CN104059859B

CN104059859B - 一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法

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Publication number: CN104059859B
Application number: CN201410312695.7A
Authority: CN
Inventors: 陈荣; 罗东; 程青; 程喆
Original assignee: Xian University of Architecture and Technology
Current assignee: Xian University of Architecture and Technology
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2034-07-02
Also published as: CN104059859A

Abstract

一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，首先配制新鲜培养基，培养基中无氮源、磷源及要测试的微量元素，之后在其中投入不同含量的N源、P源以及要测试的微量元素，得到不同的N/P比和不同的微量元素含量的培养基；然后选择实验藻种，接种到预先设定的含不同氮磷比及不同微量元素含量的新鲜培养基中；接着培养藻类，对藻类进行光度测量，计算出叶绿素a的含量，再对培养好的藻类进行藻细胞密度计数，最终根据叶绿素a和藻细胞密度的测量结果，对样品进行不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的状态进行分析，本发明能够在短时间内同时测出叶绿素a和藻细胞密度，迅速通过数据来反应实验结果，具有灵敏度高、精密度高、准确度高优点。

Description

一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法

技术领域

本发明涉及一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法。

背景技术

富营养化是水体面临的普遍性问题，藻类的过度繁殖是富营养化发生的主要原因。对于藻类过度繁殖的控制问题，国际科学界一致认同的关键策略一直是氮和磷等营养盐的科学控制。美国环保总署(USEPA)在《Nutrient Criteria Technical GuidanceManual:Lakes and Reservoirs》中提出利用综合营养状态指数(Trophic State Index，TSI)对水体的富营养化状态进行评价，TSI的计算与总磷(TP)、总氮(TN)、叶绿素a(Chla)、透明度(SD)和化学需氧量(COD)指标密切相关，并强调TP指标值是富营养化发生的关键因素。蔡龙炎等人通过对我国湖泊系统氮磷时空变化及对富营养化影响的研究也得出结论，我国湖泊TN和TP的变化范围分别为0.11～29.2mg/L和0.006～1.04mg/L，其中氮的变异性比磷大，TN/TP的变化范围在0.86～84，几何平均值为16.43，说明磷素是我国湖泊富营养化的一个主要限制因子。

另一方面，水体中的微量元素对藻类的生长也具有重要的影响作用，其影响的作用机理主要变现为，通过影响藻类的呼吸作用和光合作用来影响藻类的新陈代谢和藻毒素的产生，并最终影响藻类的生长繁殖。铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、镍(Ni)、铈(Ce)等元素是目前已知对藻类生长具有一定影响的微量元素，其中有些元素(如Fe)在一定条件下有可能成为富营养化发生的限制因子(李威，杨健，刘洪波，苏彦平.微量元素对水华发生、发展的影响.淡水渔业，2008，38(5):74-79)。

基于以上两个方面的原因，绝大部分研究集中在氮、磷营养物对藻类生长的影响，其中氮相关的指标包括TN、有机态N、无机态N(如：NH₃-N、NO₂-N、NO₃-N)，磷相关的指标包括TP、有机态P、无机态P(如：PO₄-P、HPO₄-P)(向速林.湖泊沉积物营养盐的赋存形态及其界面过程研究进展.贵州农业科学，2011，39(9):204-208)。在这些研究中，有些研究者关注于单个指标的影响，有些关注多个指标的影响，也有些研究者关注于氮磷比(TN/TP)对藻类生长的影响。另一方面，也有部分学者针对微量元素影响藻类生长开展了研究，如赵珊等人研究了Fe、Mn元素对铜绿微囊藻的生长影响(赵珊，周军，甘一萍，周律，刘晶晶.微量元素对奥运森林公园水体藻类生长的影响.给水排水，2010，36:150-152)。但是，藻类的过度繁殖和富营养化的发生是一个综合作用的过程，仅仅侧重于关注氮、磷营养盐或者微量元素单方面的作用是不够全面的，需要开展氮、磷营养盐和微量元素协同作用机理研究，截止目前，国内外有关此方面的研究还很缺乏。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，用于探索以TN、TP为代表的营养盐和微量元素对藻类生长的协同作用影响，具有预处理简单、分离快速、精密度高、准确度高等优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，包括：

第一步，配制新鲜培养基：培养基的pH值不得超过8.5且其中无氮源、磷源及要测试的微量元素，之后在其中投入不同含量的N源、P源以及要测试的微量元素，得到不同的N/P比和不同的微量元素含量的培养基；

第二步，进行样品取样及预处理：选择实验藻种，取藻种液在3500r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀的藻细胞用15mg/L的NaHCO₃溶液重新悬浮，重复离心、悬浮过程2次后作为接种藻种，把藻种接种到预先设定的含不同氮磷比及不同微量元素含量的新鲜培养基中；

第三步，培养藻类：将接种过藻种的新鲜培养基倒入锥形瓶中置于培养箱内，培养箱数据调整为温度25℃、光照2000Lux、震荡70rpm，时间设置为12Hr昼/12Hr夜交替；

第四步，对藻类进行光度测量，计算出叶绿素a的含量；

第五步，对培养好的藻类进行藻细胞密度计数；

第六步，结果分析：根据叶绿素a和藻细胞密度的测量结果，对样品进行不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的状态进行分析。

所述第一步中P源为K₂HPO₄，N源为NaNO₃，微量元素为铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、镍(Ni)、铈(Ce)等。在实验中需要检测那种微量元素对藻类生长的影响时，则在培养基中就去掉那种微量元素代表组份。比如说，无氮、磷、微量元素Mn²⁺的培养基配制方案如下：

其中，A₅的配制方案如下：

培养基中加入N源、P源和Mn²⁺含量的计算方法如下：

(1)根据公式:

\frac{V_{1} A_{1} + V_{2} A_{2}}{V_{1} + V_{2}} = 0.2 mg / L

其中A₁是藻液中TP的浓度；V₁是加入的藻液体积；V₂是加入的培养基体积，且V₂＝2V₁，计算得出加入的培养基中TP的浓度A₂，保证加入后TP为0.2mg/L；如果通过计算确定的体积大小发现当TP＝0.2mg/L始终不能满足则通过TN来计算体积，验算是否满足TP的要求；

(2)通过公式:

\frac{V_{1} B_{1} + V_{2} B_{2}}{V_{1} + V_{2}} = Cmg / L

其中B₁是藻液中TN的浓度，V₁是加入的藻液体积，C是实验设计的TN浓度，根据不同的N、P算出；V₂是加入的培养基体积，且V₂＝2V₁；计算得出加入的培养基中TN的浓度B₂，保证加入后TN浓度为Cmg/L；

(3)通过公式:V¹+V¹¹＝V₁计算出锥形瓶中所需要的离心后藻液体积V¹和满足实验要求所需加入的NaHCO₃溶液的体积V¹¹，其中M是离心结束后V¹中测得的藻细胞密度，N是培养开始时设计的藻细胞密度；

(4)通过公式:计算出投加到培养液中微量元素的质量，通过控制加入培养基中微量元素的质量保证S值符合实验要求，其中X是V₁中微量元素的浓度，S是锥形瓶样品中要求的微量元素的浓度。

所述第二步中，实验藻种为任何藻类，比如蓝藻、绿藻等，尤其是铜绿微囊藻。

所述第三步中，藻类培养过程中，每隔一天对培养箱里的锥形瓶位置交替更换，以减少因光照不均匀所造成的影响。

所述第四步中，对叶绿素a的测定采用甲醇萃取法，分别在不同的锥形瓶中取3mL样品液在3500r/min下离心10min，弃去上清液，之后等体积加入体积分数90％的甲醇，混合均匀，放置在4℃的黑暗条件下萃取6～8h后，在3500r/min下离心10min，取上清液测定样品在665nm处的吸光值。

用紫外可见分光光度计控制与分析软件测定样品在665nm处的吸光值D_665nm，根据测得的吸光值带入公式C_(ug/ml)＝D_665nm×13.9计算出叶绿素a的含量。

所述第五步中采用Cellometer全自动细胞计数仪进行细胞计数。

与现有技术相比，本发明能够在很短的时间内同时测出叶绿素和藻细胞数目，摆脱了传统测量叶绿素和藻细胞数目花费的大量时间和劳动，并且还能迅速通过数据做出图形来反应实验结果，即不同氮磷条件下微量元素对藻类的影响，而且具有灵敏度高、精密度高、准确度高优点，是一种可应用于检测不同氮磷条件下微量元素对藻类的影响的理想的检测方法。

附图说明

图1为N：P＝4:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下叶绿素a的变化图。

图2为N：P＝4:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下藻细胞密度的变化图。

图3为N：P＝16:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下叶绿素a的变化图。

图4为N：P＝16:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下藻细胞密度的变化图。

图5为N：P＝40:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下叶绿素a的变化图。

图6为N：P＝40:1时，铜绿微囊藻在不同微量元素浓度下藻细胞密度的变化图。

具体实施方式

下面以铜绿微囊藻为实验藻种，以Mn²⁺作为微量元素结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

本发明为一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，包括以下步骤：

第一步，配制新鲜培养基：培养基有化学药品和超纯水组成，并且保证配制培养基的pH值不得超过8.5，因为碱性过高会导致藻类死亡。无氮源、磷源及微量元素Mn²⁺的藻类培养基如表1，

表1，无TN、TP、微量元素Mn²⁺的藻类培养基配制方案

A₅的配制方案

第二步，进行样品取样及预处理：本实验操作方法主要是研究不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，操作步骤：取铜绿微囊藻藻种液在3500r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀的藻细胞用15mg/L的NaHCO₃溶液重新悬浮，再离心，以去除营养盐，重复离心、悬浮过程2次，最后再用NaHCO₃溶液再悬浮，NaHCO₃溶液的容积根据以计算出的用于接种时所需要的藻种液的细胞密度来确定，接种时一定要在无菌环境中进行。

第三步，培养藻类：将接种过藻种的新鲜培养基倒入锥形瓶中置于培养箱内，根据藻类最适宜生长需要的要求，实验时把培养箱内的数据调整为温度25±1℃，光照强度2000±10％Lux，光照时间间隔为12Hr昼/12Hr夜，震荡频度70±5rpm。使用的藻类培养箱是有常州普天仪器制造有限公司生产的大容量全温振荡TQHZ-2002A型培养箱。另外，为了减少因光照不均匀可能造成的影响，每天需要对培养箱里锥形瓶位置交替更换。

第四步，对藻类培养环境进行光度测量，计算出叶绿素a的含量。对叶绿素a的测定采用甲醇萃取法，分别在不同的锥形瓶中取3mL样品液在3500r/min下离心10min，弃去上清液，然后等体积加入90％(V/V)甲醇，混合均匀，放置在4℃的黑暗条件下萃取6～8h后，再在3500r/min下离心10min，将样品上清液倒入比色皿中在波长为665nm条件下分别测出吸光值，根据测得的吸光值带入公式C_(ug/ml)＝D_665nm×13.9计算出叶绿素a的含量。其中使用的紫外可见分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司的UVWIN5全新的紫外可见分光光度计，它能实现对紫外仪器的控制、测量、数据分析和数据处理，能在几秒钟的时间内准确读出数据。

第五步，对培养好的藻类进行藻细胞密度计数。采用由美国Nexcelom公司生产的型号为Cellometer AutoT4的全自动细胞计数设备，可在20S内准确计算出直径5-60um，细胞密度在2.5×10⁵～5×10⁷个/ml的细胞数目。

具体加入N、P、Mn²⁺含量的计算方法：

(1)根据公式:

\frac{V_{1} A_{1} + V_{2} A_{2}}{V_{1} + V_{2}} = 0.2 mg / L

(2)通过公式:

\frac{V_{1} B_{1} + V_{2} B_{2}}{V_{1} + V_{2}} = Cmg / L

(3)通过公式:

\frac{{MV}^{1}}{V^{1} + V^{11}} = 3 N

V¹+V¹¹＝V₁

其中M是离心结束后V¹中测得的藻细胞密度(个/mL)，N是培养时所要求的藻细胞密度(个/mL)；计算出锥形瓶中所需要的离心后藻液体积V¹和满足实验要求所需加入的NaHCO₃溶液的体积V¹¹；

(4)通过公式:

\frac{{XV}_{1} + T}{{3 V}_{1}} = Sug / L

其中X是V₁中微量元素Mn²⁺的浓度(ug/L)；S是锥形瓶样品中要求的微量元素Mn²⁺的浓度(ug/L)；通过计算可以得出T的数值，再通过控制加入培养基中微量元素Mn²⁺的质量保证S的量符合实验要求。

第六步，结果分析：

对样品通过第三步和第四步操作方法进行叶绿素a测量和藻细胞密度的测量，测出结果后对样品进行不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的状态进行分析。

通过以上的实验操作方法能够快速准确的测定样品中藻细胞密度和叶绿素a的含量，为探究不同氮磷条件下微量元素对藻类的影响提供了强有力的平台，并且还大大的缩短了实验的时间与所花费的劳动力，而且具有灵敏度高、精密度高、准确度高优点。

实施案例：

对铜绿微囊藻进行培养测定，对测定结果作图分析不同氮磷条件下不同含量的微量元素对藻类生长的影响。表1是按照第二步对铜绿微囊藻预处理、部分测量结果及按照实验要求的不同氮磷比以及不同微量元素Mn²⁺的一些氮源、磷源培养基的添加表，测得的铜绿微囊藻中TN＝8.1898mg/L、TP＝1.4669mg/L、藻细胞密度M＝7.8X10⁷；Mn²⁺＝9.72ug/L、本底值Mn²⁺＝3.24ug/L。

表2，在保证N、P比的情况下氮源、磷源培养基的添加表

表3，在保证N、P比的情况下锰源培养基的添加表

表4、5、6分别是铜绿微囊藻在N：P＝4:1、16：1、40:1条件下，微量元素Mn²⁺不同浓度时叶绿素a的测量结果。

表4，N：P＝4:1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的叶绿素a的值

表5，N：P＝16:1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的叶绿素a的值

表6，N：P＝40:1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的叶绿素a的值

表7、8、9分别是铜绿微囊藻在N：P＝4:1、16：1、40:1条件下，微量元素Mn²⁺不同浓度时藻细胞密度的测量结果。

表7，N：P＝4：1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的藻细胞密度值

表8，N：P＝16：1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的藻细胞密度值

表9，N：P＝40：1，微量元素Mn²⁺含量不同时测得的藻细胞密度值

根据样品测量的叶绿素a值以及藻细胞密度值作图以便对实验结果进行分析。

图1-图6是本发明测量的不同氮磷条件下微量元素对藻类生长作用的效果图，其中，图1为N：P＝4:1时，不同微量元素条件下叶绿素a的变化图。图2为N：P＝4:1时，不同微量元素条件下藻细胞密度变化图。图3为N：P＝16:1时，不同微量元素条件下叶绿素a的变化图。图4为N：P＝16:1时，不同微量元素条件下藻细胞密度变化图。图5为N：P＝40:1时，不同微量元素条件下叶绿素a的变化图。图6为N：P＝40:1时，不同微量元素条件下藻细胞密度的变化图。结合图1-图6可以发现：

(1)无论是N/P变化，还是微量元素的含量的变化，藻细胞密度的变化趋势和叶绿素a的变化趋势基本上是一样的，都是先下降、然后升高、接着是趋于平稳、最后再下降，这说明藻类生长经历着迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期这四个周期。

(2)随着培养液中N/P的增加，藻类生长所需的微量元素的浓度也会相应的增加，这说明藻类生长在利用较高浓度氮、磷的时候同样也需要较高的微量元素浓度用于自身生长。

(3)在Mn²⁺≤20ug/L这个范围内时，随着微量元素浓度的增加，藻细胞密度也会相应的增多，在Mn²⁺＞20ug/L藻细胞密度增长速率反而降低了，说明藻类生长同样受到微量元素的影响。

由此可见，本发明对不同氮磷条件下微量元素对藻类生长的影响进行了模拟。

Claims

1.一种不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，包括：

第四步，对藻类进行光度测量，计算出叶绿素a的含量，对叶绿素a的测定采用甲醇萃取法，分别在不同的锥形瓶中取3mL样品液在3500r/min下离心10min，弃去上清液，之后等体积加入体积分数90％的甲醇，混合均匀，放置在4℃的黑暗条件下萃取6～8h后，在3500r/min下离心10min，取上清液测定样品在665nm处的吸光值；

第五步，对培养好的藻类进行藻细胞密度计数；

2.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，所述第一步中P源为K₂HPO₄，N源为NaNO₃，微量元素为铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、镍(Ni)或铈(Ce)，在实验中需要检测哪种微量元素对藻类生长的影响时，则在培养基中就去掉那种微量元素代表组份。

3.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，所述微量元素为锰(Mn)，则无氮、磷、微量元素的培养基配制方案如下：

其中，A₅的配制方案如下：

4.根据权利要求3所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，培养基中加入N源、P源和微量元素含量的计算方法如下：

(1)根据公式:

(2)通过公式:

5.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，所述第二步中，实验藻种为铜绿微囊藻。

6.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，所述第三步中，藻类培养过程中，每隔一天对培养箱里的锥形瓶位置交替更换，以减少因光照不均匀所造成的影响。

7.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，用紫外可见分光光度计控制与分析软件测定样品在665nm处的吸光值D_665nm，根据测得的吸光值带入公式C_(ug/ml)＝D_665nm×13.9计算出叶绿素a的含量。

8.根据权利要求1所述不同氮磷条件下微量元素影响藻类生长的实验方法，其特征在于，所述第五步中采用Cellometer全自动细胞计数仪进行细胞计数。