CN104062434A

CN104062434A - Ska1蛋白：前列腺癌早期筛查与诊断的靶标分子

Info

Publication number: CN104062434A
Application number: CN201410191538.5A
Authority: CN
Inventors: 高维强; 宣建武; 李佳
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2014-05-08
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2014-09-24

Abstract

本发明提供了SKA1蛋白在作为靶标分子在制备前列腺癌早期筛查与诊断试剂中的应用。本发明发现SKA1蛋白在前列腺癌前病变与前列腺癌中过表达，SKA1蛋白的过表达诱导人前列腺上皮细胞多中心体的产生，促使人前列腺上皮细胞发生癌变的转化。经验证前列腺特异性过表达SKA1的转基因小鼠发生自发性前列腺肿瘤。SKA1蛋白的表达量还与临床前列腺癌前病变以及癌组织中多中心体细胞出现的比例正相关。这些证据充分证实了SKA1可以作为早期前列腺癌筛查与诊断的靶标分子。本发明为前列腺癌早期筛查与诊断提供了新的途径。

Description

SKA1蛋白:前列腺癌早期筛查与诊断的靶标分子

技术领域

本发明涉及SKA1蛋白作为前列腺癌早期筛查与诊断的靶标分子的用途。

背景技术

前列腺癌是欧美国家排名第二的男性“杀手”，而随着生活质量的提高，人口老龄化，前列腺癌在中国的发病率迅速升高。据报道，我国每年约有7-8万名前列腺癌新增病例，发病率以每年25％-30％的速度增长，成为发病率增长最快的恶性肿瘤，严重威胁男性健康。前列腺癌早期发病症状不明显。被诊断时，肿瘤已增大或发生远端转移；此时，病变已属晚期，预后效果差，生存率低。因此，前列腺癌的早期筛查与诊断对降低前列腺癌的发病率与提高疗效具有重要意义。

中心体是维持细胞分裂中两级纺锤体形成的重要细胞器。中心体由中心粒(Centriole)与中心粒外周蛋白(Peri-centriolar protein，PCM)组成。中心粒在每个细胞分裂周期复制一次，调控中心体的数目。中心粒复制起始于有丝分裂前的S期，复制时每个母本中心粒在其附近产生一个子代中心粒。中心粒于G2期完成复制，复制后的2对中心粒组建两个中心体，为有丝分裂做准备。有丝分裂中，两个中心体在有丝分裂极的两端牵引纺锤丝运动，完成有丝分裂。然而，多数肿瘤细胞中存在多个中心体(多于2个中心体)。多中心体诱导染色体的不稳定，导致抑癌与致癌基因的缺失或过表达，癌症治疗过程中耐药性的产生，并与肿瘤的复发与转移成正相关。临床研究表明实体肿瘤组织中多中心体细胞出现的比例越大，肿瘤的恶性度越高，预后效果越差。最新临床研究证实多中心体出现在癌前病变组织中。有证据表明多中心体可通过引起成体干细胞分裂模式的紊乱诱导肿瘤的发生，说明多中心体在癌症发生早期就已发挥致病效应。现有研究表明部分调控中心粒复制的基因或蛋白恰恰是致癌或抑癌基因。例如，乳腺癌中BRCA1基因的突变或Nlp基因的过表达，均能够引起多中心体的出现并导致乳腺癌的发生。BRCA1基因的突变现已成为乳腺癌早期诊断与筛查的重要靶标分子，极大地降低了乳腺癌的发病率。虽然多中心体与前列腺癌的发生与发展密切相关，并且临床前列腺癌前病变组织中也已检测到数目可观的多中心体，但是迄今为止尚未在临床上找到通过诱导细胞多中心体的产生而促进前列腺癌发生与发展的致病源分子。

纺锤体与着丝粒结合蛋白SKA1(spindle and kinetochore-associated protein1)，属于纺锤体与着丝粒结合蛋白SKA家族。SKA1是微管结合蛋白，负责将其家族中另外两个成员SKA2与SKA3结合到微管上形成SKA复合物。SKA复合物具有保持有丝分裂中纺锤体微管与着丝粒稳定结合的作用，从而确保有丝分裂的顺利完成。本发明的研究发现，SKA1蛋白除了有丝分裂期在微管与着丝粒处富集外，在中心体也有富集。与正常前列腺组织相比，SKA1在前列腺癌前病变以及肿瘤组织中均过表达。SKA1的过表达导致前列腺上皮细胞出现多中心体。最为重要的是，前列腺特异性过表达SKA1的转基因小鼠中，有34％的小鼠(19/56)出现癌前病变，21％(12/56)的小鼠出现自发性前列腺肿瘤，表明SKA1是致癌基因。随后，在对前列腺癌前病变与前列腺癌临床标本的筛查中发现，SKA1的表达水平与这些癌前病变或癌组织中多中心体出现的比例成正相关。

发明内容

本发明的目的是从诱导前列腺上皮细胞产生多中心体的分子与蛋白入手，寻找一种能够用于前列腺癌早期筛查与诊断的靶标分子，其应具有以下特征(1)这种蛋白在临床前列腺肿瘤中异常表达(2)这种蛋白的异常表达能够诱导前列腺上皮细胞中多中心体的产生(3)这种蛋白的异常表达能够影响起前列腺癌的发生或发展(4)这种蛋白的异常表达与临床标本中多中心体的产生直接相关。

本发明提供了SKA1蛋白在作为靶标分子在制备前列腺癌早期筛查与诊断试剂中的应用。

本发明还提供了用于检测SKA1蛋白的试剂在制备前列腺癌早期筛查与诊断试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种前列腺癌早期筛查与诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测SKA1蛋白表达水平的试剂。

优选地，所述的用于检测SKA1蛋白表达水平的试剂为兔抗人SKA1多克隆抗体。(如Sigma，HPA045495)。

本发明发现SKA1蛋白在前列腺癌前病变与前列腺癌中过表达，SKA1蛋白的过表达诱导人前列腺上皮细胞多中心体的产生，促使人前列腺上皮细胞发生癌变的转化。经验证前列腺特异性过表达SKA1的转基因小鼠发生自发性前列腺肿瘤。SKA1蛋白的表达量还与临床前列腺癌前病变以及癌组织中多中心体细胞出现的比例正相关。这些证据充分证实了SKA1可以作为早期前列腺癌筛查与诊断的靶标分子。本发明的原理如图9所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明发现并证实了SKA1蛋白可以作为前列腺癌早期筛查与诊断的靶标分子，为前列腺癌早期筛查与诊断提供了新的途径。

附图说明

图1A为实施例1中的免疫组化染色图；标尺：200μm。

图1B为实施例1中的免疫组化评分图；

图1C为实施例1中的PCR检测结果图；

图2A为用鼠源前列腺上皮特异性启动子PSP94启动小鼠Ska1基因的表达示意图；

图2B为实施例2中的转基因小鼠免疫组化染色图；标尺：10μm。

图3A为对SKA1-GFP分裂间期细胞进行抗γ-TUBULIN的免疫荧光染色图，SKA1(绿色)与中心体标记蛋白γ-TUBULIN(紫色)在分裂间期重合。DAPI染细胞核(蓝色)。标尺：20μm。

图3B为对SKA1-GFP分裂期细胞进抗γ-TUBULIN的免疫荧光染色图图；SKA1(绿色)与中心体标记蛋白γ-TUBULIN(紫色)在有丝分裂期重合。DAPI染细胞核(红色)。标尺：20μm。图3C为实时动态活体连续观测细胞分裂图；细胞核用H2B-RFP标记，显示SKA1在有丝分裂过程中位于中心体位置。标尺：20μm。

图4A为对表达SKA1-GFP的人前列腺上皮细胞进行抗中心粒标志蛋白CENTRIN3的免疫荧光染色图。分裂间期以及有丝分裂期，SKA1-GFP(绿色)均与CENTRIN3(红色)共定位。同时，上皮细胞中不仅有正常数目的中心粒，还有多拷贝中心粒的出现。标尺，2.5μm。

图4B为多拷贝SKA1-GFP处于集合与分散两种状态下对其进行抗中心体蛋白γ-TUBULIN，CEP135和CP110的免疫荧光染色图。转染SKA2-RFP或SKA3-RFP，检测SKA2、SKA3是否与SKA1共定位。标尺，2.5μm。

图5A为转染GFP的对照细胞与SKA1-GFP细胞同步化进入中心粒复制的S期后，进行抗中心粒标志蛋白CENTRIN3(红色)的免疫荧光染色图，统计细胞中＜4，＝4或＞4个中心粒的数目(每组检测细胞＞200个)。过表达SKA1-GFP后，RWPE1上皮细胞的中心粒出现多拷贝复制，DU145前列腺癌细胞系中心粒多拷贝复制细胞的比例上升。内嵌框内是放大的中心粒。标尺，20μm。

图5B为实时连续动态拍摄过表达SKA1的人前列腺上皮细胞中心粒复制的过程图。为检验复制的多拷贝SKA1-GFP是中心粒，对相应时间点的细胞固定后，进行抗CENTRIN3的免疫荧光染色。内嵌框内是放大的图像。标尺，20μm。

图6A为分别转染了对照与干扰SKA1表达的siRNA序列的细胞同步化进入S期后，固定并进行抗CENTRIN3的免疫荧光染色图。

图6B为实时定量PCR检测RWPE1细胞siRNA干扰24与48小时后，SKA1的相对表达量图。标尺，20μm。

图6C为RWPE1细胞siRNA分别干扰24小时与48小时后，细胞中心粒的数目图；(每组检测细胞＞200个)

图6D为实时定量PCR检测DU145细胞siRNA干扰24与48小时后，SKA1的相对表达量图；

图6E为DU145细胞siRNA分别干扰24小时与48小时后，细胞中心粒的数目图；(每组检测细胞＞200个)

图7A为将过表达SKA1的前列腺上皮细胞与对照细胞进行抗中心体标记蛋白γ-TUBULIN(绿色)的免疫荧光染色图，细胞核用DAPI染色(红色)。过表达SKA1后出现多中心体细胞(箭头)。对多中心体细胞计数后显示，约有45％的前列腺上皮细胞在过表达SKA1后出现多中心体，而几乎所有(＞97％)转染对照载体的上皮细胞为正常的1或2个中心体。

图7B为裸鼠体重以及移植物的体积图；将因过表达SKA1后出现多中心体的人前列腺上皮细胞与对照细胞分别植入裸鼠皮下，从植入后1周起检测裸鼠体重以及移植物的体积。

图7C为将过表达SKA1的人前列腺细胞形成的移植团块切片，H&E染色或进行抗Ki67、SKA1、γ-TUBULIN的免疫染色图。数字标记的图片为对应上方图片内嵌框图片的放大。标尺：20μm。

图8A为将6例前列腺癌前病变与25例前列腺癌组织的切片进行抗中心体标记蛋白γ-TUBULIN的免疫组织化学染色图。为方便统计每个细胞中的中心体数目，细胞与细胞之间的边界用抗Pan-cadherin抗体染色。细胞核用DAPI染色。标尺：50μm。d，20μm。

图8B为正常前列腺、上皮内瘤(癌前病变)、以及不同恶性度的肿瘤组织样本中多中心体细胞所占平均比例图。

图8C为SKA1的表达与前列腺癌前病变与肿瘤组织中多中心体细胞所占比例成正相关示意图，相关系数(r)为0.933。

图9为本发明的原理图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1：

与正常前列腺组织相比，SKA1蛋白在前列腺癌前病变与癌组织中高表达：

1、抗SKA1免疫组织化学染色：

将6例新鲜前列腺癌前病变与25例癌组织石蜡包埋并切成5m切片。将不同组织的切片按顺序排列到一张载玻片上，进行免疫组织化学染色。具体操作方法为：

1.1预处理：

将新鲜前列腺癌前病变以及癌组织的石蜡切片60℃脱蜡1小时。3％H₂O₂(Sigma，7722-84-1)室温25℃孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗3次，PBS(Invitrogen，14190250)浸泡5分钟。

1.2抗原热修复：

将2000ml的0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5～6分钟后)，计时2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS冲洗2分钟×3次。

所述的0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)的配制方法为：将3g枸橼酸三钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)和0.4g枸橼酸(C₆H₈O₇·H₂O)溶于1L蒸馏水中。

1.3将抗原热修复后的前列腺癌前病变以及癌组织进行免疫组化染色：

10％正常山羊血清(PBS稀释，Jackson Laboratory，005-000-121)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，滴加1∶400比例稀释的兔抗人SKA1一抗(Sigma，HPA045495)，4℃过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加1∶200比例稀释的生物素标记羊抗兔二抗(1％BSA-PBS稀释，Jackson Laboratory，111-065-144)，37℃孵育30分钟；室温孵育2小时。PBS冲洗，5分钟×3次。滴加1∶200比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释；Pierce，N200)，37℃孵育30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次。DAB辣根过氧化物显色试剂盒显色(Cloud-Clone Corp，USCNdab01)。自来水充分冲洗，苏木素(Sigma，H3136)复染细胞核，指甲油封片。

2、病理鉴定

免疫组化后的结果根据SKA1-阳性染色所占的范围以及染色强度进行评分，具体如下：由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。SKA1染色阳性表达为细胞胞浆上呈现棕黄色颗粒；采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。1、阳性着色细胞数：每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数＜5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。2、阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。3、两者计分相加得分为SKA1免疫组化阳性得分。

如图1A和1B显示，SKA1蛋白在前列腺癌前病变(6例；p＜0.0018)与癌组织(25例；p＜0.0001)中的表达显著性地高于癌旁正常前列腺组织。SKA1蛋白在6例上皮内瘤(前列腺癌前病变)以及25例不同恶性度的前列腺肿瘤组织中(从高分化到低分化)的表达呈强阳性(褐色)，而在大部分正常前列腺组织中的表达呈弱阳性或接近阴性。

3、实时定量PCR(QPCR)检测SKA1的表达

临床手术电切的10例前列腺癌组织以及10例癌旁正常前列腺组织碾碎后，用总RNA提取试剂盒提取(Invitrogen，IS10006)。总RNA的提取方法参照供应商的说明书。RNA(0-5ug)用Superscript First-Strand Synthesis System(Invitrogen，11904018)反转录，特异性引物为SKA1(上游引物5’ACATGAAATCCCGCTTAAC’3，下游引物5’ACGAGTAAGTCCTCCCCCTC’3；NM_001039535.2)，内参为GAPDH(上游引物5’GAGCCAAAAGGGTCATCATC’3，下游引物5’GTCAGGTCCACCACTGACAC’3；NM_002046.3)。PCR扩增的条件为95℃预变性5分钟，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环。扩增在ABI7900QPCR仪上进行(Applied Biosystems)。

如图1C所示，前列腺癌组织(10例)中SKA1基因的表达水平约是正常前列腺组织(10例)的3至25倍。与正常前列腺组织相比，SKA1mRNA在10个前列腺癌标本中均高表达，其表达可升高3至25倍。标尺：200μm。

实施例2

转基因小鼠前列腺特异性过表达SKA1导致前列腺肿瘤的发生：

1、PSP94-Ska1转基因小鼠的构建：

构建含3.84kb PSP94(prostatic secretory protein of94amino acid residues)启动子/增强子序列的质粒，方法类似于专利“Generation of transgenic mousemodels for the development of prostate cancer using regulatory regions of the psp94gene”(CA2396891A1，2003-2-38)，区别仅在于将小鼠Ska1cDNA序列(NM_025581.4)替换原载体上的SV40T基因，构建PSP94-Ska1质粒。显微注射PSP94-Ska1质粒到C57BL/6×CBA(Mice database，B6CBAF1/J-)的受精卵中。共7个转基因系，每个转基因系8只小鼠，共生产56只PSP94-Ska1小鼠。

2、小鼠前列腺组织样本石蜡包埋及切片

将小鼠饲养至30-52周龄时，解剖老鼠，取前列腺。将前列腺组织放入10％的福尔马林溶液(Sigma，F8775)固定。24小时后，用流水冲洗组织30分钟。随后将组织置于80％乙醇中60分钟，1次；95％乙醇60分钟，2次，95％乙醇60分钟，1次；无水乙醇30分钟，3次。然后组织放在二甲苯20分钟，3次。接下来组织放入软蜡(熔点45-50℃)中60分钟；硬蜡(熔点56-58℃)中60分钟；将浸蜡后的组织块按切面朝下，用加热的镊子轻轻夹取埋入含有熔蜡的包埋模具中。当蜡块冷却至蜡块面出现一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速冷却。从包埋模具中取出包埋蜡块，用刀片去除组织块周围多余石蜡，将包埋蜡块修正成为规则的正方形或长方形。15-20μm连续切片。

3、H&E染色

3.1预处理

将56只PSP94-Ska1转基因小鼠及56只野生型小鼠的石蜡切片60℃脱蜡1小时。二甲苯脱蜡10分钟，3次。无水乙醇，5分钟，两次，95％乙醇5分钟，两次，85％乙醇，5分钟两次，75％乙醇，5分钟，1次；自来水洗，2分钟，1次。

3.2染色

苏木精染色5分钟，自来水洗1分钟，1％盐酸乙醇分化10秒，自来水洗1分钟，0.2％氨水返蓝30秒，自来水洗1分钟，伊红染色5分钟，自来水速洗。

3.3脱水、透明、封固：

80％乙醇20s；90％乙醇20s；95％乙醇3分钟，两次；无水乙醇5分钟，两次；二甲苯5分钟三次，中性树胶封固。

4、抗SKA1免疫组织化学染色，见实施例1的步骤1.3。

5、病理检测：

转基因小鼠的病理检测根据Animal Models of Human Prostate Cancer：TheConsensus Report of the New York Meeting of the Mouse Models of Human CancersConsortium Prostate Pathology CommitteeIttmann M，Huang J，Radaelli E，et al.Cancer Res2013；73：2718-2736的规则分别由两个病理医生完成。

6、实验结果

前列腺特异性过表达SKA1蛋白的转基因小鼠产生自发性前列腺肿瘤。如图2A所示，构建转基因小鼠所用质粒，用鼠源前列腺上皮特异性启动子PSP94启动小鼠Ska1基因的表达。30周到52周，PSP94-Ska1小鼠前列腺出现病变。如图2B所示，H&E病理鉴定显示34％(19/56)的PSP94-Ska1小鼠出现上皮内瘤(癌前病变)，21％(12/56)的小鼠出现前列腺肿瘤，而野生型小鼠前列腺的病理检测显示完全正常。用抗SKA1蛋白的免疫组化验证了SKA1在PSP94-Ska1转基因小鼠上皮内瘤以及肿瘤组织中高表达，而在野生型正常小鼠前列腺组织中表达较低或呈阴性。标尺：10μm。

实施例3：SKA1蛋白在中心体富集

1、细胞培养：

STC-RWPE1：RWPE-1前列腺上皮细胞系(由ATCC公司购买；CRL-11609^TM)。

STC-DU145：DU145前列腺肿瘤细胞系(由ATCC公司购买；HTB-81^TM)。

STC-PC3：PC-3前列腺肿瘤细胞系(由ATCC公司购买；CRL-1435^TM)。

STC-22RV1：22Rv1前列腺肿瘤细胞系(由ATCC公司购买：CRL-2505^TM)。

STC-LnCap：LNCap前列腺肿瘤细胞系(由ATCC公司购买：CRL-1740^TM)。

N1培养基：前列腺上皮细胞系培养基，在DMEM/F12培养基(Gibco，11330)中添加5％胎牛血清(FBS；Invitrogen，12664025)，1mM L-谷氨酰胺(L-Glutamine；Invitrogen，25030081)，1％胰岛素-转铁蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium-X，ITS；Gibco，51500-056)，0.4％牛垂体萃取精华(bovine pituitary extract，BPE；Hammond CellTech；1078-NZ)，5ng/ml表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF；Sigma，E9644)和1x青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin；Invitrogen，15640055)。

C1培养基：前列腺肿瘤细胞培养基：在DMEM培养基(Gibco，11965118)中添加10％胎牛血清、1mML-谷氨酰胺与1x青霉素-链霉素。

STC-RWPE1细胞在N1培养基中培养，STC-DU145、STC-PC3、STC-22RV1、STC-LnCap细胞在C1培养基培养，所有细胞在37℃，5％CO₂的条件下培养。

2、慢病毒载体构建、病毒包装及细胞转染：

a.慢病毒载体构建：

Lenti-SKA1-GFP

(1)PCR扩增SKA1cDNA片段

以pIC291质粒为模板(Addgene，51403)，PCR扩增SKA1cDNA片段(不含终止密码子，NM_001039535.2)。扩增引物上游(含BamHI酶切位点)：5-ATCATCGGATCCGCCACCATGGCCTCGTCAGATCTGGAACAATTATGC-3，扩增引物下游(含AscI酶切位点)：5-ATCATCGGCGCGCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAG-3。PCR扩增的条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环。扩增在ABI7900QPCR仪上进行(Applied Biosystems)。

(2)电泳回收扩增片段

回收片段按照大连宝生物工程有限公司胶回收试剂盒(TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，9762)进行。

(3)用BamHI和AscI双酶切步骤(2)得到的DNA片段

酶切体系如下：DNA片段(约60ng/μl)，10μl；BamHI(New England Biolabs，R0136S)，1μl；AscI(New England Biolabs，R0558S)，1μl；10×BamHI缓冲液(New England Biolabs，R0136S)，5μl；ddH2O，33μl；37℃酶切1小时后，电泳回收DNA片段，方法同步骤(2)。

(4)用BamHI和AscI双酶切pLenti6.3/V5-DEST^TM慢病毒载体(Invitrogen，K5330-00)

酶切体系如下：pLenti6.3/V5-DEST^TM慢病毒载体(约150ng/μl)，6μl；BamHI，1μl；AscI，1μl；10×BamHI缓冲液，5μl；ddH2O，37μl；37℃酶切1小时后电泳回收，电泳回收DNA片段，方法同步骤(2)。

(5)将步骤(3)得到的目的片段DNA插入到步骤(4)回收的pLenti6.3/V5-DEST^TM慢病毒载体片段DNA中。

连接体系如下：10×Ligation缓冲液(New England Biolabs，M0202S)，0.5μl；步骤(3)回收的DNA片段3.0μl，步骤(4)回收的载体DNA片段，1.0μl；T4DNA连接酶(10U/μl；New England Biolabs，M0202S)，0.5μl；16℃连接2h。

(6)转化到感受态细胞

取-70℃冻存的100μl DH5a感受态大肠杆菌(天根生化科技北京有限公司，CB101)，于冰上解冻，加入10μL步骤(5)的连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴热激90s。迅速置于冰上，冰浴5min，使细胞冷却。在超净台上加入预冷的890μL的LB液体培养基(Invitrogen，10855013)，混匀后于37℃，225rpm的条件下振荡培养1.5h。取50μl菌液涂于含Ampicillin的LB平板(Invitrogen，Q601-20)。37℃培养12h，可出现菌落。

(7)质粒提取

牙签挑取单克隆菌落，将牙签放入含Ampicillin(100μg/ml；天根生化科技北京有限公司，RT501)的LB液体培养基(Invitrogen，10855013)，37℃，250rpm摇床，培养16h。菌液离心，4500rpm，4℃，30min。菌液沉淀提取质粒，由质粒中抽试剂盒(QianGene，12245)完成。

H2B-RFP慢病毒载体由Addgen(22525)购买。

b.病毒包装

采用ViraPower^TM Lentiviral Expression Systems(Invitrogen，K496000)。将构建的慢病毒载体与包装系统中提供的质粒共转染病毒包装细胞293T(由购买的包装系统提供)。培养72小时，收集含有病毒的上清培养液。在Ultra-clear SW28离心管中加入病毒上清液。超速离心机(Beckman SW28)，4℃，25，000rpm(82，700g)超速离心2小时。200μlPBS溶解沉淀。

c.细胞转染

慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10⁵/孔铺到24孔板中(Corning，3337)。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10⁵/孔左右。24小时后，加入500μl病毒悬液(含有6μg/ml polybrene；包装系统提供)。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。

共构建7株细胞系：

STC-N1：SKA1-GFP慢病毒转染RWPE1细胞构建SKA1-GFP-RWPE1细胞；

STC-D1：SKA1-GFP慢病毒转染DU145细胞构建SKA1-GFP-DU145细胞；

STC-P1：SKA1-GFP慢病毒转染PC3细胞构建SKA1-GFP-PC3细胞；

STC-R1：SKA1-GFP慢病毒转染22RV1细胞构建SKA1-GFP-22RV1细胞；

STC-L1：SKA1-GFP慢病毒转染LnCap细胞构建SKA1-GFP-LnCap细胞；

STC-N1-H1：SKA1-GFP与H₂B-RFP慢病毒共转染RWPE1细胞构建SKA1-GFP-RWPE1/H₂B-RFP细胞；

STC-D1-H1：SKA1-GFP与H₂B-RFP慢病毒共转染DU145细胞构建SKA1-GFP-DU145/H₂B-RFP细胞；

3、细胞同步化到有丝分裂期

将步骤2中构建的STC-N1、STC-D1、STC-N1-H1、STC-D1-H1细胞用含有2mM thymidine(Sigma，T1895)的N1培养液(用于培养STC-N1、STC-N1-H1)、或含有2mM thymidine的C1培养液(用于培养STC-D1、STC-D1-H1)培养19小时后，换不含thymidine的N1培养液(用于培养STC-N1、STC-N1-H1)或C1培养液(用于培养STC-D1、STC-D1-H1)培养9小时，再次用含有2mMthymidine的N1培养液(用于培养STC-N1、STC-N1-H1)、或含有2mM thymidine的C1培养液(用于培养STC-D1、STC-D1-H1)培养16小时，换成不含thymidine的N1培养液(用于培养STC-N1、STC-N1-H1)或C1培养液(用于培养STC-D1、STC-D1-H1)继续培养9小时后，细胞将同步化到有丝分裂期。

4、细胞免疫荧光染色

将步骤3中同步化到有丝分裂期的STC-N1细胞或STC-D1细胞从孵箱中取出。用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟。4％的甲醛室温固定10分钟。1×PBS洗3次，每次5分钟。0.5％Triton X-100透化10分钟。1×PBS洗3次，每次10分钟。1％BSA室温封闭30分钟。加兔抗人γ-TUBULIN(Sigma，T3559，用1％BSA1∶1000稀释)，放在湿盒里，4℃过夜。1×PBS洗3次，每次10分钟。加二抗594-羊抗兔(Jackson ImmunoResearch，111-585-003，用1％BSA1∶500稀释)闭光孵育30分钟。1×PBS洗3次，每次10分钟。20μl含DAPI封片剂封片(Vector，H-1500)，指甲油固定。

5、实时活体成像(Time-lapse imaging)

将步骤3同步化的STC-N1-H1细胞或STC-D1-H1细胞进行实时活体成像观察。实时活体成像用共聚焦显微镜完成(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)，成像在37℃、5％CO₂、潮湿的封闭环境内进行。用20x物镜，每10分钟一次获取图像，共记录2小时。

6、数据分析

将步骤4所得结果在共聚焦显微镜(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)下观察、拍照，如图3A所示。将步骤5的结果选取时间点作图，如图3B所示。

7、实验结果

实验结果表明，SKA1蛋白除有丝分裂期在纺锤丝与着丝粒结合处富集外，还在中心体富集。如图3B所示，将SKA1与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合形成SKA1-GFP融合蛋白，由GFP发出的绿色荧光指示SKA1蛋白的位置。用慢病毒载体携带SKA1-GFP转染前列腺正常上皮细胞(RWPE1)或前列腺癌细胞(DU145、PC3、22RV1、LnCap)后发现，与前期的报道一致，从分裂前中期到分裂末期，SKA1蛋白位于纺锤体与着丝粒结合处。

如图3A所示，对SKA1-GFP细胞进行抗γ-TUBULIN的免疫荧光染色，SKA1(绿色)与中心体标记蛋白γ-TUBULIN(紫色)在分裂间期重合，DAPI染细胞核(蓝色)，如图3B所示，SKA1(绿色)与中心体标记蛋白γ-TUBULIN(紫色)在有丝分裂期重合。DAPI染细胞核(红色)。抗中心体标记蛋白γ-TUBULIN(紫色)的免疫荧光染色发现，在有丝分裂间期以及分裂期SKA1均在中心体富集。

如图3C所示，用H2B-RFP标记细胞核(红色荧光)，对细胞分裂进行实时动态活体成像(Time-lapse imaging)，如图3C所示，显示SKA1在有丝分裂过程中位于中心体位置，SKA1蛋白在有丝分裂的动态变化中仍然位于中心体，验证了免疫荧光染色的结果。

实施例4：SKA1是中心粒的组成蛋白

1、细胞培养

同实施例3中步骤1

2、慢病毒载体构建，病毒包装及细胞转染

Lenti-SKA2-RFP与Lenti-SKA3-RFP慢病毒载体构建：

(1)PCR扩增SKA2与SKA3的cDNA片段

提取STC-RWPE1细胞的mRNA，由mRNA提取试剂盒完成(Invitrogen，12173-011A)将mRNA反转录为cDNA，由cDNA反转录试剂盒完成(Invitrogen，11752250)。并以此cDNA为模板(STC-RWPE1-cDNA)，PCR扩增SKA2cDNA片段(不含终止密码子，NM_182620.3)，所用上游引物为(含BamHI酶切位点)5’-ATCATCGGATCCGCCGCATTTGTGCTACTGTGAA-3’；下游引物为(含AscI酶切位点)5’-ATCATCGGCGCGCGCTCCAGGTCTGTTTGCTTCTG-3’，PCR扩增的条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环。扩增在ABI7900QPCR仪上进行(Applied Biosystems)。

以STC-RWPE1-cDNA为模板，PCR扩增SKA3cDNA片段(不含终止密码子，NM_145061.5)，所用上游引物为(含BamHI酶切位点)：5’-ATCATCGGATCCATTAAAGCAGTGCCACCCAGT-3’；下游引物为(含AscI酶切位点)5’-ATCATCGGCGCTTCTTTGTTGCTGACATCTCGGA-3’，PCR扩增的条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸1min，35个循环。扩增在ABI7900QPCR仪上进行(Applied Biosystems)。

(2-7)的步骤同实施例3步骤2a(2-7)。

病毒包装：同实施例3，步骤2

细胞转染：与实施例3，步骤2相似，仅慢病毒载体质粒不同，共构建4株细胞系：

STC-N2：SKA1-GFP慢病毒和SKA2-RFP慢病毒共转染RWPE1细胞构建SKA1-GFP/SKA2-RFP-RWPE1细胞

STC-N3：SKA1-GFP慢病毒和SKA3-RFP慢病毒共转染RWPE1细胞构建SKA1-GFP/SKA3-RFP-RWPE1细胞

STC-D2：SKA1-GFP慢病毒和SKA2-RFP慢病毒共转染DU145细胞构建SKA1-GFP/SKA2-RFP-DU145细胞

STC-D3：SKA1-GFP慢病毒和SKA3-RFP慢病毒共转染DU145细胞构建SKA1-GFP/SKA3-RFP-DU145细胞

3、细胞同步化到有丝分裂期

将STC-N1、STC-D1细胞株以及步骤2中构建的STC-N2、STC-N3、STC-D2、STC-D3细胞株同步化到有丝分裂期，方法同实施例3步骤3。

4、细胞免疫荧光染色

实验步骤类似于实施例3中步骤4，区别在于所用抗体不同，本实施例中所用抗体如下：一抗，小鼠抗人CENTRIN-3(Sigma，WH0001070M1；1∶100)，小鼠抗人γ-TUBULIN(Sigma，T6557；1∶1000)；兔抗人CEP135(Sigma，SAB4503685；1∶200)，驴抗人CP110(Sigma，SAB2502023；1∶200)。二抗，594-羊抗鼠(Jackson ImmunoResearch，111-585-003，1∶500)；594-羊抗兔(Jackson ImmunoResearch，111-585-003；1∶500)；594-驴抗羊(Jackson ImmunoResearch，705-585-147；1∶500)。

5、数据分析

步骤4的结果在共聚焦显微镜(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)下观察、拍照，如图4所示。

6、实验结果：

中心体由中心粒与中心粒外周蛋白组成。通过抗中心粒标记蛋白Centrin-3的免疫荧光染色发现，SKA1在分裂间期以及分裂期皆与Centrin-3共定位(图4A)，表明SKA1是中心粒蛋白。通过免疫染色，我们同时发现有些前列腺上皮细胞中出现了多拷贝中心粒(4个以上)，表明这些细胞中心粒复制异常(图4A)。为进一步验证SKA1是中心粒蛋白，用抗中心粒蛋白CEP135、CP110或周围蛋白γ-TUBULIN的抗体进行免疫荧光染色。因中心粒复制过程中母本与子代结合在一起，所以当发生多拷贝复制时，母与多个子代结合在一起呈现花朵样状态，这种表型将维持于整个分裂期，直到下一细胞周期的G1期。细胞进入G1期后，子代中心粒必须与母本分开成为独立中心粒后才可进入下一轮复制。因此集合与分散是标志复制与成熟的两种重要形态，我们对这两种状态下的表型都进行了鉴定。转染SKA1-GFP的细胞无论是在集合或者分散状态时都有多拷贝的表型。γ-TUBULIN免疫组织荧光染色表明这些多拷贝的子代来自于同一个母本(图4B)。另外，SKA1无论是呈集合或者散开状态时都与CEP135和CP110共定位(图4B)，进一步表明SKA1是中心粒蛋白。为证实这一结论，我们还将细胞分别转染SKA2-RFP与SKA3-RFP的红色荧光融合蛋白，发现SKA1-GFP与SKA2-RFP、SKA3-RFP共定位(图4B)，表明SKA家族都是中心粒蛋白。

实施例5：SKA1的过表达引起中心粒的多拷贝复制

1、细胞培养

参照实施例3中步骤1。

2、慢病毒载体构建、病毒包装及细胞转染。

Lenti-PLK4慢病毒载体构建：

(1)PCR扩增PLK4cDNA片段

以pWZL Neo Myr Flag PLK4质粒(addgene，20522)为模板，PCR扩增PLK4序列，所用上游扩增引物(含HindIII酶切位点)：5’-GACACAAGCTTGCGACCTGCATCGGGGAGAAGATCGAGGATT-3’；下游扩增引物(含XhoI酶切位点)5’-TCATCCTCGAGTCAATGAAAATTAGGAGTCGGATTAGAAAACATCA-3’。PCR扩增的条件为95℃预变性5分钟，95℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸3min，24个循环。扩增在ABI7900QPCR仪上进行(Applied Biosystems)。

(2)电泳回收扩增片段

(3)用HindIII和XhoI双酶切步骤(2)得到的DNA片段

酶切体系如下：DNA片段(约60ng/μl)，10μl；HindIII(New England Biolabs，R0104S)，1μl；XhoI(New England Biolabs，R0558S)，1μl；10×BamHI缓冲液(New England Biolabs，R0146S)，5μl；ddH2O，33μl；37℃酶切1小时后，电泳回收DNA片段，方法同步骤(2)。

(4)用HindIII和XhoI双酶切pLenti6.3/V5-DEST^TM慢病毒载体(Invitrogen，K5330-00)

酶切体系如下：pLenti6.3/V5-DEST^TM慢病毒载体(约150ng/μl)，6μl；HindIII，1μl；XhoI，1μl；10×BamHI缓冲液，5μl；ddH2O，37μl；37℃酶切1小时后电泳回收，电泳回收DNA片段，方法同步骤(2)。

(6-7)的步骤同实施例3步骤2a(6-7)。

病毒包装：同实施例3，步骤2

STC-N1-C1：pLenti6.3/V5-DEST^TM GFP慢病毒转染STC-RWPE1细胞获得GFP-RWPE1细胞

STC-D1-C1：pLenti6.3/V5-DEST^TM GFP慢病毒转染STC-DU145细胞获得GFP-DU45细胞

STC-N4：Lenti-Plk4慢病毒转染STC-RWPE1细胞获得PLK4-RWPE1细胞

STC-D4：Lenti-Plk4慢病毒转染STC-DU145细胞获得PLK4-DU145细胞

3、细胞同步化到G1/S临界点

将STC-N1、STC-D1、STC-N1-H1及步骤2构建的STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1-C1、STC-D4用含有2mM thymidine的培养基培养19小时后，换为新鲜培养基培养细胞9小时，然后用含有400μM L-Mimosine(Sigma，M0253)的培养基培养细胞12小时后，换为新鲜培养基，此时细胞已同步化到G1/S临界点。

4、细胞免疫荧光染色

处理1：将步骤3中同步化到G1/S临界点的STC-N1、STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1、STC-D1-C1、STC-D4细胞继续培养3小时后4％甲醛固定。

处理2：将步骤3中同步化到G1/S临界点的STC-N1-H1细胞在刚换为新鲜培养基(记录为0h)，以及继续培养3小时，每隔1小时(取1h，2h，，3h)4％甲醛固定。

将处理1与处理2的细胞抗CENTRIN3细胞免疫荧光染色，步骤类似于实施例3中步骤4。区别在于，所用的抗体不同，本实施例中所用的抗体：一抗，小鼠抗人CENTRIN-3(Sigma，WH0001070M1；1∶1000)；二抗，Alexa594-羊抗鼠(Jackson ImmunoResearch，111-585-003，1∶500)。

5、实时活体成像(Time-lapse imaging)

将步骤3中同步化到的STC-N1-H1细胞进行实时活体成像。实时活体成像用共聚焦显微镜完成(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)，成像在37℃，5％CO₂，潮湿的封闭环境内进行。记录中心粒复制，用60x油镜，每20分钟一次获取图像，记录3小时。

6、数据分析

将步骤4的结果在共聚焦显微镜(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)下观察、拍照；并统计STC-N1、STC-N1-C1、STC-N4、STC-D1、STC-D1-C1、STC-D4细胞中＜4，＝4或＞4个中心粒的数目(每组检测细胞＞200个)。统计结果以平均数加减方差的形式呈现，数据分析用t检验。数据处理用PRISM软件完成(GraphPad，CA，USA)，如图5A所示。将步骤5连续拍摄的图像取时间点作图，并将步骤4中STC-N1-H1细胞的结果在显微镜下观察、拍照，如图5B所示。

7、实验结果

为证明SKA1过表达能够充分引起前列腺上皮细胞中心粒的多拷贝复制，本发明将细胞同步化到G1/S临界点，当换成新鲜细胞液培养后，细胞同步化进入S期，开始中心粒的复制。转染了对照质粒的上皮细胞(＞95％)进行正常的复制，复制后出现2对共4个中心粒(图5A)。过表达SKA1后，43.3±5.8％的上皮细胞复制后出现4个以上的中心粒(图5A)，表明过表达SKA1的中心粒进行多拷贝复制。本发明同时发现，SKA1引起中心粒多拷贝复制的能力与PLK4(Polo-like kinase4)磷酸激酶能力相当，后者已被证实能够引起中心粒的多拷贝复制。上述结果在DU145前列腺癌细胞系中也得到了验证(图5A)。为证实多拷贝中心粒的出现是因在一次复制中一个母本复制多个子代引起，而不是多次复制导致，本发明对过表达SKA1的前列腺上皮细胞中心粒复制的过程进行了实时动态连续拍摄。结果表明，本来静止于G1/S临界点的细胞，一旦同步化进入S期，能够在3小时内(一个复制周期)依靠一个母本合成多个子代中心粒(图5B)。

实施例6：SKA1表达水平的降低阻碍中心粒的复制

1、细胞培养，

将STC-N1和STC-D1细胞参照实施例3中的步骤1进行培养。所用培养基为STC-N1在N1培养基，STC-D1在C1培养基

2、小RNA干扰(siRNA)序列的构建与转染：

设计用于干扰SKA1表达的siRNA的序列：

SKA1-1：5’-GGACUUACUCGUUAUGUUA-3’；

SKA1-2：5’-UAUAGUGGAAGCUGACAUA-3’。

Control：5’-GUGAUAGCUGUCUUAUACU-3’。

将上述的SKA1-1与SKA1-2混合(1∶1比例)转染STC-N1或STC-D1细胞干扰SKA1在STC-N1或STC-D1细胞中的表达。同时用control RNAi序列转染STC-N1或STC-D1细胞作为对照。siRNA转染由试剂盒(Invitrogen，13778)完成。

3、将干扰了SKA1表达的STC-N1、STC-D1细胞以及其相应的对照细胞进行G1/S临界点同步化处理，参照实施例5的步骤3。

4、细胞免疫荧光染色

将步骤3的细胞进行细胞免疫荧光染色。实验步骤类似于实施例3中的步骤4，区别在于所用抗体不同，本实施例中所用抗体：一抗，小鼠抗人CENTRIN-3(Sigma，WH0001070M1；1∶1000)；二抗，Alexa594-羊抗鼠(JacksonImmunoResearch，111-585-003，1∶500)。

5、实时定量PCR检测细胞中SKA1的表达

对步骤2中干扰后的细胞分别在24小时与48小时提取RNA，并进行SKA1表达水平的检测，步骤同实时例1中的步骤3。

6、数据分析

将步骤4的结果在共聚焦显微镜(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)下观察、拍照，如图6A所示。将步骤5的结果作图，如图6B、6D所示。将步骤3中同步化了的细胞进行统计。统计细胞中＜4，＝4或＞4个中心粒的数目(每组检测细胞＞200个)。统计结果以平均数加减方差的形式呈现，数据分析用t检验。数据处理用PRISM软件完成(GraphPad，CA，USA)，如图6C、6E。

7、实验结果：

分别转染了对照与干扰SKA1表达的siRNA序列的细胞同步化进入S期后，固定并进行抗CENTRIN3的免疫荧光染色，结果如图6A所示。实时定量PCR检测siRNA干扰24与48小时后，SKA1的相对表达量，结果如图6B和6D所示，siRNA分别干扰24小时与48小时后，细胞中心粒的数目(每组检测细胞＞200个)如图6C和6E所示。

如果细胞不断进行细胞分裂，而细胞中的中心粒却不能复制，势必造成子代细胞中心粒数目的减少。为证明SKA1是中心粒复制的重要调控蛋白，用小RNA(siRNA)干扰SKA1的表达，检测中心粒的数目。86.7±3.3％的对照细胞同步化进入S期后正常复制。siRNA干扰SKA1的表达24小时后，有64.0±5.1％的细胞不能正常复制(图6A-图6C)；干扰48小时后，有80±6.3％的上皮细胞不能正常复制。同样的，DU145肿瘤细胞内中心粒的数目也随着干扰时间的延长而不断减少(图6D，图6E)。以上实验表明SKA1是一个重要的中心粒蛋白，调控并且参与中心粒的复制。

实施例7：具有一定比例多中心体的人前列腺上皮细胞裸鼠皮下成瘤

1、细胞培养，

参照实施例3中的步骤1进行培养

2、细胞免疫荧光染色：

具体步骤参照实施例3中步骤4。

3、免疫缺陷型小鼠皮下植瘤与鉴定：

取24只雄性裸鼠(6-8周)麻醉后，皮下注射3x10⁶STC-N1细胞，另取24只雄性裸鼠(6-8周)麻醉后，皮下注射3x10⁶STC-N1-C1细胞。每周检测小鼠体重以及移植物体积，游标卡尺记录肿瘤的长与宽。

根据公式：体积(V)＝0.5a²x b²，其中a为长，b为宽。当小鼠皮下移植物体积达约2cm³时，停止观察。取移植物，浸泡在10％福尔马林过夜，常规方法制作厚度为5μm的组织切片，苏木精-伊红(H&E)染色，由两个不同的病理医生进行病理诊断。所有流程经过上海交通大学小动物委员会允许后进行。

4、将步骤3中的组织切片进行H&E染色，具体步骤参照实施例2中的步骤2。

5、将步骤3中的组织切片进行抗SKA1免疫组织化学染色，具体步骤参照实施例1中的步骤1。

6、将步骤3中的组织切片进行抗Ki67免疫组织化学染色，实验步骤类似于实施例1中的步骤1，区别在于所使用的抗体不同，抗Ki67免疫组织化学染色中使用：一抗，兔抗人Ki67(Epitomics，4203-1；1∶200)，二抗，1∶200比例稀释的生物素标记羊抗兔二抗(1％BSA-PBS稀释，Jackson Laboratory，111-065-144)。

7、将步骤3中的组织切片进行抗γ-TUBULIN免疫组织荧光染色，具体步骤为：

a.预处理

将石蜡切片在60℃脱蜡1小时。二甲苯脱蜡10分钟，3次。无水乙醇，5分钟，两次；95％乙醇5分钟，两次；85％乙醇，5分钟，两次；75％乙醇，5分钟，1次；自来水洗，2分钟，1次。

b.染色：

将预处理后的组织在4％的甲醛室温固定15分钟。1×PBS洗3次，每次5分钟。0.5％Triton X-100透化10分钟。1×PBS洗3次，每次10分钟。1％BSA室温封闭1小时。将小鼠抗人γ-TUBULIN单克隆抗体(Sigma，T6557，用1％BSA1∶200稀释)加到载玻片上，放在湿盒里，4℃过夜。1×PBS洗3次，每次15分钟，加二抗488-羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch，115-545-003，用1％BSA1∶200稀释)加到载玻片上，闭光孵育2小时。1×PBS洗3次，每次15分钟。用20μl含DAPI封片剂封片(Vector，H-1500)，指甲油固定。

8、数据分析

将步骤2所得结果在共聚焦显微镜(TCS SP5II；STED CW；Leica，Solms，Germany)观察、拍照。统计细胞中＜2，＝2或＞2个中心体的数目(每组检测细胞＞200个)。统计结果以平均数加减方差的形式呈现，数据分析用t检验。数据处理用PRISM软件完成(GraphPad，CA，USA)，如图7A所示。对步骤3所得结果进行数据分析和处理，结果都以平均数加减方差的形式呈现，数据分析用t检验。数据处理用PRISM软件完成(GraphPad，CA，USA)，如图7B所示。在显微镜下观察步骤4-7的染色结果，如图7C所示。

9、实验结果：

过表达SKA1后的人前列腺上皮细胞出现中心粒的多拷贝复制，那么这些多拷贝的中心粒能否结合中心粒外周蛋白形成多个独立的中心体？本发明对细胞进行抗中心体标记蛋白γ-TUBULIN的免疫荧光染色，并统计多中心体细胞的比例。实验表明SKA1过表达导致前列腺上皮细胞中心体的扩繁，约45％的前列腺上皮细胞在过表达SKA1后产生多中心体，而对照前列腺上皮细胞则具有正常的1或2个中心体(图7A)。为检测一定比例的人前列腺上皮细胞获得多中心体后能否转化为肿瘤细胞，本发明将过表达SKA1后出现多中心体的上皮细胞与对照细胞分别植入裸鼠皮下。4周后，过表达SKA1的上皮细胞形成肿瘤样团块，而植入的对照细胞在9周观察期内并未生成任何团块(图7B)。将移植物取出后进行H&E染色与病理鉴定，发现这些细胞的核质比显著增大，ki67免疫组化证实细胞分裂旺盛，呈典型的肿瘤细胞特征(图7C)。抗SKA1的免疫组化染色验证了这些细胞高表达SKA1(图7C)。γ-TUBULIN染色证实了由这些上皮细胞转化的肿瘤细胞存在多中心体(图7C)。以上实验表明过表达SKA1可导致人前列腺上皮细胞出现一定比例的多中心体，继而诱导前列腺上皮细胞向癌细胞的转化。

实施例8：

取6例前列腺癌前病变、25例前列腺癌组织以及25例癌旁正常前列腺组织的石蜡切片，进行以下实验，证明SKA1的过表达与临床标本中多中心体的出现呈正相关。

1、将6例前列腺癌前病变、25例前列腺癌组织以及25例正常前列腺组织的石蜡切片进行H&E染色，具体步骤参照实施例2的步骤2。

2、将6例前列腺癌前病变、25例前列腺癌组织以及25例正常前列腺组织的石蜡切片进行抗SKA1免疫组织染色，具体步骤参照实施例1的步骤1。

3、将6例前列腺癌前病变、25例前列腺癌组织以及25例正常前列腺组织的石蜡切片进行抗γ-TUBULIN与Pan-cadherin免疫组织荧光双染，具体步骤如下：

a.预处理：

b.染色：

将预处理所得的前列腺癌前病变、前列腺癌组织、正常前列腺组织分别用4％的甲醛室温固定15分钟。1×PBS洗3次，每次5分钟。0.5％TritonX-100透化10分钟。1×PBS洗3次，每次10分钟。1％BSA室温封闭1小时。将小鼠抗人γ-TUBULIN单克隆抗体(Sigma，T6557，用1％BSA1∶100稀释)与兔抗人Pan-cadherin(Epitomics，2019-1；用1％BSA1∶200稀释)混和加到载玻片上，放在湿盒里，4℃过夜。1×PBS洗3次，每次15分钟，加二抗488-羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch，115-545-003，用1％BSA1∶200稀释)与594-羊抗兔(Jackson ImmunoResearch，111-585-003，用1％BSA1∶200稀释)混合加到载玻片上，闭光孵育2小时。1×PBS洗3次，每次15分钟。20μl含DAPI封片剂封片(Vector，H-1500)，指甲油固定。

4、病理鉴定

将步骤2免疫组化后的结果根据SKA1-阳性染色所占的范围以及染色强度进行评分，具体如下：由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。SKA1染色阳性表达为细胞胞浆上呈现棕黄色颗粒；采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。1、阳性着色细胞数：每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数＜5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，76％～100％为4分。2、阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。3、两者计分相加得分为SKA1免疫组化阳性得分。

5、中心体数目检测

将步骤3染色后的结果在显微镜下观察，统计每个组织中具有多中心体(3个以及3个以上γ-TUBULIN阳性的点)细胞的数目，并且计算每个组织中多中心体细胞占的比例。

6、将步骤1、2、3的结果在显微镜下拍照，如图8A所示。将步骤5的结果以平均数加减方差的形式呈现，Kruskal-Wallis检验，如图8B所示。将步骤4与步骤5所得结果用珀松相关分析检验法进行相关性分析。数据处理用PRISM软件完成(GraphPad，CA，USA)，结果如图8C所示。

7、实验结果：

为检测SKA1的过表达是否与临床前列腺癌细胞中多中心体的出现相关，本发明将6例前列腺癌前病变与25例前列腺癌组织的切片进行抗中心体标记蛋白γ-TUBULIN的免疫组织化学染色。为方便统计每个细胞中的中心体数目，细胞与细胞之间的边界用抗Pan-Cadherin抗体染色(图5A)。实验表明前列腺肿瘤组织的分化程度越高，肿瘤组织中多中心体细胞所占比例越大(图5B)。更为重要的是，SKA1的表达与前列腺癌前病变以及肿瘤组织中多中心体细胞出现的比例成正相关(图5C)。上述实验证明SKA1的表达水平与临床前列腺癌细胞中多中心体的出现正向相关。

Claims

1.SKA1蛋白在作为靶标分子在制备前列腺癌早期筛查与诊断试剂中的应用。

2.用于检测SKA1蛋白的试剂在制备前列腺癌早期筛查与诊断试剂盒中的应用。

3.一种前列腺癌早期筛查与诊断试剂盒，其特征在于，包含用于检测SKA1蛋白表达水平的试剂。

4.如权利要求3所述的前列腺癌早期筛查与诊断试剂盒，其特征在于，所述的用于检测SKA1蛋白表达水平的试剂为兔抗人SKA1抗体。