CN104089953A - 一种快速测定尿巯基的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的快速检测尿液中巯基的方法，包括以下检测步骤：在测试孔内顺序加入试剂A100μL 、尿液50μL、试剂B50μL和试剂C50μL；在对照孔内顺序加入试剂A100μL、尿液50μL、试剂D50μL、试剂B50μL和试剂C50μL；2分钟内观察两孔颜色变化，若测试孔显蓝色、对照孔未显色或测试孔显色明显重于对照孔则为阳性，表明尿标本内含有巯基；若两孔均未显色或显色无明显差异则为阴性，表明尿标本内不含有巯基；本发明提供的检测方法，简单实用，成本低廉，安全可靠，可快速的筛查出尿液中不含巯基的样本、含巯基的样本和可能含有巯基的样本，为进一步检查做准备。

Description

一种快速测定尿巯基的方法

 

技术领域

 本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种用普鲁士蓝法快速检测尿液巯基的方法。

背景技术

许多天然蛋白质含有游离巯基（free sulfhydryl groups）或潜在的巯基。在蛋白质中，巯基往往以活性功能基的形式参与酶的催化或参与辅助因子的结合或参与蛋白质活性构象的维持。研究蛋白质巯基的数量和性质是近代生物化学获得某些信息的重要手段之一。正常人尿中几乎不含有巯基，但是体内某些代谢异常则导致尿中巯基含量增高。

现今已知用来作用蛋白质巯基的试剂大约有60多种，其中，Ellman试剂是检测蛋白质巯基常用的试剂。Ellman试剂，也称为DTNB（5,5－二硫二硝基苯甲酸）试剂，该试剂是一种通用的检测溶液中自由巯基的水溶性化合物。DTNB与蛋白质巯基相互作用形成有色的硫酚阴离子（CNT），该化合物的溶液与巯基反应会产生黄色的化合物。检测诸如具有末端半胱氨酸残基的多肽的未知样品。但是，Ellman试剂操作比较复杂，灵敏度欠佳。

尿巯基测定目前使用的另一快速方法是硝普钠试验：尿液1ml加入5%氰化钠水溶液，放置5分钟，加入5%硝普钠水溶液一滴，出现红色或紫红色为阳性，表示尿中有过量的巯基。该法涉及剧毒物质---氰化钠，生物安全度极低，给生产和使用均造成极大隐患。

因此，发明一种新的、安全无毒、操作简单、成本低廉、灵敏度高的检测方法快速的确定尿液中是否含有巯基，成为一个需要解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中检测尿液中的巯基方法敏感度低、毒性高、耗时长、生物安全度低的问题，本发明提供了新的普鲁士蓝法快速测定尿巯基的方法，本发明提供的方法其生物安全度高，而且灵敏度高，成本低廉，方便快捷。

本发明提供的快速检测尿液中巯基的方法，包括以下检测步骤：

在测试孔内顺序加入试剂A 100μL 、尿液50μL、试剂B 50μL 和试剂C50μL；在对照孔内顺序加入试剂A100μL、尿液50μL、试剂D50μL、试剂B50μL 和试剂C50μL ；2分钟内观察两孔颜色变化，若测试孔显蓝色、对照孔未显色或测试孔显色明显重于对照孔则为阳性，表明尿标本内含有巯基；若两孔均未显色或显色无明显差异则为阴性，表明尿标本内不含有巯基；

所述试剂A为2M PH5.0醋酸缓冲液，配制方法如下：

2M醋酸钠溶液：醋酸钠8.2g，加净化水溶解，定容至100ml；

2M醋酸溶液：冰醋酸6g,. 加净化水溶解，定容至100ml；

2M醋酸钠溶液10ml+2M醋酸溶液2ml,混匀，冰箱冷存48小时；

所述试剂B为1%铁氰化钾溶液，配制方法如下：铁氰化钾1g, 加净化水

溶解，定容至100ml；

  所述试剂C为2%三氯化铁溶液，配制方法如下：三氯化铁（含6分子

H2O）2g, 加净化水溶解，定容至100ml；

所述试剂D为0.1M二氯化汞溶液，配制方法如下：二氯化汞2.7g，加净化水溶解，定容至100ml；

普鲁士蓝(Prussian blue) 又称亚铁氰化铁（分子式: Fe4[Fe(CN)6]3）是经典的配合物。其配体为六个氰基，中心离子为二价铁离子。氰基与二价铁离子共同通过配位键组成六氰合铁（II）酸根（整体显-4价）作为普鲁士蓝的内配位层（内界）。而外层的三价铁离子与钾离子作为普鲁士蓝的外配位层（外界)通过离子键与六氰合铁（II）酸根以离子键的形式相连接。

普鲁士蓝的结构：普鲁士蓝为六面立（正）方结构。氰基作为立（正）方的各条棱连结处于顶点的铁离子，其中相同价态的铁离子在各面上均互为对角，而每间隔一个立（正）方，钾离子会被包裹在其中。

巯基（--SH）作为一种还原剂使三氯化铁还原成二氯化铁，后者与鉄氰化钾反应生成普鲁士蓝而呈现蓝色。利用这一化学反应可以测定尿中巯基物含量。

3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl

但是尿中存在的尿酸、维生素C等还原性物质也能使鉄氰化钾还原，故有干扰。正常体内尿酸池平均为1200mg，每天产生750mg，排出500～1000mg。在正常情况下，约2／3经肾脏排泄，其余1／3在肠道分解排出。但研究发现：巯基在酸性环境中还原性较强，而尿酸在碱性环境中具有还原性。制作一个酸性环境则可基本排除尿酸对巯基检测的干扰。此外，以二氯化汞与巯基结合，可作尿酸和维生素C等干扰物的空白对照加以排除。

本发明提供的检测方法，简单实用，成本低廉，安全可靠，可快速的筛查出尿液中不含巯基的样本、含巯基的样本和可能含有巯基的样本，为进一步检查做准备。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

（1）请受检者留取尿液2ml以上；

（2）向测试孔和对照孔内分别滴入试剂A各100μL；

（3）再向测试孔和对照孔内分别滴入标本尿液各50μL；

（4）再向对照孔内滴入试剂D50μL；

（5）再向测试孔和对照孔内分别滴入试剂B各50μL；

（6）再向测试孔和对照孔内分别滴入试剂C各50μL；

（7）2分钟内观察测试孔和对照孔内液体的颜色变化。

检测结果判定如下：

（1）    测试孔和对照孔均不显色则为阴性，说明尿液中不含巯基；

（2）   测试孔和对照孔均显同等颜色（蓝色），亦为阴性，说明尿液中不含巯基；

（3）   测试孔显色（蓝色），对照孔不显色则为阳性，说明尿液中含巯基；测试孔显色越深，说明尿液中含巯基越多；

（4）    测试孔和对照孔均显色，但测试孔颜色明显比对照孔深，亦为阳性，说明尿液中含巯基；二者颜色差距越大，说明尿液中含巯基越多；

（5）    测试孔显色较浅，或测试孔和对照孔显色差距较小，为可疑阳性，说明尿液中可能含有巯基。 

Claims (1)

1.一种快速测定尿巯基的方法，包括以下检测步骤：

在测试孔内顺序加入试剂A 100μL 、尿液50μL、试剂B 50μL 和试剂C50μL；在对照孔内顺序加入试剂A100μL、尿液50μL、试剂D50μL、试剂B50μL 和试剂C50μL ；2分钟内观察两孔颜色变化，若测试孔显蓝色、对照孔未显色或测试孔显色明显重于对照孔则为阳性，表明尿标本内含有巯基；若两孔均未显色或显色无明显差异则为阴性，表明尿标本内不含有巯基；

所述试剂A为2M PH5.0醋酸缓冲液；

所述试剂B为1%铁氰化钾溶液；

 所述试剂C为2%三氯化铁溶液；

所述试剂D为0.1M二氯化汞溶液。