CN104080928A - 用于诊断和/或预后妇科癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种体外用于诊断受试者上皮性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌和/或倾向于患有上皮性卵巢癌的方法，所述方法包括在受试者样本中确定MDS1和EVI1复合(MECOM)基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是受试者患有上皮性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌透明细胞肾癌和/或倾向于患有上皮性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌透明细胞肾癌和/或确定受试者的卵巢癌是原发性还是继发性卵巢癌和/或手术治疗后疾病进展的风险，和/或手术后化疗有效性的指示。

Description

用于诊断和/或预后妇科癌症的方法

技术领域

本发明涉及用于诊断和/或预后受试者癌症的方法，尤其涉及但不限于通过分析MDS1和EVI1复合基因座(也称为MECO基因座)来诊断和/或预后受试者癌症的方法。

背景技术

癌症是世界上导致癌症(死亡)的主要原因之一。卵巢癌、宫颈癌和其他癌都是影响全球女性的很常见的癌症。在所有影响女性的癌症中，上皮性卵巢癌(EOC)在世界上的女性癌症死亡率中排名第五，在年龄组40-59岁中排名第四，总的来说患有EOC的女性5年存活率仅有46％。尽管如此，这是外科手术技术的进步，并且出现了更定向的治疗法如贝伐单抗(bevacizimab)。低存活率被解释为是由于在早期阶段缺乏对EOC的诊断，显著数量的患者多年来对化疗产生抗性，并且对于晚期的难治愈的疾病缺乏有效的治疗。如果在疾病的早期得出EOC诊断，则5年存活率将提高到95％。

EOC包括3种主要的组织学亚型:浆液型、粘蛋白型和子宫内膜型。浆液型EOC包括浆液性脑瘤、浆液性良性囊腺瘤、带有上皮细胞增殖活性和核异常但没有浸润的破坏性生长(低潜力或临界恶性)的浆液性囊腺瘤以及浆液性囊腺癌。粘蛋白型EOC包括粘蛋白性囊瘤、粘蛋白性良性囊腺瘤、带有上皮细胞增殖活动和核异常但没有浸润的破坏性生长(低潜力或临界恶性)的粘蛋白性囊腺瘤，以及粘蛋白性囊腺癌。子宫内膜型EOC包括子宫内膜性肿瘤(与子宫内膜中的腺癌相似)、子宫内膜良性囊肿、带有上皮细胞增殖活动和核异常但没有浸润的破坏性生长(低潜力或临界恶性)的子宫内膜肿瘤，以及子宫内膜腺癌。还存在两种另外的较不普遍的组织学亚型：透明细胞和未分化的细胞。

EOC也可以通过“阶段”分类，这取决于它们在卵巢外扩散有多远。因此，阶段I被定义为将卵巢癌限制在一个或两个卵巢中。阶段II被定义为卵巢癌已经扩散至盆腔器官(例如子宫、输卵管)，但还没有扩散至腹部器官。阶段III被定义为卵巢癌已经扩散至腹部器官或淋巴系统(例如盆腔或腹部淋巴结、肝脏上、肠上)。最后，阶段IV被定义为卵巢癌已经扩散至远端位点(例如肺，肝脏内部，、脑、颈部淋巴结)。

EOC还可以根据癌细胞的外观分级。低级(或1级)意思是癌细胞看起来非常像卵巢的正常细胞；它们通常生长缓慢且不太可能扩散。中级(或2级)意思是细胞比低级细胞看起来更异常。高级(或3级)意思是细胞看起来非常异常。它们可能生长更快且更有可能扩散。

因此，EOC和大多数其他癌一样是复杂的异质性疾病，受多种遗传和表观遗传改变的影响和控制引起地增强型攻击性表型。现在公认的是，单个肿瘤的特性及其生命过程由于时间推移导致获得了多个体细胞突变(例如TP53、PTEN、RAS)和主体对环境因素做出的持续性演变的反应。从治疗的观点来看，EOC被考虑为是最佳地复杂的与在肿瘤表型、疾病结果和响应于治疗中表现出极大地天然异质性的疾病相关的集合。

因此，主要的挑战是确定和彻底地验证可以准确描述归于EOC异质性的诊断性和预后性的生物标记。另外，需要准确的预测性生物标记以指导现行的治疗规程，并指导新的靶向治疗的开发和应用。CA-125(MUC16，癌抗原125)蛋白是目前所认为的最好的上皮性卵巢癌的诊断标记。然而，MUC16检测的真阳性比率只占阶段I的EOC患者的50％左右，而对于阶段I-IV的患者真阳性返回到80％以上。大约25％的EOC尤其是在早期阶段不产生可靠检测的CA-125，因此它在临床条件中的应用是有限的。有报道称，在90％以上的EOC中CA-125被推荐与人附睾蛋白4(HE4)联合使用。如此不好的预后性统计数据表明，迫切需要提高对潜在的EOC的分子机制的了解，以便开发出更好的预后和预测分析，以及确定新的治疗靶向。

目前，大约有15种致癌基因对于卵巢癌被认为是尤其重要的，这15种致癌基因中包括EVI1在内的11种致癌基因已被示出在肿瘤细胞基因组中扩增。由位于3q26基因区域的MECOM基因座(EntrezGenelD:2122)编码的原癌基因EVI1(异位病毒整合位点1)在许多癌症中扩增。EVI1蛋白被认为是进化上保守的转录因子，所述转录因子在人类和小鼠之间共享94％的氨基酸序列同源性。在成人组织中，EVI1蛋白在肾、肺、胰腺、脑和卵巢中高度表达。在小鼠胚胎中，EVI1蛋白在泌尿系统、肺和心脏中高度表达，且其活性对于胚胎发育是非常重要的。大多数的EVI1研究描述了其在病理学中的重要性。如果在血细胞中过度表达，已显示出EVI1产生了若干的可变剪接转录，并导致包括骨髓性白血病的各种造血系统疾病。已发现EVI1在高达21％的患有急性髓细胞样白血病(AML)的患者的血液中过度表达。在4％的AML病例中基因区域3q异常。不管MECOM基因座的单独扩增，EVI1的高度表达最近被发现是卵巢癌患者的显著存活因子。基因区域3q25-27在各种器官(如卵巢癌、宫颈癌、肺癌、食道癌、结肠癌、头颈部和前列腺)的癌症中扩增。MECOM的扩增也与EOC的化疗抗性有关。

然而，有关MECOM基因座在卵巢癌发展中的作用的信息一直是矛盾的。在最近的研究中，对比不同类型的正常组织，虽然在浆液性卵巢癌组织、输卵管伞端和良性肿瘤中检测出EVI1的明显的高度表达，但是在OVCAR8细胞培养(JazaeriAA，2010)的测试中，没有揭露EVI1转录表达对肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡或双链DNA断裂没有影响。在另一个研究报道中称，MECOM基因座的扩增可能与卵巢癌的有利的患者预后相关(Nanjundan等,2007)。

因此，仍然有必要确定EVI1是否可以用作EOC诊断中的生物标记以及找到EOC的诊断和预后的改进方法。

发明内容

目前，用于检测EOC的标记在大规模人群的应用中(尤其是在卵巢癌的早期阶段)缺乏足够的灵敏度和特异性。本发明试图通过提出MECOM基因座及其包括非限制性例子的基因来填补这一空白，EVI1和/或MDS1比MUC16以及其它被广泛接受的生物标记是更敏感和更具特异性的诊断标记。特别地，本发明涉及识别临床上不同子组的EOC患者的以下几个方面之一的区别特征：

-卵巢肿瘤的原发性起源(原发性EOC相对于继发性转移)，

-卵巢癌的存在，

-肿瘤的恶性潜能，

-患者的存活预后，和

-治疗的有效性。

在肿瘤样本中综合分析至少一个来自MDS1和/或EVI1复合基因座(也称为MECOM基因座)的基因的DNA拷贝数差异和/或基因表达水平实现患者组的识别。MECOM基因座的DNA拷贝数值及EVI1和MDS1基因表达水平的截断值分别被获得用于MECOM基因座的基因：EVI1和MDS1，所述的EVI1和MDS1基因属于通过选择标准最大程度地分开患者组的这一基因座。

特别地，单个患者的诊断过程可包括以下步骤：

-获得肿瘤样本材料；

-测量EVI1和/或MDS1基因的DNA拷贝数值；

-测量EVI1和/或MDS1基因的基因表达水平(使用mRNA的非限制性例子)；

-分别对比在上述步骤测量中获得的值与所述DNA拷贝数和/或表达截断值。

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平(使用mRNA的非限制性例子)；和/或

(ii)MECOM基因座中至少一个基因的DNA拷贝数值；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个DNA拷贝数截断值的DNA拷贝数表明受试者患有EOC，或倾向于患有EOC，或所述受试者的存活预后或对所述受试者治疗的有效性。

根据另一个方面，提供了选自由SEQ ID NO：1-3、片段、衍生物，变体和它的互补序列组成的核苷酸序列。

根据其它方面，本发明提供了使用根据本发明的任何方面所述方法的试剂盒、计算机程序和计算机系统。

附图说明

图1是示出了MECOM基因座基因的EVI1基因表达相对于正常的上皮细胞在卵巢癌细胞中大幅上升的图表。横轴-在EOC阶段I-IV中个体患者的EOC组织样本和非癌性妇科疾病患者的正常卵巢组织。纵轴-MDS1和EVI1表达微阵列信号。

图2是四个图表(A-D)，其中，图A和B示出了MECOM基因座的基因表达微阵列信号相互组合以及与区别正常和癌变的卵巢上皮细胞的MUC16相组合，所述MUC16比当前临床上使用的最佳生物标记组合MUC16-WFDC2(C)更好。图D为MECOM基因座基因EVI1与当前最好的临床诊断标记WFDC2和MUC16的ROC曲线比较。

图3是图表(A-B)，所述图表示出了MECOM基因座的EVI1和MDS1基因在区别卵巢中原发性EOC肿瘤和乳腺癌转移(A)以及LMP和恶性肿瘤(B)的诊断上比许多传统的生物标记更加敏感性和更具特异性。给出了微阵列表达值累积分布曲线。

图4是两个图表，所述图表示出了MECOM基因座的基因EVI1和MDS1的表达水平的组合对于卵巢中原发性EOC肿瘤和乳腺癌转移(A)以及LMP和恶性肿瘤(B)的诊断是非常重要的。给出了微阵列表达值。

图5是示出了MECOM基因座的基因EVI1在卵巢原发性EOC肿瘤和乳腺癌转移(A)以及LMP和恶性肿瘤(B)的诊断中与许多传统生物标记中最具敏感性和特异性的临床所使用的生物标记WFDC2和MUC16相比是更具有敏感性和特异性的生物标记的图表。给出了微阵列表达值的ROC曲线。

图6是示出了EVI1和ERBB家族基因表达的组合是原发性EOC的最敏感的生物标记之一的图表。给出了微阵列表达值。

图7是在3号染色体上DNA拷贝数变化的示意图，这表明MECOM基因座的3'末端在EOC肿瘤细胞的基因组中是最强的基因扩增热点。

图8是图表(A-D)，该图表示出A)MECOM基因座的扩增连同它的基因EVI1和MDS1的表达一起与许多传统生物标记相比是EOC患者存活预后的强有力的信号；B)EVI1和MDS1基因拷贝数值的分布；C)通过DNA拷贝数与EVI1和MDS1的表达值的组合预测的存活预后的最优值Pmin；D)给出的最强存活预后的最优值对于EVI1和MDS1基因扩增的患者子组是不同的，在这些患者子组内这两个基因的预后值更强。

图9是示出了EVI1在短期预后时间周期(手术治疗后多达300天)用于区分预后不良与预后良好患者的有力标记的图表。从左到右所列举的是：DNA拷贝数、微阵列表达以及通过EVI1和MDS1基因表达所划分的患者的存活曲线。

图10是示出了EVI1在中间预后时间周期(手术治疗后多达1500天)用于区分预后不良与预后良好患者的略为显著的标记的图表。从左到右所列举的是：DNA拷贝数、微阵列表达以及通过EVI1和MDS1基因表达所划分的患者的存活曲线。

图11为示出了应答队列的原发性治疗应答结果患者组组成(患者应答分数)与EVI1和MDS1拷贝数分位数值Q相关性的列线图。所述列线图被用于治疗结果的预测。选择接近相关性的线性方程，但其他类型的方程也是有可能的。

图12是图表(A-B)，所述图表示出了基于A)无辅助化学治疗的患者B)接收辅助化学治疗的患者的EVI1和MDS1基因表达的辅助治疗结果预测可能性。给出拷贝数和微阵列表达值。

图13是使用MECOM基因座拷贝数与原发性治疗应答结果的EVI1和MDS1表达值的组合用于强大存活预后方法的示意图。

图14是示出了在给定的限定周期具有预后良好和预后不良的患者的MECOM拷贝数分布之间的差异P-值与时间限制具有强正相关性的图表。

图15是图表(A-C)，所述图表示出了原发性治疗应答与患者最后一次随访时间呈强相关性(A)，其中反之，与区分预后良好和预后不良患者的EVI1(B)和MDS1(C)基因表达的P-值具有相关性。

图16是图表(A-C)，所述图表示出了当用于对原发性治疗有完全应答的患者(“完全应答”组)且与包含显示出部分应答、稳定性疾病或进展性疾病(“不完全应答”)患者的组合组相比较时，EVI1和MDS1转录是显著的预后因素。A)“完全应答”(黑点)和“不完全应答”(灰点)的EVI1和MDS1基因表达值的累积分布函数。B)EVI1和MDS1拷贝数和表达值作为对原发性治疗完全应答患者的存活预后标记。C)EVI1和MDS1拷贝数(MECOM基因座)和表达值作为对原发性治疗、稳定性疾病或进展性疾病部分应答的患者的存活预后标记。

图17是示出了基于MECOM基因拷贝数数据的用于原发性治疗结果预测和与患者存活预后相关的算法图表。1)确定EVI1基因拷贝数的分位数(Q)；2,3)确定基于Q的预期患者队列组成；4,5,6)确定每个患者队列的预期随访时间；7)评估最有可能的存活时间以及每种治疗结果情况的应答(对治疗的完全，部分或无应答)。

图18是图表(A-C)，所述图表示出了EVI1表达在新辅助化学治疗的预处理患者的肿瘤中与术前未处理的患者的肿瘤相比是明显不同的。EVI1表达通过探针组1881_g_at(A和C)和1882_g_at(B)进行测量[HG_U95Av2校正基因组，PSL(2.3MB，9/28/06]。正如所看到的，这些结果在新辅助化学治疗后的患者的肿瘤中是明显不同的。

图19是图表(A和B)，所述图表示出了EVI1表达在良性(腺瘤)和恶性(卵巢癌)卵巢肿瘤中是明显不同的。EVI1表达通过探针组1881_g_at(A)和1882_g_at(B)进行测量。

图20是图表(A和B)，所述图表示出了EVI1表达在宫颈癌肿瘤中与正常宫颈上皮细胞相比是明显不同的。列出了EVI1(探针221884_at)表达值(A)和它们的累积分布(B)。

图21是图表(A，B和D)，所述图表示出了EVI1和MDS1表达在子宫内膜异位肿瘤相对于正常的子宫内膜是明显不同的。A，B-EVI1(探针221884_at)表达。C，D-MDS1(探针208434_at)表达。表达值(A，C)以及EV71和MDS1累积分布分别表现在图表B和D中。

图22是图表(A和B)，所述图表示出了EVI1表达在透明细胞肾癌肿瘤中相比于正常肾脏上皮细胞是明显不同的。列出了EVI1(探针221884_at)表达值(A)和它们的累积分布(B)。

图23是图表(A，B和C)，所述图表示出了通过测量EVI1表达的引物(EVI1-For和EVI1-rev)能够将卵巢癌肿瘤从具有100％特异性和敏感性的卵巢表面上皮细胞中区分开，并能够用于患者的存活预后。A)通过卵巢癌阶段测量的EVI1表达的qPCR倍数变化(相对于正常卵巢表面上皮细胞，“N”)的分布；B)倍数变化分布以及比较每个阶段((I-IV)的卵巢癌肿瘤与卵巢表面上皮细胞(N)的P-值；C)存活患者的累积分数通过带有倍数变化截断16.76的EVI1表达测量值显著区分；已给出Cox比例存活模型的P-值。粗灰线表示EVI1表达高于截断值的预后不良组的存活(情况)。

具体实施方式

为了方便起见，本说明书中提及的参考书目以参考文献一览表的形式列出，并将其添加在这些实施例的末尾。这些参考书目的全部内容通过引用并入本文。

定义

为方便起见，在本说明书、实施例和从属权利要求中使用的某些术语均集于这里。

术语“适体”(aptamer)在本说明书中定义为结合到特异性靶向分子的寡聚核酸或肽分子。特别地，在本发明中所使用的适体可以使用本领域中已知的不同技术产生，所述技术包括但不限于通过指数式富集法(SELEX)等的配体的系统演化。

术语“包含”(comprising)在本说明书中定义为各种组分、成分或步骤可以联合用于实施本发明。因此，术语“包括”涵盖了更严格的术语“基本上由...组成”(consisting essentially of)和“由…组成”(consisting of)。其中，术语“基本上由...组成”被理解为根据本发明的任何方面所述的方法“大体上”包括将指定的步骤作为“必要的”元素。可以包括附加的步骤。

两组患者之间的术语“差异”(difference)在本说明书中定义为两个组别内患者的划分的统计显著性(p-值)。因此，实现了“最大差异”是指发现了最大统计显著性(即最小的p-值)的分区。

术语“标记(label)”或“标记内含部分(label containing moiety)”是指可检测部分，如放射性同位素或含有相同的放射性同位素的基团以及非放射性标记，例如酶、生物素、亲和素、链霉亲和素、异羟基洋地黄毒苷、发光试剂、染料、半抗原等等。发光试剂取决于激发光源，可以归类为无线发光、化学发光、生物发光以及光致发光(包括日光和磷光)。本文所述的探针能够被结合，例如，化学结合至标记内含部分，或者能够适用于这样的结合。该探针能够直接或间接地被标记。

术语“基因座(locus)”在这里定义为基因上基因或DNA序列的特定位置。在给定基因座的DNA序列的变体称为等位基因。已知的特定基因组轨迹的有序列表被称为基因地图。基因地图是确定用于特定的生物学特性的基因座的过程。例如，所述MECOM基因座包括至少两个基因MDS1和EVI1，其表达导致了至少两种相应的转录物的转录，即mRNA变体的转录。该两种转录物可以是较长的MDS1的转录和较短的EVI1的转录。特别的，MECOM基因座的序列可以包括SEQ ID NO：10。

依据RefSeqNCBI数据库中提供的定义，术语“MECOM基因座”在这里被定义为“MDS1和EVI1复合基因座(MECOM)”或“MDS1和EVI1复合基因座”(UnigeneHs.659873)，且基本上可以通过基因组坐标hg18.chr3:170,283,981-170,864,257(SEQ ID No:10)以及通过它的非限制的最长转录物NM_004991.3)SEQ ID NO:4，NM_001205194.1(SEQ ID NO:5)，NM_001105078.3(SEQ ID NO:11)，NM_001105077.3(SEQ ID NO:12)，NM_005241.3(SEQ ID NO:13)，NM_001164000.1(SEQ ID NO:14)，NM_001163999.1(SEQ ID NO:15)等等进行特征描述。这七种亚型的序列可以通过依据本发明的任意方面的探针被靶向。本发明的探针可以检测到这些亚型，并在其他细胞中发现的其他亚型。

术语“拷贝数(CN)值”或“DNA拷贝数值”在这里定义为是指基因组中至少一个DNA片段(基因座)的拷贝的数量。基因组包括DNA片段，所述DNA片段可以在单一碱基对尺寸的小片段到覆盖有一个基因以上的大的染色体片段的范围内变动。这一数值可以用于测量DNA结构的变异，例如在细胞或细胞组的给定的基因组片段中发生的插入、缺失和易位。特别的，CN值可以通过本领域中的若干已知方法在细胞或细胞组中进行检测，所述方法包括但不限于比较基因组杂交(CGH)微阵列、定量聚合酶联反应(qPCR)、电泳分离等。CN值可以被用作基因组中给定的DNA片段的拷贝数的测量值。在单一细胞中，该CN值可以通过离散值值(0、1、2、3等)被定义。在细胞组中，CN值可以是连续变量，例如，DNA片段的测量值CN在大约2加/减增量d(理论上或实验上定义的变量)内变动。这一数值在给定基因组的伴有核苷酸增加或核苷酸减少的细胞中可以分别大于2+d或小于2-d。

在这里使用的术语“互补体(complementary)”是指与碱基配对原则相关的多核苷酸(即，如寡核苷酸或靶向核酸的核苷酸序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”互补于序列“3'-T-C-A-5'”。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂化效率和杂化强度具有显著效果。这在扩增反应中以及检测方法中是特别的重要，所述检测方法依赖于核酸之间的结合。特别的，该“互补序列”是指“反向平行关联”中的寡核苷酸，当其与核酸序列对准时，以便一个序列的5'端与另一个序列的3'端配对。在天然核酸中不常见的某些碱基可以包括在本文所公开的核酸中，并且包括例如肌苷和7-地扎呱宁。互补不需要是完美的，稳定的二聚体可以包括错配的碱基对和未匹配的碱基。本领域中的那些核酸技术可以经验性地确定考虑到一些包括如寡核苷酸的长度、碱基组成、寡核苷酸的序列、离子强度和错配的碱基对发生率的变量的二聚体稳定性。第一寡核苷酸互补于靶向核酸的部位，并且第二个寡核苷酸互补于同一部位(或这一部位的一部分)，“重叠部位”沿着靶向核酸存在。该重叠的程度可以依据互补的程度而变化。

术语“包括(comprising)”在这里定义为“主要包括，而不是仅仅包括”。此外，术语“包括”将自动由本领域技术人员理解为包括“由…组成(consisting of)“。单词“comprising”的变化形式，例如“comprise”和“comprises”，都具有相应的变化含义。

术语“衍生物”在这里定义为本发明的寡核苷酸的化学修饰，或互补于寡核苷酸的多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰可包括，例如，通过烷基、酰基或氨基的氢置换。

术语“碎片”在这里定义为寡核苷酸全部序列的不完整的或分离的一部分，该部分包括赋予序列具有寡核苷酸的特征和功能的活性/结合位点。特别的是，该碎片可以短于至少一个核苷酸或氨基酸。更特别的是，该碎片包括能够使寡核苷酸结合至流感病毒的结合位点。本发明的寡核苷酸的碎片可以是大约20个核苷酸长度。特别地，碎片的长度可以是至少大约10个核苷酸长度。例如，正向引物的碎片可以包括至少10、12、15、18或19个SEQ ID NO：1的连续的核苷酸，和/或反向引物可以包括至少10、12、15、18、19、20、22或24个SEQ IDNO：2的连续核苷酸。更特别地，该引物的碎片可以是至少15个核苷酸长度。

术语“突变”在这里定义为核苷酸长度的核酸序列的变化。本领域技术人员将理解的是，小突变，尤其是置换、缺失和/或插入的点突变在核苷酸的延伸上具有小的影响，特别是当核酸被用作探针时。因此，根据本发明的寡核苷酸包含至少一个核苷酸的置换、缺失和/或插入的突变。此外，根据本发明的寡核苷酸和它的衍生物也可以起探针的作用，因此这里所指的任意的寡核苷酸也包含它们的突变体和衍生物。例如，如果在靶向基因的任何引物杂交位点的少数碱基位置处发生突变，特别是5'末端，则引物的序列可能不影响引物的敏感性和特异性。

关于疾病与CN值之间的联系，DNA片段的CN变化水平(偏差)可能是重要的。在给定细胞组或单独细胞的DNA样本中，在正常动力学范围内CN增量的正向或负向水平可以被称为CN变化。

术语“诊断阶段(diagnosing)”和“诊断(diagnosis)”在这里定义为包括在患有肿瘤的个体中确定肿瘤存在和/或肿瘤类型的行为和过程。因此，在一个实施例中，诊断包括从一种或更多种其他肿瘤中判别命名为EOC的特殊肿瘤类型。在可选实施例中，本发明的结合部分基于总体存活率和/或肿瘤特异性存活率被用于将EOC受试者归类到临床相关组中。

术语“预后”在这里定义为包括预测肿瘤的可能原因和结果的行为及过程，例如，确定存活几率和/或无瘤存活(RFS)几率。

术语“结合部分”在这里定义为能够结合到靶基因组DNA、靶蛋白或编码相同靶基因组DNA和靶蛋白的mRNA的分子或实体。例如，结合部分能够作为探针，如杂化到靶蛋白时的单链寡核苷酸。探针包括但不限于引物，例如，能够用于引导反应的寡核苷酸，例如至少是在PCR反应中。特别地，该探针能够结合到ENV1或MDS1蛋白或编码相同靶基因组DNA和靶蛋白的mRNA，并且被用于定量ENV1或MDS1的基因表达水平。在另一实施例中，该探针能够结合到MECOM基因座的基因组DNA(即ENV1或MDS1基因组DNA)，并且能够确定ENV1或MDS1的拷贝数。

本领域技术人员将理解的是，本发明的结合部分可以用于任何组织学亚型(例如，浆液、黏蛋白、子宫内膜、透明细胞、未分化或未分类)的EOC的诊断或预后。

术语“样本”在这里定义为包括但不限于血液、痰液、唾液、黏膜刮除、组织活检等。该样本可以是分离的细胞样本，该细胞样本可以是指单细胞、多细胞、多于一种类型的细胞、来源于组织的细胞、来源于器官的细胞和/或来源于肿瘤的细胞。

本领域技术人员将理解的是，根据本发明所给出的方法，本发明可以在无不正当实验下实施。在给出的参考文献中、或标准生物技术及分子生物学教科书中的原则中描述了该方法、技术和化学试剂。

根据一个方面，提供了至少一种用于在受试者中诊断癌症和/或倾向于患有癌症，确定患有癌症的受试者的存活预后，和/或确定癌症治疗的有效性，和/或确定该癌症在受试者中是原发性或继发性的方法，该方法包括在受试者样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数，

其中，分别相对于至少一个表达截断值或拷贝数截断值的基因表达水平和/或拷贝数表明受试者患有癌症或倾向于患有癌症和/或患有癌症的受试者的存活预后、和/或确定癌症治疗的有效性。

妇科癌症可以选自由上皮软巢癌、宫颈癌、透明细胞肾癌等组成。特别地，该EOC可以是腺癌或恶性卵巢癌。特别地，该MECOM基因座表达和/或拷贝数相对于其他类型的癌症和/或正常组织可用于卵巢癌的鉴别诊断。

根据一个方面，提供了至少一种用于在倾向于患有EOC的受试者中诊断上皮性卵巢癌，确定患有EOC的受试者的存活预后，和/或确定EOC治疗的有效性，和/或确定受试者中的上皮性卵巢癌是原发性或继发性的上皮性卵巢癌的方法，该方法包括在受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，分别相对于至少一个表达截断值或拷贝数截断值的基因表达水平和/或拷贝数表明受试者患有EOC或倾向于患有EOC和/或患有EOC的受试者的存活预后、和/或确定EOC治疗的有效性。

作为临床生物标记的EVI1表达在卵巢肿瘤转移诊断中在传统生物标记中可以具有最强的敏感性与特异性。该EVI1基因表达水平是肿瘤是原发性或继发性的良好指示。EVI1基因表达水平也可以在卵巢肿瘤恶性可能性诊断中有效作为高敏感性但低特异性的临床生物标记。

特别地，EVI1表达可以在卵巢肿瘤原发性起源诊断中在传统生物标记中具有高敏感性和特异性的临床生物标记，并且在卵巢肿瘤恶性可能性的诊断中作为具有高敏感性但低特异性的临床生物标记。

根据本发明的任一方面的方法可以是在体外，或在体内。特别地，该方法可以在体外，其中所述步骤在分离于受试者的样本中进行。该样本可以通过本领域已知的任何方法从受试者中获得。例如，但不限于，卵巢肿瘤材料可以取自卵巢、输卵管、子宫、阴道等。转移性肿瘤可以取自腹腔、其他身体器官、组织等。癌症细胞可以从非限制性实施例如生物流体中获得，所述生物流体包括但不限于腹腔液、血液、淋巴液、尿液、分泌体的产物等。

根据本发明的任一方面使用的嗜亲性病毒整合位点1蛋白同系物(EVI1)、先天性脊髓发育不良-1(MDS1)以及其他基因转录物的表达定量可以使用基因表达定量的任何技术完成。这类技术包括但不限于，定量PCR、半定量PCR、基因表达微阵列、下一代基因测序等。

根据本发明的任一方面使用的MECOM、EVI1、MDS1和/或其他基因的拷贝数可以使用基因拷贝数定量的任何技术确定。这类技术包括但不限于，定量PCR、半定量PCR、基因表达(SNP)微阵列、下一代基因测序、细胞遗传学技术(例如，原位杂交、比较基因组杂交、比较染色体组杂交)、Southern印迹杂交、多重连接探针扩增(MLPA)和短荧光片段的多重定量PCR(QMPSF)等。

特别地，根据本发明任一方面的该方法包括确定MECOM基因座的基因表达水平和/或拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。

特别地，根据本发明任一方面的该方法包括确定MECOM基因座的EV1和/或MDS1的基因表达水平，由其组成，或基本由其组成。更特别地，该方法进一步包括确定MECOM基因座的EV1和/或MDS1的拷贝数的步骤，或由其组成，或基本由其组成。

根据一实施例，该方法包括确定EV1或MDS1的基因表达水平及拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。根据另一实施例，该方法包括确定EV1的基因表达水平或MDS1的拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。根据又一实施例，该方法包括确定MDS1的基因表达水平及EV1的拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。根据一个实施例，该方法包括确定EV1和MDS1的基因表达水平及EV1的拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。根据另一实施例，该方法包括确定MDS1的基因表达水平以及EV1和MDS1的拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。根据又一实施例，该方法包括确定MDS1和EV1的基因表达水平以及MDS1和EV1的拷贝数，或由其组成，或基本由其组成。

根据本发明的任一方面的该方法，可以进一步包括确定至少一个另一基因的基因表达水平的步骤，该另一基因选自样本中由MUC16、WFDC2、P53、KRAS、ERBB1、ERBB2、ERBB3、EGF、NGR1、TGFA、MYC组成。

MUC16和WFDC2是目前用于卵巢癌的临床认可的标记。EV1基因和/或MDS1基因这些基因的使用可以导致更敏感和更具特异性的诊断和/或预后。特别地，较好地结果可以通过EVI1基因表达水平和WFDC2基因表达水平的结合(即两方结合)获得。这一组合能够用于获得与卵巢癌有关的受试者的更精确的信息(例如，受试者的卵巢上皮细胞是否是正常或是癌变的)。可选的，该EVI1基因表达水平也可以与WFDC2基因表达水平及MUC16基因表达水平结合以获得更精确的结果。这一三方结合相对于两方结合或单独使用EVI1基因表达水平获得了卵巢癌的更具特异性的基因信号(即，更具特异性地标记)。

该治疗可以选自由化学疗法、外科手术和术后化学疗法组成。

MDS1与EVI1的表达数据的结合也能够被成对用于增加卵巢癌中肿瘤亚型的鉴别能力，例如但不限于低潜在恶性肿瘤、卵巢中的乳腺癌转移、EOC等。

该表达截断值和拷贝数截断值可在训练阶段获得，在所述训练阶段选用用与EOC有关的已知诊断的多个受试者获得，其中该训练受试者包括两组训练受试者，每组都与不同的诊断相关。这可以使用不用的方式进行。

在一个实施例中，该表达截断值通过以下步骤获得每个基因：

(1)提取每个训练受试者的基因的表达水平；

(2)获得每组训练受试者的基因表达水平的累积分布函数(每组均与如上所述与不同的诊断相关)；和

(3)选取表达截断值，基于每个训练受试者的基因表达水平是高于表达截断值或低于表达截断值将训练受试者划分为两组。

可以使用本领域中任何已知的方法获得步骤(2)中的累积分布函数。特别地，该方法可以假设有两个训练组：一个为大小N1的阴性诊断/预后/预测，另一个为大小N2的阳性诊断/预后/预测，X1-阴性诊断的受试者的参数X的值，X2-阳性诊断的受试者的参数Y的值，C-选取的参数X的截断水平。

定义：

CDF_X(x)＝计数(count)(X＜x)/N，

()观察的阴性＝计数(X＜C),

()观察的阳性＝计数(X＞C)

然后，

在最简单的1维例子中，最大差异获得通过如下方程获得：

$C_{\mathrm{opt}}=\underset{C}{\arg \min }(\mathrm{FP}+\mathrm{FN})=\underset{C}{\arg \min }(N_1(1-{\mathrm{CDF}}_{X_1}\left(C\right))+N_2(1-{\mathrm{CDF}}_{X_2}\left(C\right)))$

在更复杂的2维例子中(例如2个基因A和B)，该CDF变成2-D函数CDFx(XA,XB)，并且最大差异通过2-D最小化获得。

特别地，基于每一训练受试者的基因表达水平是否是高于表达截断值或低于截断值将其划分为两组，这可以相同于将训练受试者划分为用不同诊断的两组。然而，很难获得这一理想情形。

因此，在一个实施例中，可以选择该表达截断值，以便它在两组划分之间获得最大的差异。在这一实施例中，该表达截断值可以选择最小化的假阴性值。依据使用的表达截断值来确定诊断，该假阴性是指通过表达截断值将训练受试者错误地归类为对应于未患有癌症、继发性肿瘤、低潜在恶性肿瘤及存活时间超出特定值的训练受试者组。

在另一实施例中，该诊断涉及在步骤(3)中选取的受试者的存活时间和表达截断值，以将训练受试者分为两组，这样两组具有最大不同(Wald统计)存活曲线(共均衡(Cox-Porportional)模型)。这一获得最大不同存活曲线的单一1维优化被用于获得图8A中的表达截断值曲线和图8D中的“组合”队列曲线。这些图中的表达截断值以log2比例表示，并且通过图表上方字母“C”表示。

在这一研究中，有关试验受试者和训练受试者的数据从同样也具有已知诊断(但是，这一已知的诊断对于获得试验受试者的信息是不必要的)的试验受试者的数据库中获得。注意的是，使用一组受试者(训练受试者)获得的表达截断值是没有保证的，但使用一组受试者(训练受试者)获得的表达截断值可明确地被用于评估另一组受试者(试验受试者)。将表达截断值用于所有试验受试者的一般诊断试剂盒中是没有保证的。已经证明的是，通过近年来的临床实践，通常倾向下特异性组所具有的临床值(获得通过特异性药物或标记获得的)显著不同于在临床试验期间获得的临床值。一些现有的和有保证的诊断/预后试剂盒(例如，MammPrint,OncoMine)面临同样的问题。为了确定更优的截断表达值，要么更具特异性的针对给定队列，要么更有力的穿过若干队列，这可能需要更专业的临床研究。

在一个实施例中，采用两步优化算法获得了每个基因的拷贝数截断值(对于原发性受试者级)和两个表达截断值，获得如下：

(1)提取每个训练受试者的基因的表达水平和拷贝数；

(2)评估拷贝数值，并根据他们的基因拷贝数是在拷贝数之上或之下以将训练受试者划分成两个队列；

(3)对于步骤(2)中获得的每个队列，基于每个训练受试者的基因表达水平是高于表达水平还是低于表达水平选择表达值以将训练受试者划分为两组。

在另一实施例中，选择涉及受试者的存活时间以及表达值的诊断以将队列中的训练受试者分为两组，这样这两组具有最大不同的(Wald统计)存活曲线(Cox-Porportional模型)。每一队列中的训练受试者也包括两组训练受试者，每一组均与不同的诊断相关。在第二个实施例中，选择表达值，以便它在基于表达值将队列中的训练受试者划分为的两组和将队列中的训练受试者划分为具有不同诊断的两组之间获得最大差异。例如，表达值可以选择最小化的假阴性值。这一选择表达值的方法可以用于任何类型的诊断，包括涉及受试者存活时间的诊断。

(4)为了获得一系列的拷贝数，重复步骤(2)-(3)；

(5)选择在队列中存活曲线之间获得最大差异(如在第一实施例中)或在队列中的划分部分中获得最大差异(如在第二实施例中)的拷贝数截断值。在一个实施例中，只有在分别评估的拷贝数之上的具有基因拷贝数的队列才被考虑用于选择拷贝数截断值。表达截断值随后被获得，因为表达截断值与拷贝数截断值相关。

采用上述的两步优化算法得到了用于获得图8D中图表的截断值(对应于“扩增”和“未扩增”队列)。

受试者的基因的拷贝数可从受试者的肿瘤中确定。该方法可以用于确定受试者的存活预后，其中，该方法进一步包括以下步骤：

(i)参数化所述训练受试者组中的患者队列部分与基因拷贝数之间的相关性；

(ii)参数化所述训练受试者组中的患者队列部分与存活时间之间的相关性；和

(iii)使用受试者的拷贝数以确定来自(i)相关性的患者队列部分，使用受试者的患者队列部分以确定来自(ii)相关性的受试者存活时间。

训练受试者的存活时间可以基于训练受试者的最后一次随访时间。根据本发明的任何方面，最后一次随访时间可以是指受试者最后一次访问医师接受检查的时间。它可以是从EOC预后的50、100、300、500、1500、2000、2500天等。

该方法可被用于确定治疗的有效性，进一步包括步骤：

(i)参数化训练受试者的基因拷贝数与训练受试者可能的治疗应答之间的相关性，选择的所述训练受试者由以下组成：

-完全的应答；

-不完全应答；和

-无效应答；和

(ii)使用受试者的拷贝数以确定估计的受试者可能的治疗应答。

根据一个方面，提供了至少一种用于在受试者中诊断上皮卵巢癌和/或倾向于患有上皮软巢癌的试剂盒，该试剂盒包括至少一个能够确定MECOM基因座中至少一个基因的表达水平和/或拷贝数的探针。该探针可以为寡核苷酸、配体、抗体和/或可适当地与MDS1和/或EVI1基因/蛋白结合的药物。

特别地，该探针可以为药物。药物的非限制性实施例可以为西奈芬近(Sinefunin)(sigma-Aldrich)，甲基转移酶组蛋白的地赞普兰可因(deazaneplanocin)(MoravekBiochenical)其他抑制剂和它们的衍生物等。

根据又一方面，提供了至少一种具有配置用于执行根据本发明的任一方面方法的处理器的计算机系统。

根据另一方面，提供了至少一种计算机程序产品，例如有形的数据储存设备，通过电脑可读，并包含通过计算机系统的处理器可处理的指令以使程序员执行根据本发明的任一方面的方法。

根据又一方面，提供了选自由SEQ ID NOs：1-3、片段、衍生物、变体和它们的互补序列组成的核苷酸序列。特别地，EVI1-For和EVI1-Rev为适用于基于PCR技术(包括但不限于定量PCR)的一对引物的核苷酸序列，其可以特定地测量EVI1转录的表达。正向引物(命名为EVI1-For)序列5'-GGTTCCTTGCAGCATGCAAGACC-3'(SEQ ID NO:1)。反向引物序列(命名为EVI1-Rev)5'-GTTCTCTGATCAGGCAGTTGG(SEQ ID NO:2)。EVU-Flu病毒是荧光探针的核苷酸序列，FAM6-TACTTGAGGCCTTCTCCAGG-TAMRA(SEQ ID NO:3)，其能够特定地测量EVI1转录的表达。这些序列可以能够在样本中检测任何的EVI1异构体。特别地，这些序列可以能够在样本中检测微量的EVI1异构体。

引物序列可以包括SEQ ID NO:1、2或3的序列，或由其组成，或基本由其组成。

现已在本发明中作了一般性地描述，同样的通过参考以实施说明的方式提供的下述实施例将更容易地理解，但下述实施例并不旨在限制本发明。

本领域技术人员将理解的是，本发明可以根据本文中给出的方法在无不正当实验条件下实施。在给出的参考文献中、或标准生物技术和分子生物学教科书中的原则中描述了该方法、技术和化学试剂。

实施例

本领域中已知的和没有特殊描述的标准分子生物学技术一般遵循在Sambrook和Russel，分子克隆：实验室手册，ColdHarbor实验室，美国(2001)中所描述的。

临床数据描述

美国国立卫生研究院(NIH)癌症基因组图谱(TCGA)数据库(MCLENDON，2008)用于卵巢癌患者的拷贝数分析。从TCGA网站上下载了514例EOC患者的数据。其中，449例(87％)患者最初被归类为EOC的阶段3和4；448例(87％)患者接受了化学治疗；44例(8.5％)患者年龄小于45岁，21例(4％)介于45至65岁之间，290例(56％)在65岁以上。明确了484例(94％)患者的最后一次随访时间和264例(51％)的死亡时间。

TCGA网站中的504例患者(总共514例)的拷贝数分析数据是有效的。其中，337例样本基因表达数据也是有效的。该组样本被用于存活分析。

测验了TCGA数据库中524例患者的治疗有效性中的MECOM转录表达的预测能力和基因拷贝数。这些患者通过对原发性治疗性处理的应答类型分层为2级：1)288例患者完全应答；2)121例患者“不完全应答”(包括部分应答、稳定或进行性疾病)；和3)115例患者无应答(“无效应答”)，主要是由于他们的死亡早于原发性治疗应答评估的预期时间。

从基因表达综合数据库(GEO)网站(EdgarR2002)中获得了有关基因表达分析的下列公开的有效数据集，GSE12172包括90例样本(Anglesio MS,2008)，GSE20656包括172例样本(Meyniel JP,2010)，GSE14407包括24例患者(Bowen NJ，2009)。在GSE12172数据集中的通过了质量评估的72例患者中，所有的肿瘤被表征为浆液表型，56例(77％)被归类为EOC的阶段3和4，50例(72％)肿瘤被表征为恶性，22例(28％)被表征为LMP(低潜在恶性)。

GSE20656数据集的116例患者通过了质量评估，59例肿瘤(具有有效信息的76例肿瘤的78％)被表征为浆液表型，55例(具有有效信息的81例肿瘤的68％)被表征为EOC的阶段3和4，83例(72％)肿瘤被鉴定为原发性EOC，28例(72％)被鉴定为卵巢中乳腺癌转移。在GSE14407的24例患者中，12例患者被诊断为EOC的Ic阶段(2例患者)、II和IIb阶段(2例患者)、III阶段(1例患者)、IIIc阶段(5例患者)、IV阶段(2例患者)。如果疾病不同于上皮癌，则剩余12例样本取自接受手术治疗的患者的正常卵巢上皮细胞。在GSE7463数据集的43例卵巢癌患者中，33例被诊断为恶性卵巢癌，10例被诊断为非恶性腺癌(MorenoCS等，2007)。在恶性卵巢癌患者中，24例在手术前接受了新的辅助性化学疗法，9例没有接受。

在GSE9750微阵列数据集中，使用了33例原发性宫颈癌肿瘤和24例取自正常宫颈上皮样本的表达水平(Scotto L等，2008)。数据集GSE7305包含以10例卵巢子宫内膜肿瘤和10例正常子宫内膜样本为特征的数据(Hever A等，2007)。GSE6344中，使用了10例透明细胞肾细胞癌肿瘤(5例阶段I和5例阶段II)及10例正常肾脏上皮细胞样本(Gunz ML等，2007)。

所研究的临床队列的详细信息在下方表1和表2中可以找到。

表1卵巢癌对比LMP

表2卵巢癌对比乳腺癌转移

用MBEI算法完成了每个数据集的表达水平的标准化(Li C等，2001)。应用ANOVA方法(Kerr M.K.等2001)校准了三个数据集的批次影响。在GEO表达数据集中以近似的方式完成了TCGA表达数据分析所描述的所有程序。

实施例1

EVI1基因表达是正常卵巢组织与癌变卵巢组织之间的区别标记

结果于图1中示出，其中示出了MECOM基因座的EVI1和MDS1基因的表达相对于正常上皮细胞，在卵巢癌细胞中极大地增加。在使用激光显微解剖技术从卵巢组织中获取的样本中，EVI1和MDS1基因的平均表达相对于邻近的正常组织，在癌变组织中EVI1分别高出3.6和1.4倍(图1)。这一平均表达值中的差异相对于MDS1(p＝0.021)，对于EVI1更为显著。MDS1和EVI1表达值与所有样本相关联(Pearson'sr＝0.84，Kendall'sr＝0.60)。

实施例2EVI1表达在传统诊断的生物标记中是原发性EOC肿瘤的敏感性和特异性标记

为了评估卵巢癌中EVl的重要性，在三组数据集中分析了它的表达，并且再次检测了它基因集中作为诊断标记的重要性，其在卵巢癌诊断和患者存活中的重要性被广泛接受：KRAS、ERBB2、P53、MYC、MUC16(CA-125)和WFDC2(HE4)。WFDC2和MUC16的结果示于图2中。由结果中可知，MECOM表达在正常卵巢上皮细胞与癌变卵巢上皮细胞中不同。用假阴性(FN)＝1和假阳性(FP)＝1区别EOC的MECOM基因的表达值的组合(图2(A))，这可与图2(C)中MUC16(CA-125)和WWFDC2(HE-4)标记的组合相对比。在图2(B)中得到了EVl和MUC16基因组合的完美分离。正常上皮细胞对比EOC上皮细胞的EVI1基因的整体判别力可与MUC16和WFDC2相比较(图2(D))。

卵巢上皮细胞中出现的卵巢肿瘤中每个标记的表达值将与乳腺癌肿瘤的卵巢转移(继发性肿瘤)中相应的表达值相比较。在给出的阵列中，EVI1表达分别通过MDS1(RefSeq MECOM，转录变体4，NM-00491.3；SEQ ID NO：4)的探针集226420_at和EVl(RefSeqMECOM，转录变体2，NM-005241.3；SEQ ID NO：6)的探针集208434_at表示。以这样的方式选择表达截断值(以log2比例给出)以便假阴性诊断值可被最小化。

图3和4展示的结果证明，MDS1和EVI1基因在传统标记中(P53、KRAS、ERBB2、MYC、WFDC2和MUC16)能够以最高度特异性在原发性与继发性卵巢肿瘤之间被判别(分别地P＝6.10-14和P＝6.10-12)。

图3中展示的基因表达值的累积分布函数可区别：A)在卵巢的原发性EOC与乳腺癌转移之间；B)在低潜在恶性肿瘤与恶性EOC之间。在灰色和黑色累计曲线之间观察到了较大的差异(通过p-值)，给定基因的诊断值较大。如图3中可见，MECOM基因座的EVI1和MDS1基因在EOC诊断中要比许多传统标记更加敏感和更具特异性。

图4示出了MECOM基因座的EVI1基因和MDS1基因对于诊断都是重要的。图4中示出的低潜在恶性(LMP)和恶性原发性EOC之间的判别在EVI1和MDS1基因的表达值结合在一起后以二维判别式函数的形式提升。

在EVI1表达的表达截断水平8.5处，原发性EOC诊断的假阴性值(FN)为FNEVI1＝7，假阳性值(FP)FPEVI1＝0。对于在表达截断水平6.7处的下一强有力标记MUC16(CA-125)的FNMUC16＝8，FPMUC16＝5。因此，EVI1基因的特异性＝33/(33+0)＝100％，敏感性＝(83-7)/83＝91％，而MUC16的特异性＝33/(33+5)＝87％，敏感性＝(83-5)/83＝94％。原发性和继发性卵巢癌肿瘤之间的辨别鲁棒性(robustness)可通过图4中示出的EVI1与NDS1基因的同时测量得到提升。

由此可知，MECOM基因座的基因的转录在EOC诊断中要比许多传统生物标记更加敏感和更具特异性。图5中的受试者工作特征(ROC)曲线示出了作为临床诊断的生物标记的MECOM基因座的EVI1基因对比两个当前最成功的诊断标记WFDC2(HE-4)和MUC16(CA-125)的表达。最好的预测因子通过最靠近坐标轴的曲线进行限定。最差的预测因子通过最靠近参考线的曲线进行限定(假阳性率＝真阳性率)。

如图6中所示，原发性和继发性卵巢肿瘤之间辨别的特异性和敏感性通过EVI1与ERBB家族基因转录及它们分泌的信号蛋白配体的一起测量得到进一步提升。

如图6所示，相对于ERBB家族受体(例如，ERBB1、ERBB2、ERBB3)，分泌的配体(例如，EGF、TGFA、NGR1)表现了小幅地低敏感性。

对于EVI1-EGR1结合，敏感性为(83-4)/83＝95％，特异性为100％。

对于EVI1-EGF和EVI1-TGFA结合，敏感性为(83-3)/83＝98％，特异性为33/(33+1)＝97％。

对于EVI1和EVI1-ERBB2结合，敏感性为(83-2)/83＝98％，特异性为100％。

对于EVI1-ERBB3结合，敏感性为(83-1)/83＝99％，特异性为100％。

实施例3

EVI1表达是EOC肿瘤潜在恶性的敏感性标记

关于肿瘤的潜在恶性，EVI1基因在小组辨别意义中EVI1排名第5(P＝0.022)，超过生物标记MYC(P＝0.03)和ERBB2(P＝0.74)。

EVI1EVI1在表达水平截断9.5处的特异性＝21/(21+4)＝84％，敏感性＝49/(49+18)＝73％，而MUC16(CA-125)在表达截断水平9.7处的特异性＝21/(21+5)＝81％，敏感性＝49/(49+11)＝82％。在图6的ROC曲线的对比图中示出，EVI1作为本发明中提出的临床诊断生物标记比两个已被证实的临床生物标记MUC16(CA-125)和WFDC2(HE-4)在截断值的所有范围内更有利于划分患者群。图6中示出原发性EOC肿瘤与卵巢内乳腺癌转移之间的辨别在EVI1与ERBB1基因的表达值结合在一起之后以二维判别式函数的形式。EVI1与ERBB1表达的结合被示出对于原发性EOC是更具敏感性的标记。

实施例4

MDS1基因表达的预后重要性取决于肿瘤组织中它的基因组拷贝数，然而，无论EVI1表达的基因拷贝数如何，它都具有存活意义

EVI1尤其是MDS1表达的预后重要性极大地取决于患者的基因组区域的拷贝数。诊断为EOC阶段3和4的患者的存活分析证实，EVI1是三个基因中的一个，其表达水平将患者分离为存活时间显著不同的两组。作为存活预后标记，EVl基因的表达以P＝0.010排名第二，在PIK3CA(P＝0.0021)之后。MDS1基因表达的存活意义以P＝0.049为临界点，排名在PIK3CA、EVI1、WFDC2、MUC16、KRAS和NYC之后，但优于ERBB2、P53和BRCA2。

在研究人群中，52％(262/504)的患者中EVI1基因表现为每基因组多于2个拷贝数。平均拷贝数和患者分数的值超过之前所报道的EOC肿瘤的相应值(50-70％)(SundeJS，2006)。图7中示出了MECOM基因座3'端的拷贝数的位点在到达EOC肿瘤细胞的基因组中最有力的基因扩增热点的染色体3的区域被高度扩增。该MECOM基因座的3'端拷贝数为2.5，高于84％EOC患者的肿瘤中的拷贝数。如图8所示，对于所有患者，EVI1区域被表征为每基因组平均值3.52和中间值3.19拷贝数，MDS1区域分别为平均值3.39和3.18拷贝数。

在患者存活的肿瘤中分析了作为因素的EVI1和MDS1表达效果，其取决于这些基因的基因组扩增。EVI1通过将患者人群分为与给定拷贝数截断相关的两组研究了EVI1和MDS1拷贝数的效果：在肿瘤中具有大量EVI1和MDS1拷贝数的患者(基因被扩增)和余下的患者(基因未被扩增)。该结果在图8C和D中示出。在高拷贝数组中进行了EVl和MDS1表达的存活分析，并计算了通过表达划分存活组的最佳p值。拷贝数截断值在0到4之间变化。因此，计算了拷贝数相关的表达限定的存活P值。图8(A)示出了通过基因表达标记(灰色-高表达；黑色-低表达)的患者存活曲线的最佳分离的比较；灰色和黑色曲线分离的越好(P值越小)，给定标记具有的用于患者存活的预测力越好。图8(B)的直方图为获得的MECOM基因座的EVl和MDS1基因的扩增值。图8(C)中示出了从MECOM基因座获得的基因扩增程度上的最佳存活曲线分离(Pmin)的P值的相关性。图8(D)为得到的用于具有EVI1和MDS1的患者亚群的患者的最大分离EVI1的存活曲线。分别获得了高于3.5拷贝数/细胞(上列)和低于3.6拷贝数/细胞(中间列)的扩增。作为存活曲线分离的参考，在下列中给出了组合的(扩增的与非扩增的一起)。在图8(A)和(D)中，截断表达值(以log2比例)在每一图表上方用字母表示(在图表框内)。对于图8(A)和图8(D)中的“组合“图表，通过表达值的单一一维优化获得该截断。在图8(D)中，通过1)拷贝数；随后是2)表达的两步优化完成了分析。图中示出，MECOM基因座的扩增与它的基因EVI1和MDS1表达一起相对于许多传统的生物标记是更有力的EOC患者存活预后的指示剂。

给出了EVI1和MDS1的最佳存活P值的拷贝数截断EVI1略有不同(分别是3.5和3.6)，尽管这些轨迹是邻近的。在患者组中，MDS1拷贝数要高于3.6，MDS1的表达是划分存活患者(P＝0.0028)的强有力因素，相对于整个人群(P＝0.049)，通过因素17显示出了P值的显著提升。在该亚群中，MDS1未被扩增，没有观察到MDS1表达的存活意义(P＝0.39)。

只有在患者的肿瘤中MDS1基因区域拷贝数高于3.6(227/354,65％的患者群)，MDS1表达才是EOC患者存活的重要因素。同时，EVI1基因表达对于整个人群是患者存活的重要因素(P＝0.010)，无论其编码区域的扩增水平如何。该结果示于图8D中。

EVI1和MDS1基因的存活预后值取决于它们的拷贝数(即，包括它们二者的MECOM基因座的拷贝数)。如图8D所示，在通过基因拷贝数将患者(“组合的”)划分为2个队列(“扩增的”和“未扩增的”)之后，EVI1的预后P值得到提升。此外，即使没有通过拷贝数值先将患者分级(“结合“队列)，EVI1基因预后值也略显著。因此，EVI1基因表达可以用作预后标记，而无论它的拷贝数情况如何EVI1。

该结果证明，包括原癌基因EVI1和MDS1的MECOM基因座EVI1是人体上皮卵巢癌的不同诊断和预后的临床生物标记。

实施例5

EVI1和MDS1对于短期存活周期是强有力的预后因素

如图14所示，在给定的有限时间周期内，在预后良好(存活)与预后不良(死亡)的患者的MECOM拷贝数分布之间的差异P值与具有强的正相关的时限呈对数线性。存活(预后良好)和死亡(预后不良)患者队列的详细关系结构通过随访时间进行限定。MDS1和EVI1的表达P值(在预后良好与预后不良队列之间)与患者的随访时间相关。观察到了具有不同相关系数的MDS1的两个随访时间范围。

对于EVI1和MDS1，存活时限的P值的函数关系由不连续地大约1200天的周期(region)划分得到的两个非常强相关的趋势组成。对于短于500天的时间周期与P值和拷贝数之间的相关性降低，而在当对比图9和图10时可看出，MECOM拷贝数相对于所有传统的癌症生物标记是强有力的标记。如在图9中所示，EVI1表达，而MDS1没有表达示出了对于给定的预后时间跨度的强有力的存活意义。基于图9，EVI1被示出在短期预后时间周期(300天)是用于区别不良和良性预后患者之间的最有力的标记。如图10所示，只有EVI1或者MDS1表达对于给定的预后时间跨度不具有充分的存活预后能力。然而，两个基因的表达对于MECOM基因座扩增的(拷贝数＞2.9)的肿瘤患者(91％)是高度重要的。因此，EVI1被示出在中间值预后时间周期(1500天)是区别不良和良性预后患者之间的略为重要的标记。

实施例6

同时分析MECOM基因座的基因(EVI1与MDS)提升了临床分析的辨别力

MDS1与EVI1的表达数据的结合能够同时用于增加卵巢肿瘤亚型的辨别力。这一可能性在图3B中通过比较低潜在恶性(LMP)肿瘤对比恶性EOC中的基因表达的累计频率分布说明。在这一图上可以观察到，MECOM基因座的EVI1基因对应于恶性EOC类型的高度表达值。与之相反，该基因座的MDS1基因对应于LMP卵巢肿瘤类型的高度表达值。因此，获得了测量的最大仪器灵敏度(在高度表达下测量了两个基因)。如图4所示，如果MDS1和EVI1表达同时被测量，产生的用于划分LMP和恶性EOC亚群的二维辨别式函数的力会增加。

实施例7

EVI1与MDS1拷贝数是原发性治疗结果的预测标记

所述P值被用于研究预后良好与预后不良的患者组的EVI1与MDS1拷贝数分布之间的差异。对于给定的随访时间截断，预后不良组被限定为在这一随访时间之前死亡的患者。预后良好组被限定为存活时间长于给定的随访时间的患者。

如图9和图10所示，这些P值被发现不同于通过原发性治疗结果成功的患者组(“完全”、“不完全”和“无效”应答患者队列)。此外，如图11所示，EVI1和MDS1的P值与属于预后不良组中的每个队列的患者分数强相关，这显示出原发性治疗应答结果取决于EVI1与MDS1的拷贝数。

每个队列的关系结构都是复杂的。随着队列患者分数增加至某一限定值时(对于EVI1而言，10％为“完全”应答组、40％为“不完全”应答组、50％为“无效”应答组)，EVI1与P值的关系呈强阴性(对于EVI1而言，-0.58为“完全”应答组，-0.6为“不完全”应答组和-0.89为“无效”应答组。在这一限定值之后，该关系变为对于“完全”应答组和“无效”应答组呈强阳性，但对于“不完全”应答组仍旧呈强阴性。对于MDS1，该关系结构性质相似。因此，对于某一治疗应答患者的最佳分是通过所期望的在良性存活预后与不良存活预后患者之间的EVI1(或MDS1)拷贝数分布差异的最小P值进行限定。

这证明了随着存活预后时间周期，在给定患者的肿瘤组织中原发性治疗结果应答与EVI1和/或MDS1的拷贝数呈相关性。很明显，每个EVI1和MDS1值的分布都预测了在给定时间应答的患者的“最佳”分数。这一最佳对应于在所给定队列患者的EVI1和/或MDS1表达上的治疗应答结果的最高依赖性。

在手术期间测量的EVI1和/或MDS1的表达值同时反映了每个患者的良好存活组与不良存活组之间的概率分布差异、患者存活概率、具有“完全”应答、“不完全”应答、“无效”应答的概率及期望的存活时间。因此，随着这一预测预估的存活时间，可以预测到给定患者的原发性治疗效果。图17示出了这一分析的实施例，其包括用于原发性治疗结果预测和与基于EVI1和MDS1拷贝数数据相关的患者存活预后的算法。

该特定的步骤包括：

1、在手术期间在提取的肿瘤中测量EVI1/MDS1拷贝数。映射EVI1/MDS1拷贝数分布上的拷贝数。

2、在拷贝数分布中找到所给定拷贝数的分位数Q。可选的：分别在每个应答队列(“完全”、“不完全”、“无效”)的拷贝数分布中找到所给定拷贝数的分位数。这些可选的分位数将产生3种可选的预测情景，预测的结果在步骤7能够被组合。

3、将Q映射到“应答队列分类组合”对Q(拷贝数)的列线图中(图11)。

4、预估了每个队列的直线“y＝Q”的交叉点，其中近似的队列分数-log(Q)与Ox轴上的对应值具有相关性。因此，制定了属于每个队列(Ox轴)的给定患者的理性推断。如果所有的交叉点在[0,1]范围内，则在这一步骤能够获得多达6个潜在预期的队列分数值(6个理性值)。与步骤2类似地，这些数值可以进一步追溯到步骤7中被解决。

5、将获得的分组的预期队列分数值(理性值)映射到“最后一次随访时间”对“队列分数”的列线图中(图15A)。

6、给每个给定的预期队列分数(理性值)找到列线图曲线的对应直线的交叉点，该列线图曲线用于对应每个原发性治疗结果预测队列。在Ox轴上获得每个队列分数的预期存活时间的对应值。

7、通过从步骤6获得的理性存活时间推断获得基于原发性治疗结果预测的所预测的存活时间。例如，在步骤2，获得了6个交叉点(每3个分位数两个点)。在步骤5和6，每个点都对映到单一的预期存活时间。因此，获得了6个存活时间。如果目标是在得到拷贝数数据的时(即，在手术时)获得预测，则6个存活时间的最小值和最大值之间的范围可被恢复作为预测。

8、如果在观察到原发性治疗结果后为患者制定存活预后，则设定的理性存活时间(多达6天)可以降低为设定2天的存活时间。随后，获得了原发性治疗结果队列的必然性，因此，存活时间的范围被减少至给定队列的最小预测值与最大预测值。

图15A示出原发性治疗应答与患者最后一次随访时间强相关，也就是与预后良好和预后不良患者之间的表达不同的EVI1P值的log10(图15B)和MDS1P值的log10(图15C)相关。给定随访时间的预后良好和预后不良队列通过给定随访时间的患者存活或死亡进行限定。

实施例8

EVI1和MDS1是用于辅助治疗结果的预测性标记

对于短期存活周期(600天)，没有接受辅助化学治疗的患者，如果他们的肿瘤包含MECOM的高拷贝数，则显著地出现死亡(EVI1P＝0.01,MDS1P＝0.0)。图12示出了12例辅助治疗结果预测结果。在接受辅助化学治疗的患者中，MECOM的拷贝数是存活的无关紧要的因素。图12A示出了接受化学治疗的患者结果，图12B示出了没有接受化学治疗的患者结果。

无论患者是否接受化学治疗，EVI1的表达在他们之间都是显著不同的。但是，MDS1表达在接受辅助化学治疗的预后不良的患者组中略有偏高(p＝0.04)。

实施例9

EVI1和MDS1表达以及拷贝数在通过原发性治疗的应答类型划分的每个患者组中是强有力的长期预后因素

EVI1和MDS1拷贝数与表达值的组合划分了对原发性治疗应答的不同类型的患者组。这些标记也可以被考虑为是增强原发性治疗结果诊断力的因素。在图13中示出了使用原发性治疗应答结果的MECOM拷贝数和EVl及MDS1表达的结合用于强大存活预后的模式。对于具有完全应答、MECOM拷贝数在2.8与4.2之间、EVI1表达小于10.3和MDS1表达小于6.76的患者，预测了长期存活时间，并且，预测了EVI1和MDS1表达高于这些值的患者的平均存活时间(多达2000天)。

对于对原发性治疗部分应答或无应答(稳定性或进展性疾病)的患者，如果MECOM拷贝数小于2.7，MDS1表达小于6.43，则预测平均存活时间。对于MECOM拷贝数大于2.7，EVI1表达小于9.51的患者，则预测平均存活时间。

对原发性化学治疗没有完全应答、MECOM拷贝数小于2.7、MDS1表达高于6.43，或者如果EVI1表达大于9.51，MECOM拷贝数大于2.7的患者预测了短期存活时间(最多1000天)。

整体而言，低的MECOM拷贝数和EVI1与MDS1表达，以及存活时间中的完全应答导致长期存活时间的预后。

实施例10

MECOM拷贝数的预后能力对于短期存活时间患者是最强的，且预测他们原发性治疗的阴性结果

从图15中可知，具有良好预后与不良预后患者的MECOM拷贝数分布之间的P值差异不仅与预后周期有关，还与患者的原发性治疗应答组组成有关。当部分应答和完全应答的患者分数增加，存活时间与拷贝数P值也增加。与之相反的是，当大多数属于“无效”治疗应答组的患者死亡时，MECOM拷贝数(和EVI1表达水平)是短期时间周期(＜300天，如图9所示)的最重要的存活预测因素。表达的P值的-log10在具有预后良好与预后不良的患者之间是有差别的。对于给定随访时间的预后良好队列和预后不良队列通过给定随访时间的患者存活或死亡进行限定。

因此，考虑到MECOM拷贝数的预后值(还有EVI1和MDS1表达)和通过原发性治疗应答分组的患者存活，预后时间比例可以被划分为3个范围(图15A)。短期预后范围，多达500天，特征为MECOM拷贝数和它的基因表达的强预后力，以及“无效”治疗应答患者的普遍性。中期预后范围，跨度为500-1500天，特征为MECOM拷贝数和它的基因表达的不良预后力(将具有部分应答和稳定或进展的患者结合)(其中一些传统癌症生物标记比MECOM显示出更强的预后力)，以及“不完全”原发性治疗应答混合组(将部分应答和稳定性或进展性疾病的患者结合)的普遍性。长期预后范围，特征为EVI1和MDS1表达的MECOM拷贝数-依赖的预后力(比传统癌症生物标记强)和对原发性治疗完全应答的患者的普遍性。

实施例11

EVl和MDS1是用于抗癌治疗成功预测的标记

如图16A所示，EVI1表达值对于在手术期间预测原发性术后治疗性处理应答的结果是重要标记(P(Mann-WhitneyU)＝0.0021)。MDS1表达对于重要的趋势(P＝0.074)是无关紧要的。相对于传统癌症标记(例如，P(MUC16)＝0.7，P(WFDC2)＝0.1，P(KRAS)＝0.49，P(P53)＝0.4，P(ERBB2)＝0.37)，只有EVI1表达表现了统计学上显著的P值，并且MDS1表达在EVI1之后排在第二。相对于包含表现为部分应答、稳定性或进展性疾病(“不完全应答”)的患者组合组，EVI1和MDS1转录在对原发性治疗完全应答(“完全应答”组)的患者结合中是显著的预后因素。图16(A)示出了“完全应答”(黑色点)和“不完全应答”(灰色点)的EVI1和MDS1基因表达值的累积分布函数。图16(B)示出了EVI1和MDS1拷贝数(MECOM基因座)和表达值作为对原发性治疗完全应答患者的存活预后标记。图16(C)示出了EVI1和MDS1拷贝数(MECOM基因座)和表达值作为对原发性治疗、稳定性或进展性疾病部分应答的患者的存活预后标记。

原发性治疗应答的EVI1和MDS1的预后值通过研究由原发性应答类型划分的患者被进一步确认。两种基因对于两个患者组中的存活预后都是显著的(即，完全和“不完全”应答)。MDS1对于42％的完全应答的患者(P＝0.0010)和64％的“不完全”应答的患者(P＝0.0045)是显著的预后标记。EVI1对于82％的完全应答的患者(P＝0.0048)和50％的“不完全”应答的患者(P＝0.018)是显著的预后标记。

图13给出了原发性治疗成功预测的说明。在第一阶段，原发性治疗成功的预测是基于在手术期间从提取的肿瘤样本分析所获得的MECOM拷贝数和MDS1与EVI1表达值的原始数据制定。基于这一数据，选择了适宜的治疗过程(在MECOM扩增的情况下更强化，否则强化较小)。在第二阶段，评估原发性治疗应答。基于应答的类型，进一步的决定基于从MECOM拷贝数和MDS1与EVI1表达值范围提取的患者存活时间的更精确预后制定。

实施例12

EVI1表达在新辅助化学疗法处理后降低

将恶性上皮卵巢癌肿瘤的9个样本与在手术处理前从接受新辅助化学疗法的患者中获得的24个上皮卵巢癌肿瘤对比(13Moreno CS，2007)。EVIl的表达用AffymetrixHG U95Av2微阵列的探针集1881_g_at和1882_g_at探针集进行测量。两个探针集证明了在两个群组之间EVI1表达水平中的显著差异(分别为P＝0.0032和P＝0.032)。该数据展示于图18中。在患者的相同队列中还观察到EVI1表达相对于恶性卵巢肿瘤在良性(腺瘤)中是不同的(图19)。在后一情况中，该差异是显著的(分别为p＝0.0014和P＝0.007)，并且表明处理无效性和高度恶性与EVI1的高度表达相关联。

实施例13

EVI1表达对于基因肿瘤病理学(genitourological)肿瘤是潜在的诊断标记

EVI1表达被发现在一些其他妇科肿瘤中被改变。在宫颈癌中(Scotto L,2008)，EVI1表达谱性质上类似于EOC中的EVI1表达谱，并且EVI1水平在子宫癌肿瘤中要比正常子宫上皮细胞中显著提高(图20)。与之相反的是，在子宫内膜异位肿瘤中(HeverA，2007)，EVI1转录表达不仅是显著低于(p＝0.00016)正常子宫内膜中的EVI1转录表达，还是这一肿瘤的区别特征(100％特异性和敏感性)(图21)。在这一检测中，MDS1转录显示出相似的显著性(P＝0.00021)和可比较的辨别力(100％敏感性，90％特异性)。

相似地，在透明细胞肾脏细胞癌中(GumzML，2007)，高度EVI1表达与100％特异性和敏感性的正常上皮细胞相关联(P＝0.00016)(图22)。

实施例14

本发明所提出的测量EVI1表达的引物是卵巢癌诊断和存活预后的特异性和敏感性生物标记

设计了能够特异性地测量EVI1表达水平的适用于基于PCR技术的引物序列(包括但不限于qPCR)以及适用于荧光探针的序列。正向(EVI1-正向)序列5'-GGTTCCTTGCAGCATGCAAGACC-3'(SEQ ID NO:1)和反向引物(EVI1-反向)序列5'-GTTCTCTGATCAGGCAGTTGG-3'(SEQ ID NO:2)以及荧光探针(EVl-荧光)FAM6-TACTTGAGGCCTTCTCCAGG-TAMRA(SEQ ID NO:3)是被设计的靶向EVI1异构体。该EVI1异构体选自由SEQ ID NO：4、5和11-15组成的组。被设计的引物用于内源性控制β-肌动蛋白的相关定量研究(正向-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG(SEQ ID NO:7),反向-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG(SEQ ID NO:8)和荧光探针-FAM-actggcatcgtgatggactc-TAMRASEQ ID NO:9))。每一引物浓度被优化，并且随后被用于基因表达研究的组织分析qPCR盘(panel)I和II。在7500ABI仪器上使用Taqman通用控制混合(cat.no.4304437)运行PCR反应，获得了CT值，并且使用ddCT方法评估了相关的定量(Livak，2001)。

获得的倍性变化值被用于分析。肌动蛋白正常化的商业卵巢组织阵列qPCR平板(96孔)HORT01、HORT02(傲锐基因(Origene)技术)的两个盘被用于引物确认。每个盘包括48例患者的cDNA样本(正常化的肌动蛋白)，所述48例患者包括相对不同潜在生物标记基因表达比较的正常的和阶段特异性的卵巢癌患者。两个盘具有独特的患者ID'，总共15个正常的和82个具有不同阶段的卵巢患者样本cDNA列举如下：阶段IA＝11、阶段IB＝6、阶段IC＝7、阶段IIA＝3、阶段IIB＝6、阶段IIC＝3、阶段IIIA＝11、阶段IIIB＝11、阶段IIIC＝14、阶段IV＝9。引物3开放源软件被用于设计正向引物和反向引物以及用于qPCR研究的荧光探针。

倍性变化分布分析(图23)证明了测量EVI1表达、具有100％特异性和敏感性的引物可辨别任一阶段的正常卵巢表面上皮细胞和卵巢癌肿瘤(在图23B中P值范围在6E-13至2E-6之间变化)，并且通过优化的EVI1表达截断(在图23C中倍性变化至正常卵巢上皮细胞16.76)能够确定患者的良好存活预后和不良存活预后(P＝0.011)。

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Claims (30)

1.一种体外用于诊断受试者上皮性卵巢癌和/或倾向于患有上皮性卵巢癌的方法，所述方法包括在所述受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)所述MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是受试者患有上皮性卵巢癌和/或倾向于患有上皮性卵巢癌的指示。

2.一种体外用于确定患有上皮性卵巢癌的受试者的存活预后的方法，所述方法包括在所述受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)所述MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是确定患有上皮性卵巢癌的受试者的存活预后的指示。

3.一种体外用于确定受试者上皮性卵巢癌的治疗有效性的方法，所述方法包括在所述受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)所述MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是治疗有效性的指示。

4.一种体外用于确定受试者的上皮性卵巢癌是原发性的还是继发性的方法，所述方法包括在所述受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)所述MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是所述癌是原发性的还是继发性的指示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述上皮性卵巢癌是腺癌或恶性卵巢癌。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述上皮性卵巢癌是原发性上皮性卵巢癌。

7.一种体外用于诊断受试者宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌和/或倾向于患有宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌的方法，所述方法包括在所述受试者的样本中确定：

(i)MECOM基因座中至少一个基因的基因表达水平；和/或

(ii)所述MECOM基因座中至少一个基因的拷贝数；

其中，相对至少一个表达截断值的水平和/或相对至少一个拷贝数截断值的拷贝数是受试者患有宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌和/或倾向于患有宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌的指示。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基因表达水平通过测量所述MECOM基因座的基因的mRNA或蛋白质表达确定。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定样本中所述MECOM基因座的EVI1和/或MDS1的基因表达水平。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定样本中的选自由MUC16、WFDC2、ERBB1、ERBB2、ERBB3、EGF、NGR1和TGFA组成的组中的至少一个另一基因的基因表达水平。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定所述受试者的所述MECOM基因座上的EVI1和/或MDS1的拷贝数。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述受试者诊断前确定存活预后和/或确定治疗有效性的训练阶段；所述训练阶段包括以下用于所述MECOM基因座中所述基因的步骤：

对于用已知的有关卵巢癌诊断的训练受试者群中的每一个，确定所述训练受试者中基因的基因表达水平；和/或

确定表达截断值，并根据每个训练受试者中基因的基因表达水平是否超过所述表达截断值将所述训练受试者分成两组；

其中，所述训练受试者包括两群训练受试者，每群都与不同的诊断相关，并且所述表达截断值最大限度地减小了将所述训练受试者划分成的两组和将所述训练受试者划分成的两群之间的差异。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述受试者诊断之前确定存活预后和/或确定治疗有效性的训练阶段，所述训练阶段包括以下用于所述MECOM基因座中每个所述基因的步骤：

(i)对于用已知的有关卵巢癌诊断的训练受试者群中的每一个，确定所述训练受试者中基因的基因表达水平和拷贝数；

(ii)评估样本拷贝数，并根据每个训练受试者中基因的拷贝数是高于还是低于所述样本拷贝数将所述训练受试者分成两个队列；

(iii)对于每个所述队列，根据每个训练受试者中基因的基因表达水平是否超过所述样本表达值来确定将所述队列中的训练受试者分成两组的样本表达值，其中，所述样本表达值获得了两组之间差异的最大测量值；

(iv)通过改变训练受试者中确定的拷贝数范围内的样本拷贝数和获得所述基因的拷贝数分布曲线来重复步骤(ii)-(iii)；和

(v)选择拷贝数截断值作为与队列中两组之间差异的最大测量值相关的拷贝数，选择表达截断值作为由所述拷贝截断值得到的所述队列所确定的表达值。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述两组之间差异的测量值包括所述两组的存活曲线之间差异的测量值。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，确定存活预后和/或确定治疗有效性的所述受试者的诊断还包括下列用于所述MECOM基因座中每个所述基因的步骤：

比较相对于所述基因拷贝数截断值的所述受试者的基因拷贝数；

其中，

如果所述受试者的基因拷贝数超过所述基因拷贝数截断值，进一步比较相对于所述表达截断值的所述受试者的基因的基因表达水平，所述表达截断值由所述基因拷贝数高于所述拷贝数截断值的队列确定；

如果所述受试者的基因拷贝数低于所述基因拷贝数截断值，比较相对于所述表达截断值的所述受试者的基因的基因表达水平，所述表达截断值由所述基因拷贝数低于所述拷贝数截断值的所述队列确定；和

基于所述受试者的基因的基因表达水平与相应的表达截断值之间的比较，获得确定存活预后和/或确定治疗有效性的所述受试者的诊断。

16.根据权利要求15所述的用于确定所述受试者的存活预后的方法还包括以下步骤：

(i)参数化所述训练受试者群中患者队列分数与所述基因拷贝数之间的相关性；

(ii)参数化所述训练受试者群中所述患者队列分数与所述存活时间之间的相关性；

(iii)使用所述受试者的拷贝数以确定来自所述(i)相关性中的患者队列分数，使用所述受试者的患者队列分数以确定来自所述(ii)相关性中的所述受试者的预估存活时间。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述受试者的存活时间基于所述训练受试者的最后一次随访时间。

18.根据权利要求15所述的用于确定治疗有效性的方法还包括以下步骤：

(i)参数化所述训练受试者的基因拷贝数与所述训练受试者的可能治疗应答之间的相关性，所述可能治疗应答选自由下列：

-完全应答；

-不完全应答；和

-无应答；和

(ii)使用所述受试者的拷贝数以确定所述受试者的预估的可能治疗应答。

19.根据权利要求1、6和8-18中任一项所述的方法，其中，所述方法能够确定所述受试者的卵巢癌是原发性的还是继发性的卵巢癌。

20.根据权利要求1、6和8-18中任一项所述的方法，其中，所述方法能够确定所述受试者的卵巢癌是否具有潜在恶性。

21.根据权利要求3、5和8-18中任一项所述的方法，其中，所述治疗选自由化疗、手术和术后化疗组成的组。

22.根据权利要求4-6和8-18中任一项所述的方法，其中，所述继发性癌是继发性乳腺癌转移癌。

23.一种用于诊断受试者上皮性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌和/或倾向于患有上皮性卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症、透明细胞肾癌的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个能够识别所述表达水平、拷贝数和/或所述MECOM基因座中至少一个基因的蛋白表达的探针。

24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述探针是至少一种结合EVI1和/或MDS1蛋白质的适配体。

25.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述探针是至少一种结合EVI1和/或MDS1蛋白质的抗体。

26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中，所述探针是至少一种直接作用或结合EVI1和/或MDS1蛋白质的药物。

27.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述拷贝数采用选自由定量PCR检测、原位杂交、Southern印迹杂交法、多重连接探针扩增(MLPA)和短荧光片段的多重定量PCR(QMPSF)组成的至少一种方法确定。

28.一种计算机系统，所述计算机系统具有配置用于执行根据权利要求1-22任一项所述方法的处理器。

29.一种计算机程序产品，如有形的数据存储装置，所述计算机程序产品通过计算机可读，且所述计算机程序产品包含通过计算机系统的处理器可操作的指令使所述处理器执行根据权利要求1-22任一项所述的方法。

30.一种核苷酸序列，所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO：1-3、片段、衍生物、变体和它的互补序列组成的组。