CN104034887A - 一种氯胺酮快速检测卡及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用荧光微球免疫层析技术定性检测氯胺酮的检测卡及其制备方法,属于缉毒检测领域。本发明所提供的检测氯胺酮的检测卡,包括样品吸收垫、荧光素颗粒膜,硝酸纤维素膜和吸水垫,其依次连接;所述反应膜上包括检测带和质控带,检测带包被有氯胺酮和载体蛋白的偶联物,质控带包被有肌动蛋白本发明的检测氯胺酮的试纸具有敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。
Description
技术领域
本发明属于缉毒检测领域,具体地说是涉及一种利用荧光微球免疫层析技术定性检测氯胺酮的检测卡及其制备方法。
背景技术
氯胺酮俗称“K粉”,是苯环己哌啶的衍生物,属N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗物,是一种非巴比妥类麻醉剂。近年来,随着兴奋剂、γ-羟基丁酸和大麻等与特殊的“社交”和“性环境”相关的“舞会药”在欧美国家的流行,K粉滥用的问题日益严重,本世纪初在我国开始出现K粉的滥用问题,且有越演越烈之势。
目前,针对上述毒品的检测和监控方法包括确证法和筛查法两大类。确证法主要包括高效液相色谱、气相色谱、逆流色谱、离子色谱、离子阱质谱、等离子质谱、液质或气质联用等利用高端设备为辅助手段的方法。以上方法虽然敏感、特异、稳定,但是存在检测时间长,一般条件下检测通量不高,需要昂贵的设备支撑,因此确证法大多用于有疑问事件的仲裁;筛查方法一般是指快速检测方法。ELISA(酶联免疫吸附测定)以及胶体金免疫层析法是目前国际公认的主流技术,这两种方法具有检测速度快,价格便宜,操作简单等优点,是目前国内外检测毒品的主要监控方法。但ELISA检测仍需专业人员,且需要较长的时间显示结果;胶体金法一般情况下对氯胺酮能进行定性分析,检测时间比较短(10-15min)。然而,胶体金法由于其灵敏性限制,不能将样品进行多倍稀释,以至于样品中的干扰成分比较多,导致实际样品检测过程中会产生假阴性或假阳性现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能检测氯胺酮的检测器具,直接应用免疫学的方法检测样品中氯胺酮的含量,克服现有色谱法检测的操作繁琐等缺点,建立基于免疫学特异性的高灵敏度的检测方法。
本发明的技术方案:一种氯胺酮快速检测卡,其为在长条扁平薄壳状的检测卡外壳中设置测试条,检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔;测试条是由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、荧光素颗粒膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成;支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜,支承背板一端叠置粘贴吸水膜,另一端叠置粘贴样品垫,吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接,在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部,两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜;荧光素颗粒膜为含抗氯胺酮抗体的荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜,硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带,依次是:含氯胺酮蛋白质偶联物的检测带,含肌动蛋白质控带,测试条置入检测卡外壳内,样品垫正对加样孔,硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
荧光素颗粒选自荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯或量子点。
含抗氯胺酮抗体的荧光素颗粒的制备方法为:
取荧光微球在1000×g离心20 min,离心后收集沉淀,用0.01M pH 5.6 的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD450=0.2,然后分别加入20~100mg/ml对乙基-N,N-二甲基丙基碳二亚胺100μl,2~20mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺100μl,再加入0.01M pH 5.6的硼酸盐缓冲液,振荡混匀,室温孵育30min后,1000×g离心5~15min,沉淀用0.01M pH 7~8的硼酸盐缓冲液重悬,并调节微球浓度为OD450在0.2~1.0,在0.1ml的该荧光微球中加入1~10μg抗氯胺酮抗体,充分混匀后,室温搅拌反应2 h,超纯水离心洗涤2~5次,用0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液复溶沉淀至起始体积备用。
依据同样的方法制备含抗肌动蛋白抗体的荧光素颗粒。将含抗氯胺酮抗体的荧光素颗粒和含抗肌动蛋白抗体的荧光素颗粒以合适的比例混合,用BIODOT操作平台喷涂至玻璃纤维膜上,真空冷冻干燥1~2h,置于干燥环境中备用。
在样品吸收垫上滴加样品,如果样品中有氯胺酮物质,则氯胺酮经层析作用移动到荧光素颗粒膜的时候就会和荧光素标记的抗氯胺酮抗体结合形成复合物,并带动荧光素标记的质控抗体一起在层析作用下上行。当移动到检测带时,未被样品中氯胺酮结合的游离的荧光素标记的抗氯胺酮抗体就会和检测带上的偶联在载体蛋白上的氯胺酮结合,而有荧光信号。荧光素标记的质控抗体则被质控带上的质控抗原捕获,而有荧光信号。而样品中氯胺酮和荧光素标记的抗氯胺酮抗体形成的复合物则被层析到吸水纸上。样品中的氯胺酮越多,则检测带中剩余游离的荧光素标记的抗氯胺酮抗体越少,结合到检测带上的荧光素标记的抗氯胺酮抗体越少,荧光信号也就越弱,依此来检测样品中的氯胺酮的含量。
本发明的检测氯胺酮的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。由于以荧光素代替了胶体金作为标记物,很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来,因此大大提高了检测的灵敏度,检测氯胺酮灵敏度可达0.1ng/ml。通过设置质控带(点)
作为数据归一化方法,降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差,将不
同纸条测得的样品值代入标准曲线,即可以达到精确定量的效果。
附图说明
图1氯胺酮快速检测卡外壳及测试条在外壳内的安置图。
图中:1、外壳,2、测试条,3、检测窗孔,4、加样孔。
图2氯胺酮快速检测卡的测试条结构示意图。
图中:5、支承背板,6、硝酸纤维素膜,7、荧光素颗粒膜,8、样品垫,9、吸水膜,10、检测带,11、质控带。
具体实施方式
本发明结合具体实施例参见附图进一步说明如下:
实施例1
一种氯胺酮快速检测卡,它是在检测卡外壳1中设置测试条2,检测卡外壳1的结构及测试条2的设置参见附图1,检测卡外壳1为长条扁平薄壳状外壳,长70mm,宽20mm,厚5mm,薄壳壁厚1mm,由工程塑料制成。检测卡外壳1由壳盖与壳座两半联接构成,在检测卡外壳1壳盖上有检测窗孔3和加样孔4。测试条2放置在检测卡外壳1的壳座内。
测试条2是多层结构的窄条薄片,片长约60mm,片宽约4mm,厚度约2.5mm。测试条2是多层结构:底层是支承背板5,为聚氯乙烯塑料薄片,厚约0.5mm,长60mm,宽4mm;支承背板5中部叠置粘贴硝酸纤维素膜6,硝酸纤维素膜厚0.5mm,长20-25mm,宽4mm。硝酸纤维素膜6上有二条间隔开的横向显示印迹带,参见附图2,二条显示印迹带中,一条是检测带10,含氯胺酮蛋白质偶联物;另一条是质控带11,含肌动蛋白。支承背板5一端部上叠置粘贴吸水膜9,支承背板5另一端部上叠置粘贴样品垫8,吸水膜9内端与样品垫8内端各自分别与硝酸纤维素膜6一端搭接,在样品垫8与硝酸纤维素膜6的搭接部,两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜7,荧光素颗粒膜是含抗氯胺酮抗体荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜。荧光素颗粒膜7厚0.5-0.8mm,长5mm,宽4mm。样品垫8厚0.5-0.8mm,长20mm,宽4mm。吸水膜9厚0.5-0.8mm,长16-20mm,宽4mm。荧光素颗粒膜7、样品垫8及吸水膜9与硝酸纤维素膜搭接长度为1-2mm。吸水膜9材料是吸水纸,样品垫8材料是吸水玻璃纤维膜。
荧光素颗粒选自异硫氰酸荧光素颗粒、四甲基异硫氰酸罗丹明颗粒、四乙基罗丹明颗粒或藻红蛋白颗粒。
实施例2
含抗氯胺酮抗体的荧光素颗粒的制备方法和荧光素膜的制备方法
取荧光微球在1000×g离心20 min,离心后收集沉淀,用0.01M pH 5.6 的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD450=0.2,然后分别加入20~100mg/ml对乙基-N,N-二甲基丙基碳二亚胺100μl,2~20mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺100μl,再加入0.01M pH 5.6的硼酸盐缓冲液,振荡混匀,室温孵育30min后,1000×g离心5~15min,沉淀用0.01M pH 7~8的硼酸盐缓冲液重悬,并调节微球浓度为OD450在0.2~1.0,在0.1ml的该荧光微球中加入1~10μg抗氯胺酮抗体,充分混匀后,室温搅拌反应2 h,超纯水离心洗涤2~5次,用0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液复溶沉淀至起始体积后。
依据同样的方法制备含抗肌动蛋白抗体的荧光素颗粒。将含抗氯胺酮抗体的荧光素颗粒和含抗肌动蛋白抗体的荧光素颗粒以合适的比例混合,用BIODOT操作平台喷涂至玻璃纤维膜上,真空冷冻干燥1~2h,置于干燥环境中备用。
实施例3
本发明氯胺酮检测卡用于样品中的氯胺酮的检测。
取150ul待测样品加入注样孔,在毛细管作用下待测样品沿吸水垫方向移动,样品溶解荧光素颗粒膜上的包被物质,并带动包被物质一起向吸水垫方向移动。在样品吸收垫上滴加样品,如果样品中有氯胺酮物质,则氯胺酮经层析作用移动到荧光素颗粒膜的时候就会和荧光素标记的抗氯胺酮抗体结合形成复合物,并带动荧光素标记的质控抗体一起在层析作用下上行。当移动到检测带时,未被样品中氯胺酮结合的游离的荧光素标记的抗氯胺酮抗体就会和检测带上的偶联在载体蛋白上的氯胺酮结合,而有荧光信号。荧光素标记的质控抗体则被质控带上的质控抗原捕获,而有荧光信号。而样品中氯胺酮和荧光素标记的抗氯胺酮抗体形成的复合物则被层析到吸水纸上。样品中的氯胺酮越多,则检测带中剩余游离的荧光素标记的抗氯胺酮抗体越少,结合到检测带上的荧光素标记的抗氯胺酮抗体越少,荧光信号也就越弱,依此来检测样品中的氯胺酮的含量。通过测定标准不同浓度的标准品和对质控带上的荧光浓度进行归一化比较(T/C),可以构建标准曲线,进而可以定量样品中氯胺酮的浓度。很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来,因此大大提高了检测的灵敏度,检测雌激素灵敏度可达0.1ng/ml。
Claims (3)
1.一种氯胺酮快速检测卡及其检测方法,其特征在于:长条扁平薄壳状的检测卡外壳中设置测试条,检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔;测试条是由支承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、荧光素颗粒膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成;支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜,支承背板一端叠置粘贴吸水膜,另一端叠置粘贴样品垫,吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接,在样品垫与硝酸纤维素膜的搭接部,两者之间夹置粘贴一段荧光素颗粒膜;荧光素颗粒膜为含抗氯胺酮抗体荧光素颗粒和荧光素颗粒标记的抗肌动蛋白抗体包被的玻璃纤维膜,硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带,依次是:含氯胺酮蛋白质偶联物的检测带,含肌动蛋白质控带,测试条置入检测卡外壳内,样品垫正对加样孔,硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
2.如权利要求1所述的氯胺酮快速检测卡及其检测方法,其特征在于:所述含氯胺酮抗体的荧光素颗粒的制备方法为:取荧光微球在1000×g离心20 min,离心后收集沉淀,用0.01M pH 5.6 的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为OD450=0.2,然后分别加入20~100mg/ml对乙基-N,N-二甲基丙基碳二亚胺100μl,2~20mg/ml氮羟基琥珀酰亚胺100μl,再加入0.01M pH 5.6的硼酸盐缓冲液,振荡混匀,室温孵育30min后,1000×g离心5~15min,沉淀用0.01M pH 7~8的硼酸盐缓冲液重悬,并调节微球浓度为OD450在0.2~1.0,在0.1ml的该荧光微球中加入1~10μg抗氯胺酮抗体,充分混匀后,室温搅拌反应2 h,超纯水离心洗涤2~5次,用0.01M pH 7.2磷酸盐缓冲液复溶沉淀至起始体积备用。
3.如权利要求1所述氯胺酮快速检测卡及其检测方法,其特征在于:荧光素颗粒选自荧光物质为菲咯啉联钌有机染料、异硫氰根荧光素、异硫氰根罗丹明、6-羧基荧光素酰胺酯或量子点。
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