CN104095862A

CN104095862A - 地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗内毒素血症和脓毒症的药物中的应用

Info

Publication number: CN104095862A
Application number: CN201410379496.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋王林; 亢泽春
Original assignee: Binzhou Medical College
Current assignee: Binzhou Medical College
Priority date: 2014-07-26
Filing date: 2014-07-26
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2034-07-26
Also published as: CN104095862B

Abstract

本发明提供了地瑞那韦乙醇盐的药物新用途，具体涉及地瑞那韦乙醇盐通过抑制高迁移率族蛋白B1(highmobility groupprotein，HMGB1)的表达从而抑制内毒素血症和脓毒症的发生发展，以致于预防或治疗内毒素血症和脓毒症。在上述应用中，其注射使用剂量范围是50mg～2000mg；优选50～1000mg；口服使用剂量范围是100mg～6000mg；优选200～3000mg。

Description

地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗内毒素血症和脓毒症的药物中的应用

技术领域

本发明涉及地瑞那韦乙醇盐抑制脓毒症的发生发展从而预防或治疗内毒素血症和脓毒症；具体涉及地瑞那韦乙醇盐通过抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)的表达，以致于预防或治疗内毒素血症和脓毒症。

背景技术

脓毒症(sepsis)，即脓毒血症。是一种由感染引起的临床综合征。化脓性病原菌侵入血流并在其中大量的繁殖，并随血流向全身扩散，在组织器官引起的新的多发性化脓性病灶。脓毒症常伴有下列征象：体温高于或低于正常，白细胞增多或减少、心动过速、呼吸急促或每分钟通气量异常升高，如临床上出现其中两项或两项以上症状，即可诊断脓毒血症；当伴发器官功能衰竭，即称为重症脓毒血症(severe sepsis)。美国每年有50万名脓毒血症患者，存活率仅55％～65％。

脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、大手术后常见的并发症，也是外科危重患者重要的死亡原因之一。目前研究认为HMGB-1在脓毒症中也起着关键作用[Wang H，Bloom O，Zhang M，Vishnubhakat JM，Ombrellino M，Che J.HMG-1as a late mediator of endotoxin lethalityin mice.Science1999，285(5425)：248-251；Andersson U，Tracey KJ.HMGB1in sepsis.Scand JInfect Dis2003，35(9)：577-584.]。

地瑞那韦乙醇盐(darunavir ethalolate，又称“达如那韦”，商品名prezista)适用于与小剂量利托那韦或其它抗HIV药合用治疗其它抗HIV药治疗无效的成人HIV感染，是一种新的HIV-1蛋白酶抑制药，其作用机制是选择性抑制感染细胞内的编码Gag-Pol多蛋白HIV卵裂，继而抑制形成成熟的病毒粒，但地瑞那韦乙醇盐在预防或治疗内毒素血症和脓毒症的药理作用未见报道。本发明人通过大量的研究发现地瑞那韦乙醇盐可以通过抑制脂多糖刺激的人腹腔巨噬细胞HMGB1的表达从而在预防或治疗内毒素血症和脓毒症有明显的作用。基于此，本发明人发明了地瑞那韦乙醇盐通过抑制巨噬细胞HMGB1的的表达从而抑制脓毒症的发生发展，以致于预防或治疗内毒素血症和脓毒症。

发明内容

本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗内毒素血症和脓毒症的药物中的应用。

本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在抑制内毒素血症和脓毒症中HMGB1的药物中的应用。

本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗内毒素血症的药物中的应用。

本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗脓毒症的药物中的应用。

发明提供的地瑞那韦乙醇盐在用于脓毒症时，其注射使用剂量范围是50mg～2000mg；优选50～1000mg；其口服使用剂量范围是100mg～6000mg；优选200～3000mg。

本发明还提供的地瑞那韦乙醇盐可以和药学上可接受的载体或辅料组成的药物，该药物可以以药学常规方法制备成注射液、冻干粉针、片剂、胶囊剂、薄膜包衣片，优选以冻干粉针和薄膜包衣片形式存在。

具体实施方式

实施例1地瑞那韦乙醇盐冻干粉针制备

取地瑞那韦乙醇盐50.0g，加注射用水2000ml使其溶解，加甘露醇8g，搅拌溶解，超滤，得到无热源的澄清液，灌入10ml西林瓶中，2ml/只，按冻干粉针工艺冻干，制成每支含地瑞那韦乙醇盐50.0mg的冻干粉针。

实施例2地瑞那韦乙醇盐薄膜包衣片制备

称取100.0g地瑞那韦乙醇盐、和100.0g羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加入适量的3％PVP_K30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60℃干燥3小时，18目筛整粒，加入2.0g硬脂酸镁，混合均匀后压片。制备包衣液，在不锈钢容器中加入纯水，后加入物料，持续搅拌，脱泡。包衣将压好的片子装入包衣锅中，预热后进行喷雾包衣，待喷雾结束后继包衣锅至片子干燥。将干燥的片子进行冷却，加入巴西棕搁蜡进行打光，片重约200mg。

具体实施例

试验例1地瑞那韦乙醇盐对脂多糖刺激的人腹腔巨噬细胞HMGB1表达的影响

1.1实验材料

DMEM培养基为Gibco公司产品，新生牛血清为杭州四季青公司产品

脂多糖(LPS)购自sigma公司，批号：20130412

人腹腔巨噬细胞株购自中国典型培养物保藏中心，用含10％胎牛血清(Hyclone公司)的低糖DMEM培养基(GIBCO公司)，常规培养于5％的CO₂，37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。HMGB1一抗购买于sigma公司。

地瑞那韦乙醇盐(纯度99.5％，购买于上海翰香生物科技有限公司)

1.2试验方法

当细胞生长融合至70％-80％，用无血清培养基饥饿24h，换新鲜培养液，将传代的人腹腔巨噬细胞分为：(1)阴性对照组；(2)LPS处理组(2μg/L作用时间24h)；(3)LPS处理组(2μg/L作用时间24h)+地瑞那韦乙醇盐0.3μM；(4)LPS处理组(2μg/L作用时间24h)+地瑞那韦乙醇盐1μM；(5)LPS处理组(2μg/L作用时间24h)+地瑞那韦乙醇盐3μM；(6)LPS处理组(2μg/L作用时间24h)+地瑞那韦乙醇盐10μM。培养的细胞进行裂解，BCA蛋白测定试剂盒(Pierce公司)测定蛋白浓度后，取50μg样品蛋白进行10％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶变性电泳、然后转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入HMGB1一抗，β-actin作内参，Western blot检测细胞HMGB1蛋白的表达。以LPS未刺激组作为对照，计为相应蛋白的100％，分析各浓度药物与单纯LPS刺激组对HMGB1蛋白的表达差异。组间进行T检验。

表1地瑞那韦乙醇盐对脂多糖刺激的人腹腔巨噬细胞HMGB1表达影响(n＝5)

^*，P＜0.05，^**，P＜0.01，与单纯LPS刺激组比较

表1结果可以看出，LPS刺激巨噬细胞24小时，HMGB1表达明显上升，而加地瑞那韦乙醇盐0.3-10μM后24小时，HMGB1表达明显下降。说明地瑞那韦乙醇盐可抑制巨噬细胞的HMGB1表达，减轻内毒素血症和脓毒症损伤。

试验例2地瑞那韦乙醇盐对盲肠结扎穿孔导致的脓毒症大鼠的影响

2.1药品与试剂

鲎试剂试剂盒(福建省福州新北生化工业有限公司，批号：130430)

High-mobility group-box 1 protein(HMGB1)ELISA试剂盒(上海西唐生物技术公司)

实验动物：SPF级Sprague Dawley大鼠，雄性，体重150g-200g，山东绿叶制药股份有限公司实验动物中心提供，动物合格证号为：SYXK(鲁)20030020。

2.2实验方法与结果

2.2.1盲肠结扎穿孔(CLP)大鼠的制备

大鼠手术当天清晨大鼠禁食，乙醚麻醉后取仰卧位，75％乙醇消毒腹部，沿腹白线中段作一长1.5em的切口，剪开皮肤和肌层，探查腹腔分离盲肠；1号丝线距盲端1cm处(回盲瓣远端)结扎，16号穿刺针在结扎处远端贯穿盲肠3次(呈三角形)，针孔间距约3mm，并挤出少许内容物；盲肠回纳腹腔，逐层缝合关闭腹腔。

2.2.2分组给药

CLP大鼠90只，随机分为6组，即模型组、地瑞那韦乙醇盐静脉注射5mg/kg、25mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、地瑞那韦乙醇盐灌胃给药10mg/kg、50mg/kg、300mg/kg、600mg/kg，另外取10只正常大鼠作为对照组。CLP手术1h各组给予相应药物。CLP手术20h取血，测定血清HMGB1和内毒素。血清HMGB定使用ELISA试剂盒，血清内毒使用素鲎试剂试剂盒测定。取血完毕，观察动物在144h内的存活情况，如果在144h内未死亡，存活时间记为144h。数据用表示，以组间t检验进行统计学处理。

2.2.3实验结果

表2地瑞那韦乙醇盐静脉注射对盲肠结扎穿孔导致的脓毒症大鼠的影响(n＝10)

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较

结果如表2所示，地瑞那韦乙醇盐静脉注射5mg/kg、25mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、地瑞那韦乙醇盐灌胃给药10mg/kg、50mg/kg、300mg/kg、600mg/kg组明显降低脓毒症大鼠血清HMGB1和内毒素水平，延长存活时间(p＜0.05或p＜0.01)。地瑞那韦乙醇盐静脉注射100mg/kg组降低脓毒症大鼠血清HMGB1和内毒素水平，延长存活时间与地瑞那韦乙醇盐静脉注射200mg/kg组比较无显著性差异；地瑞那韦乙醇盐灌胃给药300mg/kg组降低脓毒症大鼠血清HMGB1和内毒素水平，延长存活时间与地瑞那韦乙醇盐灌胃给药600mg/kg组比较无显著性差异。

实验3地瑞那韦乙醇盐对内毒素血症大鼠的影响

3.1材料

内毒素：sigma公司，批号：20130412

D-半乳糖胺(进口分装，5g/瓶，北京化学试剂公司，批号：120912)

2.2实验方法与结果

大鼠随机分为模型组、地瑞那韦乙醇盐静脉注射5mg/kg、25mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、地瑞那韦乙醇盐灌胃给药10mg/kg、50mg/kg、300mg/kg、600mg/kg，每组10只。实验前大鼠禁食16h，不禁水。实验时经尾静脉注射D-半乳糖胺(300mg/kg)，立即经胃内灌注内毒素(20mg/kg)进行造模，随即各组给药，模型组给予同体积的生理盐水，各组分别于造模后24h眼眶取血，同时取10只正常大鼠取血，测定血浆中内毒素水平。血浆内毒素测定用采用鲎试剂产色基质法，组间T检验，进行统计学处理。

表3地瑞那韦乙醇盐对内毒素血症大鼠血浆中内毒素水平影响(n＝10)

与模型组比较，^*p＜0.05；^**p＜0.01

表3试验结果表明地瑞那韦乙醇盐静脉注射5mg/kg、25mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、地瑞那韦乙醇盐灌胃给药10mg/kg、50mg/kg、300mg/kg、600mg/kg组能显著降低内毒素血症大鼠血浆中内毒素水平(与模型组比较，p＜0.05或p＜0.01)。地瑞那韦乙醇盐静脉注射100mg/kg组降低内毒素血症大鼠血清内毒素水平与地瑞那韦乙醇盐静脉注射200mg/kg组比较无显著性差异；地瑞那韦乙醇盐灌胃给药300mg/kg组降低内毒素血症大鼠血清内毒素水平，与地瑞那韦乙醇盐灌胃给药600mg/kg组比较无显著性差异。

Claims

1.本发明提供了地瑞那韦乙醇盐在制备预防或治疗内毒素血症和脓毒症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，地瑞那韦乙醇盐是通过抑制HMGB1表达达到预防或治疗内毒素血症和脓毒症。

3.根据权利要求2所述的应用，地瑞那韦乙醇盐可预防或治疗内毒素血症。

4.根据权利要求2所述的应用，地瑞那韦乙醇盐预防或治疗脓毒症。

5.根据权利要求3和4所述的应用，地瑞那韦乙醇盐用于内毒素血症和脓毒症时，其注射使用剂量范围是50mg～2000mg；优选50～1000mg；其口服使用剂量范围是100mg～6000mg；优选200～3000mg。

6.根据权利要求5所述的应用，地瑞那韦乙醇盐和药学上可接受的载体或辅料组成的药物，该药物可以以药学常规方法制备成注射液、冻干粉针、片剂、胶囊剂、薄膜包衣片，优选以冻干粉针和薄膜包衣片形式存在。