CN104083806B

CN104083806B - 一种用于药物洗脱支架的药物涂层及其制备方法和应用

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Publication number: CN104083806B
Application number: CN201410265525.8A
Authority: CN
Inventors: 张海燕; 黄楠; 杨明; 王欣; 方洋; 罗光明
Original assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-06-13
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2034-06-13
Also published as: CN104083806A

Abstract

本发明提供一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物；所述黄芩苷磷脂复合物的质量不超过所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的15％；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000～100000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸：羟基乙酸＝50:50～75:25。本发明还提供所述药物涂层的制备方法。本发明所述药物涂层能够促进正常内皮细胞生长，抑制血管平滑肌细胞的增殖，能够有效地防止支架植入后的血管再狭窄。

Description

一种用于药物洗脱支架的药物涂层及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种用于药物洗脱支架的药物涂层及其制备方法和应用。

背景技术

目前，血管支架已经成为治疗各种原因所致血管狭窄、重要脏器供血不足的常用治疗手段。临床操作中，一般在管腔球囊扩张成形的基础上，在病变段置入血管支架以达到支撑狭窄闭塞段血管，减少血管弹性回缩及再塑形，保持管腔血流通畅的目的。血管支架根据植入的位置不同，主要分为冠脉支架、脑血管支架、肾动脉支架、大动脉支架等。研究表明，由于血管局部对球囊损伤的过度愈合反应，包括早期血管弹性回缩、晚期血管负性重塑及新生内膜过度增生，介入治疗术后3～6个月内易发生支架内再狭窄，且一般在3个月时达到高峰。如何减少再狭窄的发生成为研究的热点。

将负载有药物的聚合物涂覆于金属支架表面，当支架置入血管内病变部位后，药物自聚合物涂层中通过洗脱方式有控制地释放至血管壁组织而发挥生物学效应。应用这样的概念，产生了药物洗脱支架，也称之为“药物释放支架”。经过反复临床验证获得上市批准的药物洗脱支架有雷帕霉素洗脱支架和紫杉醇洗脱支架，其不仅能有效抑制支架植入术后血管壁的弹性回缩，而且显著抑制血管平滑肌细胞及新生内膜的过度增殖，从而显著降低了支架植入术后再狭窄率。

但是目前使用的涂层药是把双刃剑，如雷帕霉素、紫杉醇都主要抑制平滑肌细胞的增殖与迁移，但同时也抑制内皮细胞的增殖，破坏血管内皮化，延迟血管的自然愈合相关，从而导致支架内延迟晚期血栓形成。另外，多聚物载体的持续存在也是晚期血栓形成的可能原因之一。

因此，理想的药物洗脱支架，除满足载药涂层释放行为平稳、可控外，更重要的是其涂层中负载的药物应该选择性地抑制血管平滑肌，但是对血管内皮细胞没有作用或者有促进其增殖作用。另外，载药的聚合物也应该具有生物可降解性。

最新文献报道黄芩苷对支架内再狭窄相关细胞：血管平滑肌细胞和内皮细胞具有双向调节的作用，即保护内皮和抑制平滑肌细胞增殖作用。但是黄芩苷难溶于水，溶出速率慢，这些特性障碍了其作为支架涂层药物的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的在于提供一种用于药物洗脱支架的药物涂层。该涂层以特定单体比例的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)为基质，负载黄芩苷的磷脂复合物，从而取得理想的涂层释放行为。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物。

优选的，所述黄芩苷磷脂复合物的质量不超过所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的15％。

更优选的，所述黄芩苷磷脂复合物的质量不超过所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％。

最优选的，所述黄芩苷磷脂复合物的质量是所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000～100000，更优选为20000～80000，最优选为60000。

优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸：羟基乙酸＝50:50～75:25；更优选的，乳酸：羟基乙酸＝60:40～75:25；最优选的，乳酸：羟基乙酸＝60:40。

优选的，所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和磷脂，其中所述磷脂选自大豆卵磷脂和/或蛋黄卵磷脂，优选为大豆卵磷脂。

更优选的，所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的3倍以上，最优选为4倍。

作为一种优选的实施方式，本发明提供一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量不超过所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸:羟基乙酸＝60:40～75:25；所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的3倍以上。

作为一种更优选的实施方式，本发明提供一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量是所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸:羟基乙酸＝60:40；所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的4倍。

本发明的另一个目的在于，提供上述用于药物洗脱支架的药物涂层的制备方法，包括将所述黄芩苷磷脂复合物和聚乳酸-羟基乙酸共聚物共溶于氯仿中，搅拌至澄清，静置，挥尽溶剂。

优选的，聚乳酸-羟基乙酸共聚物在氯仿中的质量/体积百分浓度为5％～10％，更优选为5％。

优选的，所述制备方法中，还包括黄芩苷磷脂复合物的制备，具体操作为：

按照比例称取黄芩苷和大豆卵磷脂，加入无水乙醇，无水乙醇与黄芩苷的体积质量比为50:1～80:1，40～70℃下搅拌1～3h，减压回收无水乙醇，干燥，收集所得固体，即得黄芩苷磷脂复合物。

更优选的制备黄芩苷磷脂复合物的技术方案是：

按照比例称取黄芩苷和大豆卵磷脂，加入无水乙醇，无水乙醇与黄芩苷的体积质量比为60:1～70:1，50～60℃下搅拌2h，减压回收无水乙醇，干燥，收集所得固体，即得黄芩苷磷脂复合物。

还优选，可以对上述方法制备得到的黄芩苷磷脂复合物进行纯化，具体操作为：

用氯仿溶解黄芩苷磷脂复合物，过滤，滤渣用氯仿洗涤，滤液减压回收氯仿，干燥。

本发明还有一个目的，在于提供所述药物涂层在制备用于防止血管再狭窄的药物洗脱支架中的应用。

本发明还提供一种药物洗脱支架，包括上述药物涂层。

本领域技术人员应该理解，本发明所述的用于药物洗脱支架的药物涂层，除了所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物外，还可能有残留的溶剂，如氯仿。

为了使负载黄芩苷的药物洗脱支架用药物涂层具有良好的生物相容性、理想的释放行为等，本发明从以下几个方面进行了研究和筛选，进而得到本发明所述的优选的技术方案。

1.黄芩苷磷脂复合物的研究

以黄芩苷的包合率为指标，优选出黄芩苷和大豆卵磷脂用量比例。

按表1所示的质量比例，秤取黄芩苷和大豆卵磷脂到三角锥瓶里，加入适量无水乙醇，60℃下搅拌2h,将反应液减压回收无水乙醇，真空干燥24h，即得黄芩苷磷脂复合物。利用黄芩苷难溶于氯仿，而磷脂和黄芩苷磷脂复合物易溶于氯仿的特性，将制备得到的黄芩苷磷脂复合物溶于氯仿，滤过，再用少量氯仿洗涤滤饼数次，收集滤饼，干燥，即为未包合的黄芩苷的质量，带入公式1，计算黄芩苷的包合率，结果见表1。

表1黄芩苷磷脂复合物筛选结果

表1的数据显示，大豆卵磷脂的质量是黄芩苷的3倍以上时，磷脂复合物对黄芩苷的包合较好(包合率≥80％)；特别的，大豆卵磷脂的质量是黄芩苷的4倍时，包合率达98％。因此，优选大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的3倍以上，最优选为4倍。

2.涂层载体材料的选择

作为药物洗脱支架上的药物涂层的载体，可降解的高分子材料在体内必须有适宜的降解行为。PLGA由乳酸单体和羟基乙酸单体缩聚而成，不同单体比例的PLGA其降解行为有差异。因此，以失重率和吸收率为指标，考察不同单体比例的PLGA，进而优选出涂层载体材料。

2.1高分子载体薄膜的制备

称取适量分子量为60000的三种不同比例的PLGA(LA:GA＝50:50、60:40、75:25)，分别用氯仿充分溶解成质量浓度为5％的溶液，室温下搅拌澄清后超声脱气，静置。采用溶液浇铸法(蔡晴，贝建中，等.乙交酯/丙交酯共聚物的体内外降解行为及生物相容性研究[J].功能高分子学报，2000(3)：249-254)，将上述的溶液缓慢浇铸到放置有清洁硅片的模具中，用保鲜膜和滤纸封口后，在表面扎几个均匀的小孔，放置通风橱室温干燥24h，真空干燥48h后，保存备用。用于降解实验。

2.2降解行为的评价

将制备的含高分子薄膜的硅片(载膜硅片)准确称量，得到载膜硅片的原重(W₀)，然后放入37℃的磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4)溶液中，隔一定时间分别取出样品，用双蒸水充分冲洗表面吸附的盐，再用滤纸将载膜硅片表面的水分充分吸干后准确称量，得到吸水后载膜硅片的重量(W_a)，代入公式2计算吸水率(A)。称量后的载膜硅片在真空干燥箱中充分干燥24h至恒重后再准确称量，得到干燥后的载膜硅片的重量(W_d)，代入公式3计算失重率(W_L)。

A = \frac{W_{a} - W_{0}}{W_{0}} \times 100 % - - - (2)

W_{L} = \frac{W_{0} - W_{d}}{W_{0}} \times 100 % - - - (3)

其中，W₀为载膜硅片的原重，

W_a为吸水后载膜硅片的重量，

W_d为干燥后载膜硅片的重量。

2.2.1失重率

三种不同单体比例的PLGA膜在第1～35天的失重率曲线，如图1所示。

失重率代表高分子材料在降解过程中重量随时间的变化，是反映载体材料降解行为的重要参数。在相同时间内失重率越高，则材料的降解速度越快。分子量为60000的PLGA(LA:GA＝50:50、60:40、75:25)在前15天内的失重率均较小。PLGA(LA:GA＝50:50)较其他两种的失重率较大，为17％左右。但是在一个月时，PLGA(LA:GA＝50:50)失重率达到了57％左右，而其他两种PLGA的失重率在23％左右。可见PLGA(LA:GA＝50:50)的降解行为存在较明显的诱导期。在体内降解过程中，环境比较复杂，降解过程的诱导期将缩短，降解速度更快，同时药物的释放会使高分子材料结构疏松，水分子更易进入使其键更容易断裂，从而加快了降解速度，因此PLGA(LA:GA＝50:50)可能在一个月内降解完全。故其不适合做为载药的涂层材料。在整个降解实验过程中，PLGA(LA:GA＝60:40和LA:GA＝75:25)的降解行为曲线(失重率曲线)较平缓，薄膜在前半个月内的失重率较后半个月小，一个月内的失重率均为23％左右。因此，初步优选单体比例LA:GA＝60:40～75:25的PLGA。

2.2.2吸水率

高分子聚合物的吸水率对载体的降解至关重要，普遍而言，聚合物的吸水性能越强降解速度越快。三种不同单体比例的PLGA在第1～35天的吸水率曲线，见图2。

三种不同单体比例的PLGA的吸水率均随时间的变化而不断增加，且在20天后吸水率的增加较前期快。同期的吸水率大小顺序为：PLGA(LA:GA＝50:50)＞PLGA(LA:GA＝60:40)＞PLGA(LA:GA＝75:25)，基本与其降解行为一致。但是PLGA(LA:GA＝50:50)在30天内的吸水率达到了440％,而PLGA(LA:GA＝75:25)和PLGA(LA:GA＝60:40)在30天内的吸水率分别为为115％和156％左右。因此，从吸水率也反映出PLGA(LA:GA＝50:50)的降解过快，不适宜做为药物涂层的载体。

3.涂层载药量的优选

载药量不同即PLGA与黄芩苷磷脂复合物的比例不同对薄膜的成形性影响较大。在前期筛选出黄芩苷与磷脂复合物适宜比例基础上(黄芩苷：大豆卵磷脂＝1:4)，按黄芩苷磷脂复合物占PLGA重量10％、15％、20％的比例分别称量不同单体比例的PLGA和黄芩苷磷脂复合物，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，最后取相同体积的溶液倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h,取出后观察薄膜形态。利用扫描电子显微镜(Scanningelectronmicroscope,SEM),放大10000倍观察三种单体比例的PLGA空白膜(不负载药物)以及载药量为10％时，三种单体比例的PLGA载药膜的表面形态。SEM扫描照片见图3。

用不同单体比例的PLGA(LA:GA＝50:50、60:40、75:25)负载不同量的黄芩苷复合物(10％、15％、20％)成膜后肉眼观察，发现载药量为10％时，三种PLGA载药薄膜外观都较平整、光滑、透明，无析出；载药量为15％时，均有微量黄色颗粒析出；载药量为20％时，均有少量黄色颗粒析出。说明载药量超过10％，三种PLGA都出现了药物析出的现象。因此，优选载药量不超过10％。而相同载药量的不同单体比例的PLGA薄膜比较，载药量为10％时，PLGA(LA:GA＝60:40)的薄膜外观较其他两种好。

图3中，(a)(c)(e)为不同单体比例PLGA空白膜，表面均光滑而平整。(b)(d)(f)为载药量10％时不同比例PLGA载药膜，表面也比较光滑而平整，且无明显颗粒出现。同时SEM图显示，PLGA(50：50)空白膜与载药膜之间差别比较明显，相比于光滑的空白膜，载药膜表面有部分隆起，如图3中(a)和(b)所示。推测由于药物与PLGA(50：50)相容性比较差，引起的药物溶出。而PLGA(60：40)和PLGA(75：25)空白膜与载药膜之间表面形貌差别不明显，表明药物与这两种PLGA之间比较好的相容性，如图3中(c)和(d)，(e)和(f)所示。因此，优选单体比例LA:GA＝60:40～75:25的PLGA。

另外，比较图3中的(d)和(b)、(f)，(d)中载药膜表面更加均匀平整，致密性也更好。而载药量为15％和20％时，肉眼观察PLGA(LA:GA＝60:40)的薄膜析出的药物较其他两种少。因此，PLGA(LA:GA＝60:40)是最优选的载体材料。

本发明用于药物洗脱支架的所述的药物涂层，黄芩苷磷脂复合物在PLGA膜中以分子状态分散，与PLGA没有化学反应，存在稳定。另外，黄芩苷的释放行为平稳，且与支架植入后支架内再狭窄发生过程一致。本发明不同载药量的药物涂层，对正常内皮细胞的增殖有促进作用，而对平滑肌细胞的增殖有抑制作用。黄芩苷对血管再狭窄相关的两种细胞的双向调节作用，将有效地防止血管再狭窄。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示的是三种不同单体比例的PLGA膜在第1～35天的失重率曲线。

图2显示的是三种不同单体比例的PLGA在第1～35天的吸水率曲线。

图3显示的是载药量为10％的三种不同单体比例的PLGA薄膜的SEM照片，其中(a)是PLGA(50：50)空白膜，(b)是PLGA(50：50)载药膜(载药量10％)；(c)是PLGA(60：40)空白膜，(d)是PLGA(60：40)载药膜(载药量10％)；(e)PLGA(75：25)空白膜，(f)是PLGA(75：25)载药膜(载药量10％)。

图4显示的是试验例1中的X-射线衍射图谱，其中图4A是有硅片基底的PLGA空白膜的X-射线衍射图谱，图4B是有硅片基底的药物涂层的X-射线衍射图谱，图4C是黄芩苷粉末的X-射线衍射图谱，图4D是硅片的X-射线衍射图谱。

图5显示的是试验例1中的红外光谱图；图5A是黄芩苷粉末、对比例1的PLGA空白膜和实施例2的药物涂层的红外光谱图，其中1是黄芩苷粉末的红外光谱，2是PLGA空白膜的红外光谱，3是实施例2的药物涂层的红外光谱；图5B是黄芩苷磷脂复合物的红外光谱图。

图6显示的是试验例1中的样品重量(TG)随温度变化的曲线，其中1是黄芩苷的曲线，2是实施例2的药物涂层的曲线，3是对比例1的PLGA空白膜的曲线。

图7显示的是试验例2中的黄芩苷释放曲线。

图8显示的是试验例3中不同载药量的药物涂层作用1天和3天对正常内皮细胞的影响，其中与空白膜组比较，*：p<0.05，**：p<0.01。

图9显示的是试验例3中不同载药量的药物涂层作用1天和3天对正常平滑肌细胞的影响，其中与空白膜组比较，*：p<0.05，**：p<0.01。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：

大豆卵磷脂，美国lipoid公司生产

黄芩苷，购自成都曼斯特生物科技有限公司，含量≥98％，批号：MUST-11101403；

PLGA(LA:GA＝50:50，60:40，75:25)，购自深圳市绿保生物科技有限公司。

多功能X-射线衍射仪，英国Bede科学仪器有限公司生产(型号：BeDeD1System)

实施例1一种黄芩苷磷脂复合物的制备

称取黄芩苷15g，大豆卵磷脂60g，加入无水乙醇1000mL，置于55℃恒温水浴中磁力搅拌复合2h，将反应液减压回收无水乙醇，减压干燥，将得到的固体溶解于适量氯仿，充分溶解后，过滤，滤渣用少量氯仿多次洗涤，滤液减压回收氯仿，真空干燥，即得到目标产物74.73g。按照公式1计算，包合率为98.2％。

实施例2一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例3一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的5％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.05g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例4一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的1％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.01g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例5一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝75:25。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA：GA＝75:25)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例6一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝50:50。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA:GA＝50:50)0.5g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.05g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例7一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为10000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

实施例8一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的5％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为100000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝75:25。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA:GA＝75:25)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.05g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例9一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为20000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

称取PLGA(LA:GA＝60:40)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

实施例10一种用于药物洗脱支架的药物涂层

包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量为所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为80000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸(LA):羟基乙酸(GA)＝60:40。通过如下方法制备：

对比例1PLGA(LA:GA＝60:40)空白膜

称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入与实施例2相同规格的玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

试验例1实施例2的用于药物洗脱支架的药物涂层的表征

1.膜厚度的测定

选取对比例1的PLGA空白膜和实施例2的药物涂层(PLGA载药膜)的几个局部位置，利用台阶仪测定几个局部位置的膜厚度，计算出PLGA空白膜和载药膜的平均厚度。

测定结果：PLGA空白膜的平均厚度为40.2μm；实施例2的药物涂层的平均厚度为40.4μm。

2.XRD结构分析

X-衍射扫描，需要硅片作为薄膜的基底，因此通过如下方法先制备有硅片基底的薄膜：

1)称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，加入黄芩苷磷脂复合物，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入放置有洁净硅片的玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h，得到有硅片基底的药物涂层。

2)称取PLGA(LA：GA＝60:40)1g，用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入放置有洁净硅片的玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h，得到有硅片基底的空白PLGA膜。

多功能X-射线衍射仪(型号：BeDeD1System)，Cu-K_α射线，扫描角(2θ)为10°～80°，扫描速度为10°/min，分别收集上述有硅片基底的PLGA空白膜、有硅片基底的药物涂层和黄芩苷粉末的数据，X-射线衍射图谱见图4。

图4C显示的是黄芩苷的X-衍射图，图中显示黄芩苷为晶体结构，其主要特征峰的位置在2θ＝2.5°～12.5°范围内。图4A和图4B分别为PLGA空白膜及载药膜的X-衍射图，，黄芩苷的特征峰在PLGA载药膜(药物涂层)的X-射线衍射图谱中基本消失，说明药物在PLGA膜中无团聚现象出现，可能以分子状态分散在其中。4D图为空白硅片的XRD图，其特征峰出现在2θ＝69°的位置。图4A和4B中出现在2θ＝69°位置的吸收峰为均为基底硅片的特征峰。通过上图的比较，可知黄芩苷药物在PLGA薄膜中无结晶态出现，而是以固溶态的方式存在，稳定性较好。

1.4FTIR分析

对黄芩苷粉末、对比例1的PLGA空白膜和实施例2的药物涂层采用溴化钾压片法进行红外光谱扫描分析，扫描范围4000-400cm^-1。红外光谱图见图5。

图5中，3300-3600cm^-1区域是羟基的伸缩振动峰，1930cm^-1、1850cm^-1为亚甲基上碳氢键伸缩振动峰，1740cm^-1峰为酯基中碳氧双键的伸缩振动峰。对比PLGA空白膜和实施例2的药物涂层两条曲线可以看出，振动峰的峰位及各个峰之间的相对强度无明显变化。说明载药薄膜中并无发生官能团变化。对比黄芩苷磷脂复合物(图5B)与药物涂层的红外谱图，各主要峰位无明显变化。上述结果表明PLGA与黄芩苷卵磷脂复合物之间并没有发生化学反应，说明黄芩苷卵磷脂复合物在PLGA薄膜中以物理分散状态存在，保持了药物与PLGA各自的性质。

1.5热力学(TG)行为分析

薄膜的热力学(TG)行为对薄膜的热稳定性有重要的影响。

将对比例1的PLGA空白膜、实施例2的药物涂层和黄芩苷放入热重分析系统中，升温速率为：10℃/min，温度从25℃到300℃。记录样品的热力学行为(TG)随温度的变化曲线。结果见图6。

由图可以看出，在100℃以内，材料开始出现有些的失重，这可能是溶剂的残留导致。当到达150℃时空白膜先分解，载药膜其次分解，黄芩苷复合物最后分解。这三种物质的相对热稳定性顺序为：黄芩苷复合物＞载药膜＞含卵磷脂空白膜。以上结果说明黄芩苷复合物的载入提高了PLGA薄膜的热稳定性。在体内37℃下，本发明所述药物涂层是稳定的。

通过上述参数和图谱的测定，表明黄芩苷磷脂复合物在PLGA膜中分散均匀，且不与PLGA发生化学反应，存在稳定。

试验例2本发明所述药物涂层的黄芩苷体外释放行为

试验样品：

分别按照实施例2、6和7的原料配方称取分子量60000的PLGA(50:50)、PLGA(60:40)、PLGA(75:25)各0.5g，分别用氯仿将PLGA溶解成5％(w/v)的溶液后，各加入实施例1制备的黄芩苷磷脂复合物0.05g，磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入放置有洁净硅片、相同规格的玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥48h。

试验方法：

取试验样品分别放入45ml带盖的离心管中，加入30ml释放液(pH＝7.4的PBS与乙醇的混合溶液，PBS:乙醇＝9:1(v/v))，盖上盖子，放于空气振荡浴中37℃恒温振荡，振荡频率为100rev/min，定期取样。每次用移液枪取样1m后，再用移液枪加入等体积的新鲜的PBS释放液。释放液中黄芩苷浓度用高效液相色谱(HPLC)检测。

高效液相色谱检测方法：

1)色谱条件：

色谱柱为依利特C18柱ODS(4.6mm×150mm，5μm)；理论板数按黄芩苷峰计算不得低于5500，流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液(45:55(v/v))；UV检测波长为280nm；柱温37℃，进样量20ul，流速1.0mL/min。

2)对照品溶液的配置和标准曲线的建立

精取黄芩苷对照品8.88mg置50ml棕色量瓶中，精取0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml置5ml容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度。进样量分别为20ul,以峰面积和质量浓度回归，得回归方程y＝63.517x-253.79黄芩苷的浓度在(3.63～12.10μg/ml)的范围内线性r²＝0.9993。

3)黄芩苷的测定：

取出的释放液分别稀释一定浓度至黄芩苷药物的线性范围内，测定其在280nm处高效液相的峰面积大小，根据黄芩苷的标准曲线计算出黄芩苷的浓度。

试验结果：

以取样时间点为横坐标，计算出的黄芩苷累计释放量作为纵坐标做图，得到三种样品的黄芩苷释放曲线，见图7所示。

从图7可以看出，三种样品(分别对应实施例2、6和7的药物涂层)的药物释放行为基本都是前3天有轻微的突释现象，后期释放比较平稳。在测定的一个月时间内，三种药物涂层的黄芩苷释放量都达到其治疗的有效量。

试验结论：

1.由于支架内再狭窄的发生一般在植入人体后的2-3周内，因此，上述药物涂层黄芩苷的释放行为基本与再狭窄发生的进程一致，是较理想的药物释放行为曲线。

2.三种样品的药物释放行为基本都是前3天有轻微的突释现象，后期释放比较平稳，这就减少了急性毒性等副反应发生的可能性。

3.PLGA(60:40)为载体的药物涂层整体药物释放行为最好。PLGA(50:50)和PLGA(75:25)在测定时间内释放药物的速度大于PLGA(60:40)，药物释放累积量也多于PLGA(60:40)。相比较PLGA(60:40)药物释放更平稳，

4.药物释放是一个受多种因素影响的复杂过程。

在前4天内，药物释放速度顺序为：PLGA(60:40)＜PLGA(50:50)＜PLGA(75:25)。虽然PLGA(50:50)的亲水性强，其降解速度较其他两种PLGA大，但是其释放药物的速度反而较PLGA(75:25)慢。另外，PLGA(60:40)的降解速度较PLGA(75:25)快，但是PLGA(75:25)的黄芩苷释放速度大于PLGA(60:40)。上述现象提示黄芩苷在所述药物涂层中的释放行为为受多种因素的影响，影响因素可能包括：载体材料的种类、药物的扩散系数、药物自身的性质，药物与载体材料的相容性及在载体材料中的分散状态等。

在后15天内，黄芩苷释放加快，这是由于药物前期的释放使得涂层表面出现较多的微孔，产生的微孔对后续的药物释放影响较大，随着药物累积释放量的增加，涂层中的药物含量不断减少，涂层表面的孔使药物更容易从载体材料中释放出来，载体的微孔结构使其更容易吸水溶胀，加速了载体的降解速度，这对后期药物的释放有着重要的意义。

试验例3本发明药物涂层体外对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的作用

1.MTT法测定药物涂层对内皮细胞增殖的作用

试验材料：

人脐静脉内皮细胞株(中科院上海细胞库)

药物涂层：与实施例2、3、4所述配比相同的载药量分别为10％，5％和1％的有硅片基底的药物涂层，制备方法同试验例2所述，不同的是真空干燥72小时，紫外灯消毒、灭菌。

空白PLGA膜：PLGA(60:40)0.5g，溶于适量氯仿至浓度为5％(w/v),磁力搅拌器搅拌至澄清，超声脱气后静置，倒入放置有洁净硅片的玻璃皿中，自然挥干溶剂后真空干燥72小时。

试验方法：

1)内皮细胞的培养

人脐静脉内皮细胞株，用含15％胎牛血清的DMEM高糖培养液培养，在37℃、5％的CO₂、饱和湿度下培养；用0.25％的胰蛋白酶消化传代细胞，供实验研究。

2)内皮细胞的冻存与复苏

当细胞稳定传代5-7代后，用0.25％的胰酶消化成细胞悬液，1500rpm离心5min，弃去上清液，分散细胞后用冻存液调整细胞浓度为10⁷个/ml，装到冻存管中，加1.6ml的冻存液(胎牛血清：DMSO＝10：1)，在4℃下平衡放置1h；之后在-20℃过夜；最后放到-80℃；一天后转入液氮内，冷冻保存备用。冷冻细胞复苏时，直接将冷冻存管放入37℃温水中水浴快速解冻，用4-5倍体积的含有15％胎牛血清的DMEM高糖培养液离心洗2遍，然后接种培养即可。经过传代培养2-3次，细胞活力恢复原有状态。

3)细胞计数

采用血球计数板计数法：取极少量已吹打均勻的细胞悬浮液，将其悬空滴于计数板上盖玻片的一侧，使细胞液缓慢自动地发生虹吸现象，然后在显微镜下，用40倍物镜观察计数板四角大方格中的细胞数目(细胞压中线时，只计左侧和上方细胞，不计右侧和下方细胞)。最后将计数结果代入公式4，得到细胞密度：

细胞密度＝细胞数/原液毫升数＝(4个大格细胞数总和/4)×10⁴(个/ml)(4)

本试验中，控制内皮细胞细胞悬液密度在4×10⁴-5×10⁴个/ml之间。

4)不同载药量药物涂层对内皮细胞增殖的作用

将第5-7代内皮细胞用胰酶消化，用含FBS的DMEM培养液将消化下来的细胞配成细胞悬液，细胞密度为4×10⁴-5×10⁴个/ml，随机分为5个组：①正常对照组:空白硅片；②-④试验组：载药1％、5％、10％的药物涂层；⑤空白PLGA膜组。接种于24孔板中，每组设4个平行样，分别培养24h、72h。然后每孔加MTT(5g/L)(培养基：MTT＝10:1)，4h后终止培养；弃去孔内液体，每孔加入(MTT:DMSO＝1:10)，置摇床上低速振荡10min，振荡均匀后,取200ul液体于96孔板中，放入酶标仪中读出490nm波长处的O.D.值。用酶标仪测定波长490nm处各孔的吸光度值。

试验结果：

OD值见表2和3，细胞计数结果见图8。

各组中，正常对照组的空白硅片表面内皮细胞黏附最少，增殖速度也最慢；空白PLGA膜表面细胞虽有增殖，但也相对较慢；各试验组培养1天和3天后，药物涂层表面的内皮细胞黏附明显比前两组多，且随着载药量的增加及培养时间的延长，内皮细胞数目也相应增多。

见表2和3，以及图8。

表2药物涂层作用1天对正常内皮细胞增殖的影响

注：与空白PLGA膜组比较，*p<0.05，**p<0.01。

表3药物涂层作用3天对正常内皮细胞增殖的影响

注：与空白膜组比较，*p<0.05，**p<0.01。

试验结论：

本发明所述药物涂层对内皮细胞的正常分裂和增殖具有促进作用，且呈剂量和时间依赖关系。

2.CCK8法测定药物涂层对平滑肌细胞增殖的作用

试验材料：

人主动脉血管平滑肌细胞株(上海艾研生物科技有限公司)

试验方法：

1)平滑肌细胞培养

人主动脉血管平滑肌细胞系，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液培养，在37℃、5％的CO₂、饱和湿度下培养；用0.25％的胰蛋白酶消化传代细胞，供实验研究。

2)平滑肌细胞冻存与复苏

当细胞稳定传代5～7代后，用0.25％的胰酶消化成细胞悬液，1000rpm离心5min，弃去上清液，分散细胞后用冻存液调整细胞浓度为10⁷个/ml，装到冻存管中，在4℃下平衡放置1h；之后在-20℃过夜；最后放到-80℃；一天后转入液氮内，冷冻保存备用。冷冻细胞复苏时，直接将冷冻存管放入37℃温水中水浴快速解冻，用4～5倍体积的含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液离心洗2遍，然后接种培养即可。经过传代培养2-3次，细胞活力恢复原有状态。

3)细胞计数

本实验采用血球计数板计数法：取极少量已吹打均勻的细胞悬浮液，将其悬空滴于计数板上盖玻片的一侧，使细胞液缓慢自动地发生虹吸现象，然后在显微镜下，用40倍物镜观察计数板四角大方格中的细胞数目(细胞压中线时，只计左侧和上方细胞，不计右侧和下方细胞)。最后将计算结果代入公式(3)，得到细胞密度。

4)不同载药量药物涂层对平滑肌细胞增殖作用影响

将第5-7代平滑肌细胞用胰酶消化，用含高糖DMEM培养液将消化下来的细胞配成细胞悬液，细胞密度为2×10⁴个/ml，随机分为5个组：①正常对照组:空白硅片；②-④试验组：载药1％、5％、10％的药物涂层；⑤空白PLGA膜组。接种于24孔板中，每组设4个平行样，分别培养24h、72h后每组各取一板细胞进行CCK8检测：避光加入CCK-8试剂(用DMEM按1:9稀释)，2h后终止培养；置摇床上低速振荡10min，振荡均匀后,取200ul液体于96孔板中，放入酶标仪中读出450nm波长处的O.D.值。

5)统计学分析

所有数据以()表示，用SPSS软件对所有数据进行统计学处理。样本均数的比较采用单因素方差分析，P<0.05具有统计学意义。

试验结果：

OD值见表4和5，细胞计数结果见图9。

各组中，正常对照组的空白硅片表面平滑肌细胞黏附最多，增殖速度也最快；其次是空白PLGA膜；各试验组培养1天和3天后，药物涂层表面的平滑肌细胞黏附明显较前述两组少，且随着载药量的增加及培养时间的延长，平滑肌细胞数目也相应减少。

表4药物涂层作用1天对正常平滑肌细胞增殖的影响

注：与空白PLGA膜组比较，*p<0.05，**p<0.01。

表5药物涂层作用3天对正常平滑肌细胞增殖的影响

注：与空白膜组比较，*p<0.05，**p<0.01。

试验结论：

本发明所述药物涂层对平滑肌细胞的正常分裂和增殖具有抑制作用，且呈剂量和时间依赖关系。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims

1.一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸：羟基乙酸＝60:40～75:25；所述黄芩苷磷脂复合物的质量不超过所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的3倍以上。

2.根据权利要求1所述的药物涂层，其特征在于：所述黄芩苷磷脂复合物的质量是所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％。

3.根据权利要求1所述的药物涂层，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸：羟基乙酸＝60:40。

4.根据权利要求1或2所述的药物涂层，其特征在于：所述黄芩苷磷脂复合物，大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的4倍。

5.一种用于药物洗脱支架的药物涂层，包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和黄芩苷磷脂复合物，所述黄芩苷磷脂复合物的质量是所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量的10％；其中所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的分子量为60000，乳酸单体和羟基乙酸单体的比例为乳酸:羟基乙酸＝60:40；所述黄芩苷磷脂复合物包括黄芩苷和大豆卵磷脂，其中大豆卵磷脂的质量是黄芩苷质量的4倍。

6.权利要求1至5中任一项所述的药物涂层的制备方法，包括将所述黄芩苷磷脂复合物和聚乳酸-羟基乙酸共聚物共溶于氯仿中，搅拌至澄清，静置，挥尽溶剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸共聚物在氯仿中的质量/体积百分浓度为5％～10％。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸共聚物在氯仿中的质量/体积百分浓度为5％。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法中，还包括黄芩苷磷脂复合物的制备，操作步骤包括：

按照比例称取黄芩苷和大豆卵磷脂，加入无水乙醇，无水乙醇与黄芩苷的体积质量比为50:1～80:1；40～70℃下搅拌1～3h，减压回收无水乙醇，干燥，收集所得固体，即得黄芩苷磷脂复合物。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：无水乙醇与黄芩苷的体积质量比为60:1～70:1。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：无水乙醇与黄芩苷50～60℃下搅拌2h。

12.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：黄芩苷磷脂复合物的制备还包括对上述方法制备得到的黄芩苷磷脂复合物进行纯化，具体操作为：

13.权利要求1至5中任一项所述的药物涂层或权利要求6至12中任一项所述制备方法制备得到的药物涂层在制备用于防止血管再狭窄的药物洗脱支架中的应用。

14.一种药物洗脱支架，包括权利要求1至5中任一项所述的药物涂层或权利要求6至12中任一项所述制备方法制备得到的药物涂层。