CN104083320B - 可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体为一种可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合水凝胶前体溶液。本发明是一种载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液；其中，黄原胶的质量体积百分比为0.5%~10%，甲基纤维素的质量体积百分比为3%~20%；药物为小分子药物或大分子药物。该复合水溶液在室温条件下处于高粘度状态，具有良好的剪切变稀和快速恢复的可注射性能。当高粘度的复合水溶液注射至体内时，复合溶液在37℃体温条件下表现出快速凝胶化性能，形成的复合水凝胶具有良好的力学性能、生物相容性、生物降解性和药物缓释效果。载药黄原胶/甲基纤维素复合水凝胶在输送药物方面具有广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有剪切变稀和热致凝胶化性能的可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液及其制备方法。
背景技术
可注射型水凝胶由于具有操作简单，力学性能可控，可填充不规则缺陷以及可以非侵入方式注射到特定的组织和部位等优点，在药物传递，细胞封装以及组织工程等生物医学领域具有广泛的应用。其中，具有剪切变稀性质的水凝胶或高粘度凝胶前体溶液在剪切力作用下处于低粘度的流体状态，当剪切停止时能够迅速恢复至原先的水凝胶或高粘度溶液状态。这一特征使得剪切变稀可注射型水凝胶可以有效地避免注射后渗漏至邻近组织，避免包载药物的大量流失。
黄原胶是一种由Xanthomonas campestris 发酵产生的阴离子胞外多糖。黄原胶由线性（1-4）-β-D-葡萄糖连接的主链以及每隔两个葡萄糖残基连接的带负电荷的三糖侧链组成[Soft matter, 2013, 9, 3063-3073.]。黄原胶在水溶液中具有两种不同的构象：较低温度下是有序的双股螺旋构象，较高温度下是无序结构构象；从有序结构到无序结构的转变温度依赖于溶液的离子强度，一般在40~50℃[Biomacromolecules, 2014, 15,1160-1170.]。由于黄原胶分子链之间的氢键作用，低浓度的黄原胶溶液表现出弱凝胶性质并且具有剪切变稀性质。黄原胶分子链间的聚集行为可以通过溶液的黄原胶浓度、离子强度和温度进行调控[Soft matter, 2013, 9, 3063-3073.]。
甲基纤维素是甲基化疏水修饰的纤维素衍生物，具有良好的生物相容性[Macromolecules, 2013, 46, 300-309.]。当每个葡萄糖单元的甲基取代度在1.6 ~ 2.1之间时，甲基纤维素表现出反相温度凝胶化性质[Biomacromolecules, 2013, 14, 2484-2488.]，其水溶液的反相凝胶转变温度与溶液中的甲基纤维素浓度有关。单独的甲基纤维素温敏性水凝胶不能作为注射型水凝胶使用。
通过物理共混的方法制备复合水凝胶具有制备简单、可以结合不同组分和不同性能的优点。但是，我们还没有发现利用黄原胶和甲基纤维素制备可注射型载药水凝胶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有剪切变稀和热致凝胶化性能的可注射型载药复合溶液和复合水凝胶及其制备方法。
本发明提供的可注射型载药复合溶液，是一种载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液，溶剂为磷酸缓冲液；其中，黄原胶的质量体积百分比（w/v%）为0.5% ~ 10%，甲基纤维素的质量体积百分比（w/v%）为3% ~ 20%。所述药物包括小分子药物和大分子药物，小分子药物如抗肿瘤药物，大分子药物如蛋白质药物。
本发明提供的可注射型载药复合溶液的制备方法，具体步骤如下：
（1）将甲基纤维素与黄原胶在磷酸缓冲液中充分溶解和混合，得到黄原胶/甲基纤维素复合溶液；
（2）将药物溶解或者分散在黄原胶/甲基纤维素复合溶液中，即得到载药复合溶液。
上述载药复合溶液可在35 ~ 40℃温度（即人或动物体温）条件下原位快速形成复合水凝胶。也即在室温条件下将上述载药复合溶液注射到动物或者人体内，复合溶液在体温（如37℃）条件下原位快速形成复合水凝胶。
本发明的载药复合溶液中，所述黄原胶的质量体积百分比为0.5% ~ 10%；所述甲基纤维素的质量体积百分比为3% ~ 20%；
所述药物包括小分子药物和大分子药物，小分子药物如抗肿瘤药物但是不局限于抗肿瘤药物，大分子药物如蛋白质药物。
本发明提供的复合水溶液具有剪切变稀和热致凝胶化性能。在室温条件下，由于黄原胶的有序双股螺旋结构导致载药黄原胶/甲基纤维素复合水溶液具有高粘度性质并具有剪切变稀的可注射性能和快速恢复性能。当高粘度的复合水溶液注射至体内时，由于（37℃）体温高于甲基纤维素的热致凝胶温度，复合水溶液在体温条件下快速凝胶化形成固体的水凝胶。得到的载药黄原胶/甲基纤维素复合水凝胶具有良好的力学性能、生物相容性、生物降解性、药物缓释和治疗效果。
附图说明
图1为本发明载药黄原胶/甲基纤维素复合水溶液和载药黄原胶/甲基纤维素复合水凝胶的性能。其中， (A) 高粘度黄原胶（XG）/甲基纤维素（MC）复合物溶液在23℃条件下的多步触变剪切速率扫描，其中低剪切速率为0.1 s-1，高剪切速率为10 s-1; (B) XG/MC复合水凝胶在37℃条件下的多步触变剪切速率扫描，其中低剪切速率为0.5 s-1，高剪切速率为500 s-1。
图2为负载不同浓度胰岛素的XG2/MC10复合水凝胶在37℃磷酸缓冲液中的累积释放曲线。
图3为载不同浓度阿霉素的XG2/MC10复合水凝胶在37℃磷酸缓冲液中的累积释放曲线。
图4为 XG2/MC10复合溶液注射至雄性SD大鼠体内1天和5周以后的凝胶状态。
具体实施方式
实施例1. XG/MC复合溶液的制备。将15 mL 磷酸缓冲液（10 mmol/L pH 7.4磷酸缓冲液 + 0.15 mol/L NaCl）加入到50 mL烧杯中并置于80℃水浴中预热5分钟，然后将2.5g甲基纤维素（MC）粉末缓慢加入到80℃的磷酸缓冲液中并保持快速搅拌。待甲基纤维素粉末完全浸润之后将溶液冷却至室温，再次加入10 mL 磷酸缓冲液搅拌均匀，然后将溶液转移至4℃冰箱中继续搅拌过夜使甲基纤维素充分溶解。将0.5 g黄原胶（XG）粉末加入到上述甲基纤维素溶液中，在4℃条件下快速搅拌过夜使黄原胶充分溶解，然后在4℃条件下温和搅拌24小时接着低速离心除去体系中的气泡即得到黄原胶/甲基纤维素（XG2/MC10）复合溶液。通过此方法制备表1所示的一系列不同浓度的黄原胶/甲基纤维素（XG/MC）复合物溶液，并利用旋转流变仪（HAAKE MARS）对各复合物溶液的凝胶性能进行表征。所有的流变测试都在样品的线性粘弹区域内进行，所设置的频率为10 rad/s，应力为5 Pa。通过流变测试得到了各种XG/MC复合物溶液的凝胶转变温度以及在37℃条件下的凝胶化时间，结果在表1列出。与单独的MC溶液相比，XG/MC复合物溶液具有更低的凝胶转变温度，在37℃条件下具有更短的凝胶化时间，即XG/MC复合物溶液在37℃条件下表现出快速凝胶化性质。表2的弹性模量和损耗模量数据表明在37℃条件下XG/MC复合水凝胶比单独的XG或MC水凝胶具有更高的弹性模量，即XG/MC复合水凝胶具有更好的力学性能。
表1. 具有不同黄原胶（XG）和甲基纤维素（MC）浓度的黄原胶/甲基纤维素（XG/MC）复合物溶液的凝胶转变温度以及在37℃条件下的凝胶化时间。
表2.不同XG/MC复合水凝胶样品在37℃条件下的凝胶力学性能。测试频率为10rad/s，应力为5 Pa。
实施例2. XG/MC复合物溶液的制备。将15 mL 磷酸缓冲液加入到50 mL烧杯中并置于80℃水浴中预热5分钟，然后将2.5 g MC粉末缓慢加入到80℃磷酸缓冲液中并保持快速搅拌，待MC粉末完全浸润之后将溶液冷却至室温，再次加入10 mL 磷酸缓冲液，紧接着将0.5 g XG粉末加入到上述MC分散液中，室温搅拌至共混溶液的粘度非常大以后将溶液转移到4℃冰箱中冷却，然后在4℃条件下搅拌24小时使XG和MC充分溶解，最后通过低速离心除去体系中的气泡即得到黄原胶/甲基纤维素（XG2/MC10）复合物溶液。利用此方法也可以制备表1所示的一系列不同浓度的XG/MC复合物溶液。
实施例3. 利用旋转流变仪对XG/MC复合物溶液和XG/MC复合水凝胶的可注射性能进行研究。对XG/MC复合物溶液在23℃（室温条件）和XG/MC复合水凝胶在37℃（人体温度条件）实施了多步触变速率扫描用于表征剪切前后的触变恢复性能，图1为实验结果。其中，在室温条件下的低剪切速率（low shear）为0.1 s-1，保持时间为2 分钟（min），高剪切速率（high shear）为10 s-1，保持时间为1 min；在体温条件下的低剪切速率为0.5 s-1，保持时间为2 min，高剪切速率为500 s-1，保持时间为1 min。图1的实验结果表明XG/MC复合物溶液在室温条件下具有高粘度性质，在体温条件下是水凝胶，二者都具有很好的剪切变稀性能和快速恢复性能，证明了XG/MC复合物溶液可以在室温条件下注射到体内，在体温条件下可以原位快速形成水凝胶。
实施例4. 用模拟体液的方法对XG/MC复合水凝胶进行体外降解研究。具体实验如下：将1 mL XG/MC复合物溶液置于试管底部后将试管放入37℃水浴中平衡30 min使XG/MC充分凝胶化，然后在试管中加入3 mL 37℃磷酸缓冲液并每天按时更换缓冲液，待水凝胶在缓冲液中经过特定的时间降解以后将残余的水凝胶冻干并称重。水凝胶的质量剩余率（%）= 经过特定时间降解的水凝胶质量（干重）/初始的水凝胶质量（干重）× 100%。表3是体外降解实验的结果，数据表明单独的XG在体外不能降解而MC可以降解，由于XG/MC复合水凝胶中XG的含量较少，XG/MC复合水凝胶的体外降解速率接近于单独的MC水凝胶降解速率。
表3. XG/MC复合水凝胶和MC水凝胶在37℃磷酸缓冲液中浸泡不同时间以后的质量残余率。
| 样品 | XG3/MC0 | XG3/MC12 | XG2/MC10 | XG0/MC12 | XG0/MC10 |
| 0天 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 8天 | 105±1.6 | 74±1.7 | 81±2.4 | 78±1.3 | 75±0.6 |
| 16天 | 104±0.2 | 67±1.0 | 76±0.7 | 73±0.3 | 70±1.5 |
| 34天 | 104±2.9 | 51±1.3 | 58±0.5 | 56±1.3 | 58±2.4 |
| 44天 | 104±2.7 | 47±3.0 | 57±1.3 | 55±2.5 | 54±2.2 |
实施例5. 负载胰岛素的XG/MC复合物溶液制备。首先根据实施例1或实施例2制备XG/MC复合物溶液，然后在4℃条件下将XG/MC复合物溶液与胰岛素溶液混合均匀后静置48小时，通过低速离心除去体系中的气泡即得到负载胰岛素的XG/MC复合物溶液。在复合物溶液中胰岛素的浓度为0.4 mg/mL ~ 2.0 mg/mL。对负载2.0 mg/mL胰岛素的XG2/MC10复合物溶液进行流变性能测量，结果表明其凝胶转变温度为33℃，在37℃条件下的凝胶化时间为65秒，证明了负载蛋白质药物胰岛素后对XG/MC复合物溶液的凝胶性能影响很小。
实施例6. 负载阿霉素的XG/MC复合物溶液制备。首先根据实施例1或实施例2制备XG/MC复合物溶液，然后在4℃条件下将XG/MC复合物溶液与阿霉素溶液混合均匀后静置48小时，通过低速离心除去体系中的气泡即得到负载阿霉素的XG/MC复合物溶液。在复合物溶液中阿霉素的浓度为0.4 mg/mL ~ 2.0 mg/mL。对负载2.0 mg/mL阿霉素的XG2/MC10复合物溶液进行流变性能测量，结果表明其凝胶转变温度为32.5℃，在37℃条件下的凝胶化时间为61秒，证明了负载小分子药物阿霉素后对XG/MC复合物溶液的凝胶性能影响很小。
实施例7. 对负载不同浓度胰岛素的XG2/MC10复合水凝胶进行体外释放研究。方法如下：于试管底部加入1 mL负载不同浓度胰岛素的XG2/MC10复合物溶液后，将试管置于37℃水浴中平衡30 min使复合物溶液充分凝胶化。在试管中加入10 mL 37℃磷酸缓冲液，经过特定时间后取出3 mL磷酸缓冲液并进行胰岛素浓度分析，在试管中再补加3 mL新鲜的37℃磷酸缓冲液。胰岛素浓度采用PierceTMBCA 蛋白分析试剂盒进行测量，胰岛素工作曲线通过测量一系列胰岛素标准溶液制作。图2是复合水凝胶体外释放胰岛素的实验结果，证明了负载胰岛素的XG2/MC10复合水凝胶具有很好的缓释效果并且胰岛素的释放量与水凝胶中的初始胰岛素浓度有关。
实施例8. 对负载不同浓度阿霉素的XG2/MC10复合水凝胶进行体外释放研究。方法如下：于试管底部加入1 mL负载不同浓度阿霉素的XG2/MC10复合物溶液后，将试管置于37℃水浴中平衡30 min使复合物溶液充分凝胶化。在试管中加入10 mL 37℃磷酸缓冲液，经过特定时间后取出3 mL磷酸缓冲液并进行阿霉素浓度分析，在试管中再补加3 mL新鲜的37℃磷酸缓冲液。阿霉素浓度通过480 nm处的吸光度测量，阿霉素工作曲线通过测量一系列阿霉素标准溶液制作。图3是复合水凝胶体外释放阿霉素的实验结果，证明了负载阿霉素的XG2/MC10复合水凝胶具有很好的长期缓释效果。
实施例9. 对XG2/MC10复合物溶液的可注射性、在动物体内的凝胶化、生物相容性和生物降解性进行研究。方法如下：在室温条件下使用带23G针头的注射器经皮下将XG2/MC10 复合物溶液0.5 mL注射到雄性SD大鼠（220 g）的背部，对注射后的大鼠正常提供食物和水，经过不同时间饲养后将大鼠处死，手术切开复合物溶液的注射部位进行水凝胶形态和体积观察并拍照。图4的结果表明XG2/MC10复合物溶液注射到大鼠体内后形成了固体状形态的水凝胶；5周后大部分的水凝胶消失，说明水凝胶在体内具有良好的生物降解性。图4的结果还表明在水凝胶周围没有红肿等炎症现象出现，表明XG2/MC10复合水凝胶在动物体内具有良好的生物相容性。
实施例10. 负载胰岛素的XG2/MC10复合水凝胶对糖尿病大鼠的治疗效果评价。具体实验如下，雄性SD大鼠（约220 g）禁食一夜后在腹腔注射40 mg/mL四氧嘧啶溶液（溶解于生理盐水中）破坏大鼠的胰岛β细胞，注射剂量为200 mg/kg。注射之后禁食1小时后正常给食，4天之后利用血糖仪（ACCU-CHEK Active Kit, Roche Diagnostics, Mannheim,Germany）筛选出血糖大于300 mg/dL的糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠随机分为四组，每组6只，分别进行如下实验。水凝胶组1：在大鼠背部皮下注射1 mL XG2/MC10复合物溶液；水凝胶组2：在大鼠背部皮下注射1 mL负载0.4 mg/mL 胰岛素的XG2/MC10复合物溶液；水凝胶组3：在大鼠背部皮下注射1 mL负载0.8 mg/mL 胰岛素的XG2/MC10复合物溶液；水凝胶组4：在大鼠背部皮下注射1 mL负载1.2 mg/mL 胰岛素的XG2/MC10复合物溶液。注射以后每天定时在尾部采血检测血糖。表4是各实验组的糖尿病大鼠注射负载胰岛素的XG2/MC10复合物溶液以后的血糖值。与水凝胶组1相比，载胰岛素水凝胶组都表现出明显的降血糖的效果，一次注射可以维持药效6 ~ 7天。
表4. 患糖尿病雄性SD大鼠注射负载不同浓度胰岛素的XG2/MC10复合物溶液以后的血糖变化
。
Claims (3)
1. 一种可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液，其特征在于是一种载药黄原胶、甲基纤维素复合溶液；其中，所述黄原胶的质量体积百分比为0.5% ~ 10%，甲基纤维素的质量体积百分比为3% ~ 20%；所述药物为小分子药物和/或大分子药物。
2.根据权利要求1所述的可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液，其特征在于所述小分子药物为抗肿瘤药物，所述大分子药物为蛋白质药物。
3.一种如权利要求1所述的可注射型载药黄原胶/甲基纤维素复合溶液的制备方法，其特征在于具体步骤为：
（1）将甲基纤维素与黄原胶在磷酸缓冲液中充分溶解和混合，得到黄原胶/甲基纤维素复合溶液；
（2）将药物溶解或者分散在黄原胶/甲基纤维素复合溶液中，即得到载药复合溶液。
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