CN104093733A - 植物乳杆菌所分泌的具有免疫调节功能的肽 - Google Patents

植物乳杆菌所分泌的具有免疫调节功能的肽 Download PDF

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Abstract

在主要由植物乳杆菌物种所分泌的不到10种蛋白中，存在一个包含没有用于最重要的肠蛋白酶的切割位点的且以具有至少50％的丝氨酸和苏氨酸含量为特征的30kDa蛋白。在这个命名为ST肽的片段中所编码的遗传信息已经用于制造和纯化所述肽，从而使得进行各种体外测试成为可能。总之，所述ST肽被认为是促进了我们的胃肠道免疫系统对我们的胃肠道的共生细菌的免疫忽视的过程，从而支持口服耐受机制。因此，所述ST肽可以用于免疫治疗，特别是在某些自身免疫病和某些炎症性疾病的情况下。

Description

植物乳杆菌所分泌的具有免疫调节功能的肽
技术领域
本发明描述了乳杆菌所分泌的肽在人类免疫治疗中的用途，涉及食品技术领域和医药。它涉及氨基酸序列(ST肽)，所述氨基酸序列(ST肽)可以在某些炎症性疾病的免疫治疗中和口服耐受性受损(如在关于膳食麸质的乳糜泻的情况下)的其它病症中使用，所述炎症性疾病诸如为炎症性肠病(IBD；划分为克罗恩病、溃疡性结肠炎和贮袋炎(pouchitis))。给药途径可以是包含在功能性食品或通过捐赠者树突细胞的定向成熟(树突细胞疫苗)。
背景技术
人类胃肠道是一各种各样的共生体、共生生物和病原菌的所在地，并且恰恰是存在有细菌和免疫系统之间的一个主要接触点的地方。该细菌组(set)很大程度上促成了抗原组或饮食中的伴有抗原的外来物质,针对所述抗原组或伴有抗原的外来物质，在正常情况下,免疫系统将是为了消除它们而作出反应，如在系统免疫中所发生的一样。然而，在肠道区室(intestinalcompartment)这根本不会像这样发生，而是针对所述抗原部署了免疫耐受性机制，称为口服耐受，其目的是为了维持粘膜的内稳态(homeostasis)(Feng and Elson(2010)Adaptive immunity in host–microbiota dialog.Muc.Immunol.4,15-21)。在某些情况下会失去这种内稳态，且随着诸如炎症性肠病(IBD)等或多或少严重的炎症过程的发展，免疫系统反常地排斥肠道微生物群或饮食中的某些抗原(如在乳糜泻中的麸质的情况下)。此外，存在于某些自身免疫病和肠道微生物群的组成的失调(deregulation)之间的关系也是已知的(Adams等.(2008)IgG antibodies against common gut bacteriaare more diagnostic for Crohn's Disease than IgG against mannan or flagellin.Am.J.Gastroenterol.103,386-396)。
对肠道微生物群的耐受性的过程，在很大程度上是由并入在肠道粘膜的两种细胞类型调节的，所述两种细胞类型负责正确处理和识别源自肠道微生物群的抗原。这些是T淋巴细胞和树突细胞(DC)。DC是专门处理和递呈抗原的巨噬细胞；在为肠道DC的情况中，它们在识别存在于肠道中的微生物方面起着至关重要的作用，从而朝向管腔(lumen)伸出肠道上皮的肠上皮细胞(enterocyte)之间的伪足(Rescigno等，(2001)Dendriticcells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers tosample bacteria.Nat Immunol.2,361-367)。DCs吞噬细菌粒子并处理它们，经历称为成熟并在它们的表面上显示这些细菌的一系列的变化，以便它们能够被免疫系统的其它细胞识别。此外，该变化在DC中伴随着一系列的表型变异(phenotypic alteration)，诸如某些细胞因子的产生。DC接着(intheir turn)对于T淋巴细胞增殖和分化为Th1型效应细胞(诱导促炎应答)、Th2型效应细胞(诱导抗炎应答)或Th17型效应细胞(针对感染参与保护表面组织)，或者增殖和分化调控细胞(Treg)是至关重要的(Zhu and Pau(2008)CD4T cells:fates,functions,and faults.Blood112,1557–1569)。与DC互补，T淋巴细胞是负责细胞免疫应答的细胞。
一些属于细菌乳酸组的菌株被认为是益生菌，因为它们能够有利地调节肠道微生物群的组成，对人类健康具有有益的效果(Rijkers,G.T.等.(2010)Guidance for substantiating the evidence for beneficial effects of probiotics:current status and recommendations for future research.J.Nutr.140,671S-676S)。近年来，各种的研究小组一直在积累表明某些细胞外的成分可能会产生一些归因于益生菌的有益效果的科学证据。如果牢记在正常情况下，在健康的个体中，所述微生物群不直接与肠上皮细胞和/或DC层接触，这是更有意义的。事实上，微生物群嵌入在覆盖肠的上皮层的黏液的保护层中。因此，看似合理的是，这些益生菌的有益效果不是由于细菌与DC的直接的相互作用。相反，益生菌可能会通过产生可以穿过黏液层的某些成分来履行它们的功能，以便于DC捕获它们。在这些细胞外的成份中，我们可以提到胞外多糖(exopolysaccharides)、磷壁酸、吲哚以及表面和细胞外蛋白(Lebeer等.(2010)Host interactions of probiotic bacterialsurface molecules:comparison with commensals and pathogens.Nat.Rev.Microbiol.8,171-84)。后者被定义为在细菌生长过程中所分泌的并释放到它们周围的介质中的蛋白组(Sánchez等.(2008)Exported proteins inprobiotic bacteria:adhesion to intestinal surfaces,host immunomodulation andmolecular cross-talking with the host.FEMS Immunol.Med.Microbiol.54,1-17)。目前，所述细胞外蛋白构成了针对益生菌作用的分子机制的识别和表征的研究的活跃区。
细胞外蛋白可以分为两个主要的组。第一组包含具有位于N末端部分并引导前蛋白(pre-protein)至分泌机构(secretion machinery)的信号肽的那些蛋白，经由所述分泌机构所述前蛋白被分泌至所述介质。第二组包含除了信号肽之外还具有细胞表面结合域、并且在细菌壁更新的过程中释放到所述介质的那些蛋白。最后，一些作者识别了第三组细胞外蛋白，所述第三组细胞外蛋白包含没有分泌域的中央新陈代谢蛋白，因此，它们分泌到细胞外环境的机制尚不清楚。
用于分泌蛋白的系统在真细菌分区内是高度保守的。这些系统在革兰氏阴性菌中被很好地表征，在革兰氏阴性菌中至少7系统被识别(类型1-6和“成对的精氨酸”系统)(Sibbald and van Dijl(2009)Bacterial secretedproteins:secretory mechanisms and role in pathogenesis.Ed.Wooldridge,Caister Academic Press)。在革兰氏阳性菌中，包含大多数的益生菌菌株、细胞外蛋白的分类组将由类似的系统输出。
直到现在，生物信息学已经是用于识别益生菌中的细胞外蛋白的工具，且只有一小部分被很好得识别或实验地表征。在由双歧杆菌所产生的细胞外蛋白中，我们可以提到由不同种类的双歧杆菌所产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)(Turroni等，(2010)Characterization of the serpin-encodinggene of Bifidobacterium breve210B.Appl.Environ.Microbiol.76,3206-3219)。该蛋白有效地抑制由胰腺外分泌(exocrine pancreas)所分泌的弹性蛋白酶和炎症过程所涉及的中性粒细胞、免疫细胞所分泌的弹性蛋白酶。因为这个原因，已经推测丝氨酸蛋白酶抑制剂可能会产生一些双歧杆菌的抗炎效果。它也表明，短双歧杆菌菌株所分泌的蛋白可能能够产生很可能是小肽的可溶性因子，所述可溶性因子在与DC相互作用之后，将在肠道上皮水平上减少炎症过程(Heuvelin等.(2009)Mechanisms involvedin alleviation of intestinal inflammation by Bifidobacterium breve solublefactors.PLoS ONE.4:e5184)。
这些工作只是先天系统(innate system)的细菌和免疫细胞之间的胞间通讯过程是如何能够调节一系列生理应答的实例，所述一系列生理应答针对的是调控我们的肠粘膜的免疫性内稳态(immunologic homeostasis)，进而调控我们的身体的免疫性内稳态。如本发明中所描述的结果所显示，这个过程的一部分，可以由在主要蛋白内所编码的肽来调节，所述主要蛋白是存在于我们的胃肠道的乳酸菌所分泌的。
关于在数据库中可获得的类似的专利，我们可以提到涉及保护特定地结合至大肠癌细胞的一些组合物及其使用方法的专利EP95900421.9。该文献描述了其它ST肽的使用，在该情况下，由细菌大肠杆菌的菌株所产生的热稳定肠毒素的衍生物的序列并不对应于本发明中所描述的肽的序列。虽然该文献将“ST肽”定义为具有13到25个氨基酸的ST受体结合肽，但这些肽源自大肠杆菌并包含于共轭化合物(conjugated compounds)中，这些肽还包含一个放射稳定的(radiostable)活性残基且能够特异性地针对转移的大肠癌细胞。
另一方面，WO2009138092涉及植物乳杆菌的菌株299V，并强调了菌株植物乳杆菌(Lb.plantarum)DSM21379的益生菌性质，描述了其在功能食品和用于改善细胞免疫的医药产品的发展中的用途。所强调的微生物的功能包括诱导产生用于改善动物的免疫系统的细胞因子。虽然该文献描述了植物乳杆菌如何产生用于改善免疫系统的细胞因子，但所述细胞因子是促炎的(IL-6)。
因此目前需要识别来源于由乳酸菌所分泌的蛋白的ST肽，所述ST肽同时具有用于治疗与肠道微生物群的失调相关的疾病、炎症性疾病和/或口服耐受性受损的疾病的免疫调节和抗炎功能。
发明内容
本发明描述了ST肽的序列，所述ST肽在由乳酸菌所分泌的一个蛋白内编码，所述乳酸菌优选为植物乳杆菌(到目前为止还没有已知的功能)，所述30kDa的肽包含不具有用于最重要的肠蛋白酶的切割位点的片段。它的特征还在于，具有至少50％的丝氨酸和苏氨酸含量。如果使这种肽与获得自血液和人类的肠活组织标本(biopsies)的DC接触，它能够调节它们至调控表型(phenotype)，在该调控表型中，IL-12(抗原递呈细胞的促炎白细胞介素特性)的产生是受阻滞的，而IL-10(通过诸如T淋巴细胞等其它免疫细胞类型来阻滞促炎细胞因子的合成的抗炎细胞因子)的产生是增大的。这些用ST肽处理的DC也获得了不同的功能，因为它们刺激的T淋巴细胞获得优先针对具有非促炎细胞因子分布(profile)的皮肤的迁移分布。这种作用机制不是通过引发免疫耐受性的机制，而是通过引发免疫忽视(immunologic ignorance)的机制积极地对维持肠道内稳态作出贡献。因此，所述肠中的具有ST肽的成熟的DC促进效应细胞(T淋巴细胞)二次迁移至皮肤，从而阻碍了对胃肠道中的共生菌群(commensal flora)的主动的(active)免疫应答的建立。
总之，ST肽经由它对DC的作用促进了肠道内稳态的机制。由于它能够阻滞抗炎白细胞介素(IL-12)和增加抗炎白细胞介素(IL-10)的合成，ST肽可以用于某些炎症性和自身免疫性疾病的免疫治疗以及用于对其它抗原的口服耐受机制丧失的其它病症中，在所述某些炎症性和自身免疫性疾病中已知的是存在对肠道微生物群的异常免疫应答。这将为创建包含由益生菌所产生的那些分子的一系列的功能食品提供科学依据，所述功能食品对人体健康具有有益的作用。
附图说明
图1.变性条件下的蛋白凝胶显示了总蛋白和由3种植物乳杆菌菌株所分泌的蛋白。道1-3：菌株NCIMB8826、299v和BMCM12的总蛋白。道4：存在于培养基中的蛋白。道5-7：菌株NCIMB8826、299V和BMCM12所分泌的蛋白。MM：蛋白的分子量(kDa)的标记。
图2.A.富含丝氨酸和苏氨酸的区域，所述丝氨酸和苏氨酸存在于被识别为SEQ ID NO:2的蛋白D1的中央区域，所述中央区域在氨基酸位点70和135之间，且B.在本发明中所描述的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽的氨基酸序列。在SEQ ID NO:1中的画有下划线的氨基酸表示所述ST肽相对于被识别为SEQ ID NO:2的蛋白D1的中央区域的变化。
图3.在被识别为SEQ ID NO:2的蛋白D1的中央片段上的主要的肠蛋白酶的理论切割位点。如可以看到的(用箭头指示的)，片段ST不包含理论切割位点。A代表被识别为SEQ ID NO:3的在氨基酸位点61和120之间的蛋白D1的片段，且B代表被识别为SEQ ID NO:4的在氨基酸位点121和180之间的蛋白D1的片段。
图4.在变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶中纯化的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽的迁移。
图5.a)在来自人血的富集的树突细胞(LDC)中，迁移到肠粘膜(整合素β7)和皮肤(CLA)的标记的产生。测试条件为基线(不存在信号)、0.0、0.1、1.0或10微克/毫升的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽。b)用这种肽所进行的测试在来自人血的富集的树突细胞上，既不改变迁移到组织(β7和CLA)的标记也不改变II型MHC分子(HLA-DR)，也不改变某些协同刺激的分子(CD40)或活化的分子(CD83)。将用脂多糖(LPS)进行的刺激用作以促炎细菌成分进行的刺激的对照。
图6.在富集的树突细胞的细胞质中所测定的细胞因子的产生分布状况(profile)的改变，所述富集的树突细胞来自人血且是由不同浓度的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽所诱导的。将LPS进行的刺激用作以促炎细菌成分进行的刺激的对照。IL-6：白细胞介素6，TGFβ：转化生长因子β，IL-10：白细胞介素10，IL-12：白细胞介素12。
图7.在来自结肠粘膜活组织标本(肠道DC)的富集的树突细胞的细胞质中所测定的细胞因子IL-10和IL-12的产生分布状况(profile)的改变。
图8.从左到右，由流式细胞仪获得的图像表示(representations)代表用同种异体的树突细胞所刺激的T细胞的种群。左图(panel)：通过“前向角散射(forward side scatter)”技术检测活细胞。中央图：识别DC3标记。右图：通过用于源自细胞分裂的CFSE的染色的丧失，识别所刺激的T细胞。
图9.流式细胞仪示意图显示了在T细胞中所诱导的变化，所述T细胞是通过来自血液的富集树突细胞(LDC)来刺激的，所述富集的树突细胞暴露于被识别为SEQ ID NO:1的ST肽(LDC BP)或暴露于脂多糖(LPSLDC)。在所有情况下，与在静止的T细胞(静止的T细胞)中所产生的变化进行比较，并利用没受刺激的LDC(基底(basal)LDC)。A)由不同浓度的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽(BP LDC)和不同浓度的脂多糖(LPS LDC)所诱导的迁移至肠粘膜整合素β7的标记水平的变化。B)由不同浓度的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽(BP LDC)和不同浓度的脂多糖(LPS LDC)所诱导的迁移至皮肤CLA的标记水平的变化。C)3组独立实验结果的条形图表示。
图10.流式细胞仪的示意图显示了在T淋巴细胞中生成细胞因子IL-10、TGFβ、IFNγ和IL-17的变化，所述T淋巴细胞是通过来自血液的富集树突细胞(LDC)来刺激的，所述富集的树突细胞用不同浓度的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽(BP LDC)或脂多糖(LPS LDC)来致敏(pulse)。在所有情况下，与在静止的T细胞(静止的T细胞)中所产生的变化进行比较，并利用没受刺激的LDC(基底LDC)。
图11.图10中的数据的图形表示显示了3组独立实验的值和它们的偏差。
图12.流式细胞仪的示意图显示了在T淋巴细胞中的细胞因子TGFβ、IL-10、IL-17和IFNγ的产生的变化，所述T淋巴细胞由来自结肠活组织标本的富集的树突细胞(肠DC)来刺激，该富集的树突细胞未被刺激(基底肠DC)(中间图)或预先用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽致敏(肽肠DC)(底部图)。顶部图显示了在静止的T细胞中(静止的T细胞)相同的细胞因子的产生。
图13.流式细胞仪的示意图显示了在T淋巴细胞中的β7(肠粘膜)和CLA(上皮粘膜)迁移的标记的产生的变化，所述T淋巴细胞用来自结肠活组织标本的富集的树突细胞(肠DC)来刺激，该富集的树突细胞未被刺激(基底肠DC)(中间图)或预先用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽致敏(肽肠DC)(底部图)。顶部图显示了在静止的T细胞中(静止的T细胞)相同的迁移标记的产生。
图14.流式细胞仪的示意图代表了捐赠者中的IL-10和IL-12的产生，所述捐赠者的结肠粘膜的树突细胞显示了IL-12的异常产生。在被识别为SEQ ID NO:1(+BP)的ST肽的存在下孵育这些树突细胞。与基线条件(基底)相比，被识别为SEQ ID NO:1(+BP)的ST肽的存在能够诱导IL-10的产生且能够阻滞IL-12的产生。
具体实施方式
本发明涉及具有免疫调节和/或抗炎性能的ST肽，其特征在于：
a)它是由乳杆菌属的细菌所分泌，
b)它的氨基酸序列具有含量为30％到60％的丝氨酸和苏氨酸氨基酸，和
c)它包含至少30kDa的不具有用于至少一种肠蛋白酶的切割位点的片段。
在本发明中，术语“ST肽”是指优选73个氨基酸的具有免疫调节和/或抗炎性能的肽，所述肽优选是由乳杆菌属细菌(优选是植物乳杆菌)所分泌，更优选是植物乳杆菌NCIMB8826、植物乳杆菌299V和植物乳杆菌BMCM12菌株所分泌，所述肽的氨基酸序列具有含量为至少50％的丝氨酸和苏氨酸氨基酸，且包含至少30kDa的不具有用于至少一种肠蛋白酶的切割位点的片段。这种肽可以与SEQ ID No:1具有至少80-100％的同源性，或是其直向同源物。
本发明中，“具有免疫调节性能”的措辞是指它的用于调节诸如树突细胞等人类免疫系统的细胞的应答的能力，接着这些细胞又能够调节诸如T淋巴细胞等其它免疫细胞的功能。这种免疫应答的调节包括阻滞。
本发明中，“具有抗炎性能”的措辞是指它的在分离自外周血和人类肠黏膜的树突细胞中用于诱导强有力的抗炎细胞因子——白细胞介素10——产生的能力，以及用于阻滞具有促炎性质的细胞因子——白细胞介素12——产生的能力。此外，在所述树突细胞存在下所成熟的T淋巴细胞也将获得产生非促炎细胞因子的分布。
在优选的实施方案中，所述乳杆菌属细菌是植物乳杆菌。更优选地，所述植物乳杆菌细菌选自以下菌株组：植物乳杆菌NCIMB8826、植物乳杆菌299V、和植物乳杆菌BMCM12。
在本发明的优选实施方案中，所述ST肽的特征在于，它的氨基酸序列与SEQ ID No:1具有至少80-100％的同源性。优选地，所述ST肽的特征在于，它的氨基酸序列与SEQ ID No:1具有95％的同源性。更优选地，所述ST肽的特征在于，它的氨基酸序列是SEQ ID No:1，或其直向同源物(ortholog)。
本发明中，术语“同源性”是指“序列同源性”的概念，指的是两个氨基酸或核苷酸序列之间的相似程度。
本发明中，术语“直向同源物”是指来自两个不同的生物体的共享有高度的同源性的氨基酸或核苷酸链。
在本发明的优选实施方案中，所述ST肽的特征在于，肠蛋白酶选自以下组：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和它们的组合。
本发明还涉及所述ST肽在用于治疗和/或预防肠道紊乱(intestinaldisorder)的方法中的用途，所述方法的特征在于，它包括给予患者治疗有效量的以上所定义的ST肽，以激活免疫忽视或对所述患者的肠内共生细菌的耐受的过程。
在本发明中，术语“肠道紊乱”是指在它的起源上或在它的治疗中涉及免疫系统的任何肠道疾病。
本发明中，术语“免疫耐受性”是指诱导过程的集合(set)，其中免疫系统不应答内源性或外源性抗原。
本发明中，术语“免疫忽视”是指用于促进肠道内稳态机制的能力，所述肠道内稳态机制不仅促进免疫耐受性(向细胞因子调控分布，分化从外周血和人类肠粘膜所分离的树突细胞)而且也引发(priming)T淋巴细胞，所述T淋巴细胞受刺激而具有更高的向皮肤组织迁移的能力，在所述皮肤组织所述T淋巴细胞将不会暴露于胃肠道的微生物抗原。
本发明中，措辞“患者肠道的共生细菌”是指寄生在人胃肠道的细菌组。
在本发明的优选的实施方案中，所述肠道紊乱是选自炎症性肠病(IBD)或乳糜泻的炎症性疾病。
在本发明的更优选的实施方案中，所述炎症性肠病(IBD)选自以下组：克罗恩病、溃疡性结肠炎和贮袋炎。
在本发明的优选的实施方案中，所述肠道紊乱是由自身免疫病或肠道微生物群的组成和/或活性/新陈代谢的失调所造成的疾病导致的。
在本发明的优选实施方案中，所述免疫调节和/或抗炎性能分别体现在：给予患者治疗有效量的ST肽包括：
a)在所述患者的树突细胞中，诱导优选为白细胞介素10(IL-10)的抗炎和内稳态的细胞因子的产生，和/或
b)在所述患者的树突细胞中，阻滞促炎细胞因子的产生，当除了与炎症性肠病高度相关的诸如IL-6等促炎细胞因子之外，还存在促炎白细胞介素12(IL-12)时，优选阻滞促炎白细胞介素12(IL-12)的产生。
在甚至更优选的实施方案中，以上所定义的治疗和/或预防的方法的特征在于所述树突细胞还诱导T淋巴细胞的成熟，T淋巴细胞：
a)获得了迁移至皮肤的分布，和/或
b)获得了非促炎细胞因子的产生的分布。
优选地，a)中定义的迁移至皮肤的分布包括迁移至肠粘膜整合素β7的标记的表达的减少和迁移至皮肤CLA的标记的表达的增加。优选地，b)中定义的非促炎细胞因子的产生分布包括促炎细胞因子IFNγ和白细胞介素17(IL-17)的表达的减少。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述施用治疗有效量的ST肽的特征在于，所述ST肽包含于功能食品(益生菌)或药物组合物中，优选地为胶囊的形式。
本发明所保护的另一个方面涉及功能食品，所述功能食品的特征在于，它包含治疗有效量的以上所定义的ST肽。
本发明中，术语“功能食品”是指食品的集合，所述食品除了它们的营养特征之外，还对消费者的健康带来益处或有助于避免感染疾病。
本发明所保护的另一个方面涉及优选为药物组合物的组合物，所述组合物的特征在于，它包含治疗有效量的以上所定义的ST肽。
本发明中，术语“药物组合物”是指具有适用于人类使用的形式的活性成分和赋形剂的混合物。
本发明还涉及以上所定义的功能食品或组合物的用途，所述用途是激活对患者肠道的共生细菌的免疫耐受性的过程。
本发明还涉及所述ST肽在化妆品应用中的用途。
本发明中，术语“化妆品应用”是指化妆品中的旨在改善人类皮肤特别是脸部状态的用途。
贯穿于说明书和权利要求的词语“包括”和它的变体并没有试图排除其它技术特征、添加物、成分或步骤。对本领域技术人员来说，本发明的其它的目的、优势和特征将部分地根据说明书和部分地根据本发明的实施而变得清楚。为了说明的目的而不是为了试图限制本法明，提供了以下附图和实施例。
实施例
在本专利文件中所提供的以下具体的实施例用于说明本发明的性质。包括进这些实施例仅仅是为了说明的目的，不应被理解为对本文所要求保护的发明的限制。因此在下文中描述的实施例说明了发明而没有限制其应用领域。
植物乳杆菌所分泌的蛋白和被识别为SEQ ID NO:1的ST肽的识别。
植物乳杆菌是能够从很多发酵食品(包括蔬菜和牛奶制品)中分离的嗜温乳酸菌(Tallon等，(2003)Isolation and characterization of twoexopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum EP56.Res.Microbiol.154,705-712)。一些菌株的用于存活于人类胃肠道的条件的能力已经意味着一些研究人员一直对它的益生菌潜能感兴趣。因此，目前作为益生菌销售的(如菌株299v的情况)一些植物乳杆菌菌株的对人类健康的有益效果已得到科学地证明(de Vries,等(2006)Lactobacillus plantarum-survival,functional and potential probiotic properties in the human intestinal tract.Int.Dairy J.16,1018-1028)。
目前，对研究益生菌所分泌的蛋白的兴趣日益增加，因为它们是细菌和宿主的免疫系统的细胞之间的细胞间通讯的潜在的调节者(mediators)。如在图1中可以看到的，图1显示了由植物乳杆菌NCIMB8826、植物乳杆菌299v和植物乳杆菌BMCM12所分泌的主要蛋白(道5、6和7)，在由植物乳杆菌种类的不同成员所分泌的蛋白之间存在相对的相似性。其序列显示在图2且被识别为SEQ ID No:1的ST肽序列源自被识别为SEQ IDNo:2的命名为D1的蛋白(基因库识别号gi|28270057)的中央区域，所述ST肽序列具有一些在SEQ ID NO:1(图2)中画有下划线显示的氨基酸的改变和内含物(inclusions)。该区域以富含丝氨酸和苏氨酸氨基酸为特征，它的名字源于此，且该区域以不存在用于胃肠道的一些最重要的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的切割位点为特征(图3)。
克隆和纯化被识别为SEQ ID NO:1的ST肽(不存在脂多糖的验证)
编码ST片段的DNA序列(对应于图2中标记为SEQ ID NO:2的氨基酸序列)在乳酸链球菌中被克隆且根据标准方案在镍亲和性管柱中纯化。这种肽被分泌到培养上清中，从那里这种肽可以被分离和纯化，且以在变性条件下(SDS-PAGE)在琼脂糖凝胶中形成人工产品、迁移至对应于大约100kDa的尺寸为特征(图4)。通过埃德曼降解验证所述肽的末端氨基序列。
能够在由许多其它乳酸菌所编码的蛋白中和胃肠道的属中找到富含丝氨酸和苏氨酸的区，因此源自本发明的结论可以应用于源自其它微生物的其它序列的ST肽。
被识别为SEQ ID NO:1的ST肽与树突细胞的相互作用
由于由肠蛋白酶或抗原递呈细胞的蛋白酶所释放的ST肽可能能够影响与粘膜相关联的先天免疫系统的功能，所以我们进行了一项它们与主要的抗原递呈细胞DC的相互作用的研究。首先，利用来自Genscript的显色试剂盒证明被识别为SEQ ID NO:1的ST肽样品不存在脂多糖。我们的初始假设是认为由肠道环境所产生的或伴随食品所摄入的被识别为SEQ IDNO:1的ST肽可能与肠粘膜的DC相互作用，从而影响免疫功能。
实施例1-被识别为SEQ ID NO:1的ST肽与源自血液的树突细胞的相互作用
1.1.材料和方法
树突细胞获得自既没有自身免疫病炎症性疾病、也没有过敏、也没有恶性肿瘤的健康患者。这些对象已经针对他们的血液将被用于科学目的提供了他们的书面同意书。通过在Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences,Chalfont St.Giles,英国)中差速离心来分离外周血单核细胞(PBMC)。通过在NycoPrepeTM溶液中整夜的进行离心而获得细胞级分LDC(低密度细胞)。存在于该LDC级分的细胞在98-100％的情况下是HLA-DR阳性的，具有是典型的DC的形态特征(Ng,等.(2009).A novel population of humanCD56+human leukocyte antigen D-related(HLA-DR+)colonic lamina propriacells is associated with inflammation in ulcerative colitis.Clin.Exp.Immunol.158,205-218)。
将每毫升五十万LDC在完全培养基(含有100U/mL青霉素/链霉素、2Mm L-谷氨酰胺、50U/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)和10％(v/v)的胎牛血清(英国，Buckingham,TCS cellworks)的荷兰改进的RPMI1640(英国，Dorset，Sigma-Aldrich))中培养。在以10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL浓度纯化的被识别为SEQ ID NO:1的ST肽的存在下和在作为阳性对照的LPS(100ng/mL)(美国，St.Louis,Sigma-Aldrich)的存在下，来进行这些培养。将结果与既没有被识别为SEQ ID NO:1的ST肽，作为阴性对照也没有添加LPS的的平行培养进行比较。
对于各种实验，对具有各种抗体(表1)的细胞的标记在增补有1mMEDTA和0.02％(w/v)的叠氮化钠的PBS(FACS缓冲液)中进行。在暗处，在冰中进行标记20分钟。然后用FACS缓冲液对细胞进行洗涤并用盐溶液中的1％(v/v)的多聚甲醛对其进行固定，并在4℃存储直至在流式细胞仪中采集到数据。所用的阴性对照是标记有相同的荧光物的没有特异性的同型匹配的抗体，所述同型匹配的抗体获得自相同的公司(同型对照)。
在FACSCalibur细胞仪(BD Biosciences)中获得流式细胞仪数据，且该数据用WinList5.0软件(Verity,ME,美国)进行分析。相对于同型对照，确定了对特定标记为阳性的样品比例。为了通过柱形图进行定量，用WinList软件进行了分析，在该分析中利用归一化的superenhancedDmax(SED)减法将同型染色的柱形图从特定染色的柱形图中减去(Bagwell,C.B.(2005).Hyperlog-a flexible log-like transform for negative,zero,andpositive valued data.Cytometry.64,34-42)。
细胞因子的细胞内染色
在莫能菌素存在/不存在下，将DC培养4小时。然后他们被染色，用于如上所描述的表面标记。接着在添加细胞内的染色抗体之前，用LeucopermA固定它们，并用LeucopermB渗透它们。孵育后，在FACS缓冲液中洗涤DC，并如以上所描述的对DC进行固定以及获得它们。通过以上详细的SED减法进行分析，在该分析中，将还没有用莫能菌素孵育的DC的每个细胞因子的柱形图从不存在莫能菌素下已经被孵育的DC的每个细胞因子的柱形图中减去。该方案已被我们的同行广泛地验证((Hart等,(2005)Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory boweldiseases.Gastroenterology.129,50-65)，且使得定量在不存在诸如PMA和/或离子霉素等外部刺激下通过DC的细胞因子的自然产生中的变化成为可能。使用这种方法，每个细胞因子的细胞内含量没有被确定。相反，在4小时(用莫能菌素的孵育时间)的时间窗口中的细胞因子的产生中的诱导的变化独立于细胞因子的初始含量而被确定。
1.2.结果
如在图5中可以看到的(图A)，被识别为SEQ ID NO:1的ST肽在用外周血富集的DC的迁移标记(整合素β7，肠道粘膜标记和CLA，皮肤标记)中没有产生变化。所述肽在II型MHC分子(HLA-DR)或某些协调刺激分子(CD40)或活化分子(CD83)的诱导中也没有产生变化(图5，图B)。如在后者中可以看到的，LPS(阳性对照)在它们的所有的中都确实诱导了过表达。
关于由LDC中的肽所诱导的(细胞内)细胞因子的产生的变化，这并不影响参与细胞生长的控制、细胞增殖、以及分化和凋亡的过程的调控分子TGFβ。相反地，被识别为SEQ ID NO:1的ST肽诱导IL-6(Th17细胞的生成的诱导物)和IL-12(促炎)的合成的减少，和IL-10(抗炎和内稳态)的合成的增加(图6)。
总之，被识别为SEQ ID NO:1的ST肽存在于来自人血的富集的树突细胞(LDC)意味着这些获得了调控细胞因子的产生分布，从而减少促炎细胞因子IL-12的产生和增加抗炎细胞因子IL-10的产生。具有作为其结果的Th17T型细胞的合成的理论减少的IL-6的合成的减少也是令人关注的，因为在某些自身免疫和炎性疾病的情况下，观察到这种细胞类型的增加(Stockinger and Veldhoen(2007)Differentiation and function of Th17T cells.Curr.Opin.Immunol.19,281–286)。
实施例2–被识别为SEQ ID NO:1的ST肽与获得自肠粘膜的活组织标本的树突细胞的相互作用
由于被识别为SEQ ID NO:1的ST肽的作用位点大体上是肠粘膜，我们决定利用从所述位置分离的DC来尝试验证实施例1中所描述的实验。
2.1.材料和方法
来自结肠的活组织标本获得自三个健康的患者，这三个健康的患者已经书面同意参加该研究(一位女士和两位男士，年龄在30-58之间)。这些患者具有宏观地和组织学上地正常的肠道，并且在报告肠道运输或直肠出血中的变化之后已经对这些患者进行了检查。一旦获得了活组织标本，在冷却到4℃的完全培养基中收集所述活组织标本，并在自获得它们时算起的第一个小时之前对它们进行处理。在含有1mM的二硫苏糖醇(DTT)(Sigma-Aldrich)的Hanks平衡盐溶液(HBSS)(英国，苏格兰，GibcoBRL,Paisley)中对所述活组织标本进行20分钟的孵育。接着，为了除去上皮细胞和粘液及其相关的细菌层，在1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中对所述活组织标本进行孵育。通过在1mg/mL的胶原酶D(英国刘易斯，Roche Diagnostics Ltd)的存在下在完全培养基中进行消化(digestion)来提取固有层(lamina propria)的单核细胞，这不影响DC的表型或功能(Hart等.(2005)Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatorybowel diseases.Gastroenterology.129,50-65)。在被识别为SEQ ID NO:1的纯化的ST肽(10μg/mL)的存在下和在莫能菌素依次(in its turn)存在/不存在下，伴随着它们的相应的阴性对照，对固有层单核细胞的细胞悬浮液(200000个细胞/mL)进行孵育4小时。通过流式细胞仪从存在的标记HLA-DR+和CD3-CD14-CD16-CD19-CD34-中识别出固有层DC(Hart等.(2005)Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory boweldiseases.Gastroenterology.129,50-65)。
这个实施例中随后的剩下的程序与实施例1的小节1中一样。
2.2.结果
利用肠道DC模型，可以确认实施例1中所描述的两个最令人关注的点，IL-10的产生的增加且IL-12的产生不存在任何增加。在这一点上，必须牢记的是，分离自健康个体的肠粘膜的DC具有非常低的水平的促炎细胞因子IL-12的产生(图7)。
实施例3-用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽进行成熟的获得自血液的树突细胞与T淋巴细胞的相互作用。
3.1.材料和方法
T淋巴细胞获得自外周血单核细胞(PBMC)。将获得自如实施例1所述的刚采的血液的PBMC在MiniMACs缓冲液(补充有0.5％(w/v)的牛血清白蛋白和2mM EDTA的PBS)中进行再悬浮。通过用免疫磁珠(immuno-magnetized bead)(Miltenyi Biotech公司，Bisley，英国)按照制造商的说明书去除CD14阳性、CD19阳性和HLA-DR阳性细胞而使该悬浮液富集T细胞。获得了作为所有的提取/富集的平均值的百分比为94.91％±1.06(平均值±标准偏差)的T细胞。
按照制造商的说明书用5-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，英国Invitrogen有限公司)标记T细胞。将由此而标记的T细胞(每孔4x105个细胞)用0、1％、2％或3％的DC在具有U型底部的微量滴定板中孵育5天。通过流式细胞仪将增殖的T细胞识别和定量为含有少量的CFSE(CFSElow)的T细胞(图8)。
如实施例1的小节1所描述的进行剩下的流式细胞仪方案
3.2.结果
没有使其与DC接触的T细胞(静止的T细胞)的片段显示了“归位(homing)”(指示它们定向到哪个组织的标记物)和每个捐赠者的产生白细胞介素(IL-10、TGFβ、IFNγ、IL-17)的特征的分布。如所预期的那样，“归位”标记的绝对值和通过未由被识别为SEQ ID NO:1的ST肽或LPS处理过的LDC(实施例1)所产生的细胞因子的产生的绝对值在每个捐赠者中是不同的。
尽管这样，用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽或LPS(阳性对照)预先孵育的DC总是在来自各捐赠者的T细胞中诱导相同的细胞因子的产生和“归位”标记的分布。集中于用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽所孵育的DC，这些在T淋巴细胞中诱导迁移至肠粘膜整合素β7的标记的减少，然而，相反地，CLA标记(迁移至皮肤的标记)的量大幅增加(图9)。因此，在被识别为SEQ ID NO:1的ST肽存在下所孵育的用血液富集的DC印记在T淋巴细胞中的迁移至皮肤的标记。从免疫学的角度来看，这可以解释为存在于胃肠道的抗原的免疫忽视机制。从这个意义上说，一旦T细胞在皮肤中，将永远不会遇到抗原，针对抗原他们在肠粘膜中被选择，因此是无活性的。
此外，从IFNγ和IL-17的产生都减少的意义上来说，在这些相同的T细胞(与用被识别为SEQ ID NO:1的肽已预先孵育的DC共孵育)中的细胞因子的产生分布是不同的(图10和11)。两种细胞因子都是促炎的，且在IL-17(Th17细胞)的情况下，已知的是，在某些自身免疫和炎症性疾病中通过T细胞的IL-17的产生是更大的。
因此，用由被识别为SEQ ID NO:1的ST肽处理的DC所成熟的T淋巴细胞获得了非促炎细胞因子的产生分布和迁移至皮肤的分布。
实施例4-获得自肠粘膜的用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽所成熟的树突细胞与原始的T淋巴细胞的相互作用
除了在这个实施例的情况中使用分离自肠粘膜的DC之外，这个实施例与前面的实施例是相同的。如可以在图12中看到的，从在T细胞上的肠道DC印记的细胞因子的分布是诱导IL-10(抗炎)，然而没有其它白细胞介素(TGFβ、IL-17和IFNγ)的增加的意义上说，肠道DC是已经“内稳态的”。用被识别为SEQ ID NO:1的ST肽所孵育的DC诱导T细胞中的IL-10的产生和TGFβ的产生的更大的增加。
最后，就如在前面的实施例中一样，由所述肽处理的DC诱导更大数目的表达迁移至皮肤的标记的淋巴细胞(图13)，因此，再次证明了被识别为SEQ ID NO:1的ST肽将促进免疫忽视的过程。
实施例5被识别为SEQ ID NO:1的ST肽在炎症性肠病、具有皮肤表现的自身免疫性疾病和化妆品中的潜在用途。
一个书面同意捐献来自结肠的肠粘膜的活组织标本给我们的实验的捐献者，其具有产生异常高水平的IL-12的一些DC，所述IL-12是抗原递呈细胞的经典的促炎白细胞介素。如在图14中可以看到的，被识别为SEQID NO:1的ST肽完全取消了在这些树突细胞中的IL-12的产生，以及增加了抗炎白细胞介素IL-10的产生。
尽管它是单个实施例，但我们启示了以上所定义的被识别为SEQ IDNO:1的ST肽在炎症性肠病和其它炎症性疾病的情况下以及在伴随着炎症症状进行的自身免疫性疾病的情况下，可以被包含于免疫治疗项目中。
产生本发明的工作已收到来自欧洲共同体第七框架计划(FP7/2007-2013)的资助，授权合同号235993。
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Claims (14)

1.具有免疫调节和/或抗炎性能的ST肽，其特征在于：
a)它是由乳杆菌属细菌(Lactobacillus bacterium)所分泌，
b)它的氨基酸序列与SEQ ID No:1具有至少80％的同源性。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，所述乳杆菌属细菌是植物乳杆菌。
3.如权利要求1和2所述的肽，其特征在于，所述植物乳杆菌菌株选自以下组：植物乳杆菌NCIMB8826、植物乳杆菌299V和植物乳杆菌BMCM12。
4.如权利要求1和3所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列与SEQ ID No:1具有至少90-100％的同源性。
5.如权利要求1-4所述的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列是SEQID No:1，或其直向同源物。
6.权利要求1-5中所定义的肽的用途，所述用途为用于制备医药产品或药物组合物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述医药产品或药物组合物是用于治疗和/或预防肠道紊乱。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肠道紊乱是选自炎症性肠病或腹腔炎症的炎症性疾病。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述炎症性肠病选自以下组：克罗恩病、溃疡性结肠炎和贮袋炎。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述肠道紊乱是由自身免疫病或由肠道微生物群的组成的失调所造成的疾病导致的。
11.权利要求1-5中所定义的ST肽的用于制备功能食品的用途。
11.功能食品，其特征在于，它包含治疗有效量的权利要求1-5中所定义的ST肽。
12.药物组合物或医药产品，其特征在于，它包含治疗有效量的权利要求1-5中所定义的ST肽。
13.权利要求1-6中所定义的ST肽的用于制备化妆品的用途。
14.化妆品，其特征在于，它包含有效量的权利要求1-5中所定义的ST肽。
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