗，每盆留2株玉米，7株苜蓿；然后按照普通农作物的管理方式管理，90天以后采集土壤和宿主植物样品进行分析测定，评价降解效果，测定方法同实施例2，降解效果参见图3。
从图3中可以看出，经过90天的培养，金霉素含量为10mg/kg的污染土壤中经上述菌剂处理后植物根际土壤中金霉素的降解率可达到24.7％。
Claims (10)
1.一种菌根真菌菌剂在降解土壤中残留四环素类抗生素方面的应用，其特征在于，所述菌根真菌菌剂包括培养基质以及混于所述培养基质中的丛枝菌根真菌的孢子和/或菌丝；其中：所述培养基质为相同体积的沸石与河沙的混合物，所述丛枝菌根真菌为幼套球囊霉(Glomus etunicatum)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)、扭形球囊霉(Glomus tortuosum)中的一种或多种；所述菌根真菌菌剂的制备方法如下：先将灭菌后的培养基质装至盆中，再将丛枝菌根真菌菌种接种剂均匀平铺在所述培养基质上一薄层，然后再在所述菌种接种剂上覆盖2-4cm灭菌培养基质，浇水后播种高粱种子或三叶草种子，之后再覆盖0.5-1cm的灭菌培养基质，于温室中培养3-4个月后收获播种的高粱或三叶草的植物根系、菌丝和孢子与所述培养基质的混合物，即为所述菌根真菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌根真菌菌剂中含菌量为50-80个孢子/克菌剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述菌根真菌菌剂的制备方法中，所述温室培养的条件为：白天光照14-18h，白天温度23-27℃，夜间光照6-10h，夜间温度16-20℃，白天与夜间的光照强度均为500-600μEm-2s-1；每周浇一次霍格兰氏Hoagland’s营养液，每次用量为30-100mL/盆，并人工适量浇水以使基质干湿交替；在播种的14、21天分别补施N肥，N肥总用量为每盆80-150mg。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法如下：在四环素类抗生素污染的土壤中接种上述菌根真菌菌剂，然后再在该土壤中播种宿主植物，从而构建四环素类抗生素污染的土壤修复体系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述宿主植物为玉米或苜蓿。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素为土霉素、四环素和金霉素中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述菌根真菌菌剂在所述四环素类抗生素污染的土壤中的用量为：每1.0kg土壤接种20-50g所述菌根真菌菌剂。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述四环素类抗生素污染的土壤中四环素类抗生素含量为1-50mg/kg。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，播种完的所述宿主植物生长90-120天后收获。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述宿主植物在同一片土壤中播种2个以上生长季。
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