CN104087667B - Npr3基因在制备诊断试剂盒中的用途 - Google Patents

Npr3基因在制备诊断试剂盒中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了NPR3基因在制备诊断骨肉瘤的试剂盒中的用途。本发明利用NCBI？GEO数据检索将符合要求的8套骨肉瘤病例和正常人群基因组mRNA表达芯片数据纳入研究范围，通过对上述芯片数据进行Meta分析，筛选出NPR3基因是差异显著基因，相比正常组织，NPR3基因在骨肉瘤组织中表达下调，并使用荧光实时定量PCR方法验证了上述结论。据此，本发明还公开了一种诊断骨肉瘤的试剂盒以及利用该试剂盒诊断骨肉瘤的方法。本发明一方面为研究骨肉瘤的分子机理提供新的思路，另一方面为早期诊断骨肉瘤提供了更为灵敏的诊断试剂盒。

Description

NPR3基因在制备诊断试剂盒中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种骨肉瘤诊断试剂盒及NPR3基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的应用。
背景技术
在转录组研究中应用最早及最广泛的为基因芯片技术，首先从待检测样品中提取RNA，并利用荧光标记的核苷酸将其反转录成cDNA，经过标记的核苷酸序列可与基因芯片特定位点上的探针杂交，经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。基因芯片技术已成为一项非常稳定可信的实验技术，目前公布的大量转录组数据主要是利用基因芯片技术产生的。
骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织，是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。目前，国内筛选该疾病的相关基因主要采用的是基因芯片技术构建表达谱的方法。随着生物技术的发展，实验研究产生了大量的基因芯片数据，并通过基因表达芯片筛选出了影响骨肉瘤发生发展的基因及信号通路，已鉴别出大量差异表达的基因。但是不同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存在很多不一致性。
Meta分析可对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上的整合，以期获得更准确或更多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免单个研究带来的不正确性。Meta分析是在多个芯片实验研究中识别差异表达基因的强有力工具。此外，用Meta分析能识别出单个研究不能识别的差异基因，并且能有效地降低单个芯片数据的假阳性。
本发明通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析，筛选出影响骨肉瘤发生发展的关键基因，并使用荧光实时定量PCR(QPCR)检测验证临床样本中的表达，本发明通过生物信息学手段发掘这些基因在骨肉瘤中的作用，从而对骨肉瘤的发病机理进行探究，为其诊断和治疗提供一定的研究基础。
发明内容
本发明通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析和QPCR验证，发现NPR3基因在骨肉瘤组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异。与正常组织相比，NPR3基因在骨肉瘤组织中表达下调，通过检测NPR3基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有骨肉瘤。
本发明的目的在于提供NPR3基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增NPR3基因和管家基因的引物对。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。
引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中，扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT。
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的又一个目的在于提供一种诊断骨肉瘤的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增NPR3基因和管家基因的引物对。所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。
引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
优选逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT。
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明还提供了诊断骨肉瘤的方法，所述方法包括：
(1)利用RNA提取试剂提取样本总RNA；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将NPR3基因和管家基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；
(5)NPR3基因表达下调，表明研究对象为骨肉瘤患者。
步骤(1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30μmmol/lOligodT，200U/μlM-MLVRT，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次公开了NPR3基因与骨肉瘤相关，NPR3基因有望成为诊断骨肉瘤的分子标志物，并为研究骨肉瘤的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断骨肉瘤的存在与否的方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明：
图1表示荧光实时定量PCR测定在正常组织和骨肉瘤组织中NPR3基因mRNA的相对表达量。
具体的实施方式：
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1筛选与骨肉瘤相关的基因
1.1NCBIGEO(GeneExpressionOmnibus)数据检索
GEO(GeneExpressionOmnibus)数据库是由NCBI(美国国立生物技术信息中心)开发维护，GEO数据库作为最大的基因表达数据的数据库，该数据库以芯片数据为主，此外亦包含一些非芯片类型的数据如SAGE(基因表达系列分析)数据、SARST(核糖体序列标签连续分析)数据、MS(质谱)数据、蛋白质组数据和新一代高通量测序数据(MPSS，大规模平行测序技术)等。
a.检索关键词：
(″osteosarcoma″[MeSHTerms]ORosteosarcoma[AllFields])AND″Homosapiens″[porgn]
b.研究中的样本筛选策略：
限制研究类型为“expressionprofilingbyarray”符合以下标准的数据集将纳入我们的研究中：①所选数据集必须是全基因组的表达mRNA芯片数据；②这些数据来自于骨肉瘤病例组和对照组的活检组织或培养的细胞(无药物刺激或被转染)；③本研究均考虑经标准化或者原始数据集；④所选数据集必须包括超过3个样本以上。最后，有8套芯片数据集纳入我们的研究中(表1所示)。
表18套骨肉瘤全基因组数据集的基本情况
1.2骨肉瘤基因芯片数据Meta分析结果
通过DNA芯片分析软件对原始数据进行背景校正和标准化后，利用微阵列显著性分软件(significanceanalysisofmicroarray，SAM)对8套数据进行差异表达基因的筛选，分析过程中设定倍数变化(foldchange，FC)为1.2，假阳性率(falsediscoveryrate，FDR)为≤0.05，共筛选出3994个，其中表达水平下调的基因1727个，表达水平下调的基因3606个。
实施例2QPCR验证候选基因与骨肉瘤的关系
基于对骨肉瘤基因芯片数据Meta分析的结果，根据Pvalue的大小，我们选择NPR3基因(Meta分析显示与正常组织相比，NPR3基因在骨肉瘤组织中表达下调)进行验证。收集6个骨肉瘤组织样本，同时收集6个正常组织样本，采用荧光实时定量PCR进行经典的分子生物学实验验证(qRT-PCR)，具体操作步骤如下所示：
(1)RNA提取
收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
(2)逆转录
用逆转录缓冲液对1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30μmmol/lOligodT，200U/μlM-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
(3)QPCR扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA2.0μl，无酶水8.5μl；扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)*45个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与正常组织相比，NPR3基因在骨肉瘤组织中的表达下调，同Meta分析结果一致。
实施例3骨肉瘤诊断试剂盒的制备
根据NPR3基因与骨肉瘤的相关性，可以通过检测NPR3基因的表达情况来诊断骨肉瘤是否发生，据此本发明提供了一种基于检测NPR3基因表达来诊断骨肉瘤的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBRGreen聚合酶链式反应体系；扩增NPR3基因和GAPDH基因的引物对。扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液成分为：25mMKCl，2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。
实施例4骨肉瘤诊断试剂盒的制备
根据NPR3基因与骨肉瘤的相关性，可以通过检测NPR3基因的表达情况来诊断骨肉瘤是否发生，据此本发明提供了一种基于检测NPR3基因表达来诊断骨肉瘤的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：SYBRGreen聚合酶链式反应体系、扩增NPR3基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆转录体系。扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mMKCl、2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mMTris-HCl(pH8.3)、375mMKCl、15mMMgCl2、50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
实施例5骨肉瘤诊断试剂盒的制备
根据NPR3基因与骨肉瘤的相关性，可以通过检测NPR3基因的表达情况来诊断骨肉瘤是否发生，据此本发明提供了一种基于检测NPR3基因表达来诊断骨肉瘤的试剂盒，试剂盒中的组分如下：SYBRGreen聚合酶链式反应体系、扩增NPR3基因和GAPDH基因的引物对、RNA提取试剂。扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mMKCl、2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
实施例6骨肉瘤诊断试剂盒的制备
根据NPR3基因与骨肉瘤的相关性，可以通过检测NPR3基因的表达情况来诊断骨肉瘤是否发生，据此本发明提供了一种基于检测NPR3基因表达来诊断骨肉瘤的试剂盒，试剂盒组分如下：SYBRGreen聚合酶链式反应体系、扩增NPR3基因和GAPDH基因的引物对、M-MLV逆转录体系、RNA提取试剂。扩增NPR3基因的正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；扩增GAPDH的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。PCR缓冲液组分为：25mMKCl、2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。M-MLV逆转录体系组分为：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。逆转录反应液组分为：250mM的Tris-HCl(pH8.3)、375mM的KCl、15mM的MgCl2，50mM的DTT。RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

Claims (16)

1.检测NPR3基因的试剂在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增NPR3基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述扩增NPR3基因的引物对的序列如下：正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mMKCl、2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：T重复寡核苷酸OligodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
9.一种骨肉瘤的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增NPR3基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。
10.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增NPR3基因的引物对的序列如下：正向引物序列为5’-TATAACTCAACACGGAAC-3’，反向引物序列为5’-CTACCTAGAGACATCAAC-3’；所述管家基因是GAPDH，扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
11.根据权利要求9所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：25mMKCl、2.5mMMgCl2、200mM(NH4)2SO4。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系包含：T重复寡核苷酸OligodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
13.根据权利要求12所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应液包含：250mMpH8.3的Tris-HCl、375mM的KCl、15mM的MgCl2、50mM的DTT。
14.根据权利要求12所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述RNA酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。
15.根据权利要求9-11中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
16.根据权利要求12所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
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