CN104018245A - 一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，包括：将丝素蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为5-20mg/ml的丝素蛋白溶液；将角蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10-20mg/ml的角蛋白溶液；将丝素蛋白溶液与角蛋白溶液按质量比95:5-5:95进行混合，搅拌，得到纺丝液，然后进行静电纺丝，并以圆柱形收集辊为接收器。本发明得到的管状材料具有内径尺寸可调、生物相容性好、体内可降解等优点，有望用于人工血管、尿道替代物等生物医用材料领域。
Description
技术领域
本发明属于纳米纤维管状材料的制备领域，特别涉及一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法。
背景技术
角蛋白是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物皮肤及皮肤附属物中，如毛发、蹄、壳、爪、角、鳞片等。近几年的大量研究表明，角蛋白是一种生物相容性好且不被机体免疫排斥的优质生物医用材料，具有广阔的应用前景。最为突出的是，经过对羊毛等来源的角蛋白进行氨基酸序列测定发现，其含有同Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。此三肽序列被公认为是细胞外基质中实现细胞结合的有效结合位点，有促进细胞吸附的功能。因此，国内外已开展大量关于角蛋白基生物材料的基础研究及动物实验研究，并在创伤敷料[Wound Repair and Regeneration,2012,20:236-242]、人造骨[Journal of Bioactive and Compatible Polymers,2013,28:141-153]以及神经修复[Biomaterials34(2013)5907-5914]等方面都取得了良好效果，已有部分产品应用于临床。
但现有研究证明，由于角蛋白的分子量较低，单一的角蛋白材料制成的膜材料通常较脆，且力学强度不高，使其应用性受到限制。因此，目前，大多数的角蛋白基生物材料往往采用角蛋白与天然高分子或人工高分子复合，这样既可以保持以改善单一角蛋白力学性能较差的不足，如丝素蛋白[Biomacromolecules,2008,9,1299–1305]、PVA[Advances inMaterials Science and Engineering,2014,Article ID163678]、PLGA[Journal of Bioactive andCompatible Polymers,2013,28:141-153]、PLLA[Biomed.Mater.2013,8:1-9]等。其中，丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白质，具有优良的机械性能和生物相容性，目前已在人工皮肤，尿管替代物以及人造血管等领域受到关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，本发明得到的管状材料具有内径尺寸可调、生物相容性好、体内可降解等优点，有望用于人工血管、尿道替代物等生物医用材料领域。
本发明的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，包括：
(1)将丝素蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为5-20mg/ml的丝素蛋白溶液；
(2)将角蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10-20mg/ml的角蛋白溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与角蛋白溶液按质量比95:5-5:95进行混合，搅拌，得到纺丝液，然后进行静电纺丝，并以圆柱形收集辊为接收器，得到丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料。
所述步骤(1)中丝素蛋白的分子量为25-325kDa。
所述步骤(2)中角蛋白分子量为3-300kDa。
所述步骤(2)中角蛋白为还原法、氧化法或水解法得到的角蛋白。
所述步骤(2)中角蛋白为人发、羊毛、家禽羽毛、牛毛提取得到的角蛋白。
所述角蛋白可以是采用目前已公开报道的各种方法提取制备的角蛋白，包括还原法，氧化法以及水解法等，也可以是上述角蛋白的衍生物，如羧甲基角蛋白。
所述的角蛋白可以从人发、羊毛、家禽羽毛、牛毛等人或动物毛发提取而得，也可以是来源于其他已报道的动物体。
所述步骤(1)、(2)中的溶剂为甲酸、六氟异丙醇、氯仿、四氢呋喃中的一种或几种。
所述溶剂优选甲酸；甲酸是溶解丝素蛋白的较佳溶剂，甲酸是溶解角蛋白的较佳溶剂。
所述步骤(3)中静电纺丝工艺参数为：电压13-35kV，接收距离8-22cm，纺丝速率为0.3-1.5ml/h，收集辊转动速率60-130rpm，喷丝孔内径为0.7-0.9mm，纺丝温度20-30℃，纺丝湿度45-65％。
所述步骤(3)所得纺丝液装入静电纺丝设备中，采用静电纺丝的方法形成纳米纤维丝，并以圆柱形的收集辊为接收器收集产生的纳米纤维丝，形成纳米纤维管状材料。
所述步骤(3)中圆柱形收集辊的直径为0.6-2cm，或依据所需管状材料的内径尺寸需求进行调节；收集辊的轴垂直于纺丝喷嘴开口方向，并做匀速转动，转速为60-130rpm。
本发明将角蛋白与丝素蛋白复合，并采用静电纺丝的方法制备纳米纤维型管状材料，以期改善单一角蛋白纤维材料力学性能较低的不足。同时，本发明得到的管状材料具有内径尺寸可调、生物相容性好、体内可降解等优点，有望用于人工血管、尿道替代物等生物医用材料领域。
有益效果
本发明得到的管状材料具有内径尺寸可调、生物相容性好、体内可降解等优点，有望用于人工血管、尿道替代物等生物医用材料领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
以羊毛为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。将上述羊毛加入100ml、1mol/l的巯基乙醇中，用NaOH调节pH约10.0，然后在40℃条件反应12h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量40，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.15g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量15mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比50：50的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压15kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.5ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为100rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例2
以人发为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g人发，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除人发表面油脂，然后用乙醇清洗人发，风干。将上述人发加入200ml水与5g焦亚硫酸钠混合的溶液中，用NaOH调节pH约10.0，然后在60℃条件反应5h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的人发固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.2g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量20mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比40：60的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压13kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.3ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径0.6cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为60rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例3
以羊毛为原料采用氧化法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。向上述羊毛中加入100ml去离子水和5ml、30％的双氧水，然后在100℃条件反应2h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.05g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量5mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.1g角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/ml的角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比40：60的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压13kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.3ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.5cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为110rpm，经过3小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例4
以羊毛为原料采用氧化法提取角蛋白，具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。向上述羊毛中加入100ml、4％的过氧乙酸，然后在60℃条件反应5h。反应结束后，将反应液收集(记为滤液1)，同时将反应剩余的羊毛固体过滤收集，继续用100ml、0.1mol/l的Tris碱液在40℃条件下处理2h，然后过滤除去固体，收集滤液(记为滤液2)。.将滤液1和2合并，于6000rpm离心5分钟，然后用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.3g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量30mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.1g角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为10mg/ml的角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比50：50的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压13kV，接收距离12cm，纺丝速率为1.5ml/h，喷丝孔内径为0.9mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为130rpm，经过3小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例5
以羊毛为原料采用还原法提取角蛋白，并对角蛋白进行衍生化改性。具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。将上述羊毛加入100ml、1mol/l的巯基乙醇中，用NaOH调节pH约10.0，然后在40℃条件反应12h。然后，用醋酸将上述反应液pH调整到7.5，向其中加入100ml、0.33mol/l的NaBrO3溶液，在室温条件下继续搅拌24h。反应结束后，过滤除去固体物，将滤液收集并用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的羧甲基角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.15g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量15mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g羧甲基角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的羧甲基角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比50：50的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压15kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.5ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为100rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例6
以人发为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g人发，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除人发表面油脂，然后用乙醇清洗人发，风干。将上述人发加入200ml水与5g焦亚硫酸钠混合的溶液中，用NaOH调节pH约10.0，然后在60℃条件反应5h。然后，用醋酸将上述反应液pH调整到8.5，向其中加入8.0g碘乙酸，在室温条件下继续搅拌6h。反应结束后，过滤除去固体物，将滤液收集并用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的羧甲基角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.2g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量20mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g羧甲基角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的羧甲基角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比60：40的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压13kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.3ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为100rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例7
以羊毛为原料采用还原法提取角蛋白，并对角蛋白进行衍生化改性。具体方法为：称取5g羊毛，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除羊毛表面油脂，然后用乙醇清洗羊毛，风干。将上述羊毛加入100ml、1mol/l的巯基乙醇中，用NaOH调节pH约10.0，然后在40℃条件反应12h。然后，用醋酸将上述反应液pH调整到7.5，向其中加入100ml、0.33mol/l的NaBrO3溶液，在室温条件下继续搅拌24h。反应结束后，过滤除去固体物，将滤液收集并用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的羧甲基角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.15g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量15mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g羧甲基角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的羧甲基角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比5：95的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压15kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.5ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为100rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例8
以人发为原料采用还原法提取角蛋白，具体方法为：称取5g人发，以石油醚为溶剂采用索氏抽提法去除人发表面油脂，然后用乙醇清洗人发，风干。将上述人发加入200ml水与5g焦亚硫酸钠混合的溶液中，用NaOH调节pH约10.0，然后在60℃条件反应5h。然后，用醋酸将上述反应液pH调整到8.5，向其中加入8.0g碘乙酸，在室温条件下继续搅拌6h。反应结束后，过滤除去固体物，将滤液收集并用截留分子量8，000的透析袋透析36h，最后将透析液加入液氮进行速冻处理，然后置入冷冻干燥机干燥得到干态的羧甲基角蛋白粉末。
丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料：
将质量为0.2g，分子量范围为25-325kDa的丝素蛋白溶解于甲酸中，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为质量20mg/ml的丝素蛋白溶液。将0.2g羧甲基角蛋白固体溶于10ml甲酸，室温下进行磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为20mg/ml的羧甲基角蛋白溶液。将上述丝素蛋白与角蛋白溶液按照质量比95:5的比例进行混合，磁力搅拌至混合均匀。将上述所得丝素蛋白/角蛋白溶液进行静电纺丝，静电纺丝参数为电压13kV，接收距离12cm，纺丝速率为0.3ml/h，喷丝孔内径为0.7mm，纺丝温度25℃，纺丝湿度50％。以直径1.0cm的圆柱形收集辊为接收器接收喷射产生的纳米丝，收集辊的转动速率为100rpm，经过4小时的收集，得到丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料。
实施例9
按照实施例1中所述的制备方法制备丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料，经分析测定，复合纳米纤维的孔隙率达90％，孔径为1-20μm。以大鼠成纤维细胞L929及血管内皮细胞为细胞模型，采用扫描电子显微镜观察细胞在材料上的黏附形态，并通过MTT法对细胞的增殖行为进行评价，结果表明，成纤维细胞及内皮细胞在丝素蛋白-角蛋白复合纳米纤维管状材料上均表现出良好的黏附形态和增殖行为，与单一的丝素蛋白制备的膜材料相比具有显著性差异。
Claims (9)
1.一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，包括：
(1)将丝素蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为5-20mg/ml的丝素蛋白溶液；
(2)将角蛋白加入溶剂中，搅拌至完全溶解，得到浓度为10-20mg/ml的角蛋白溶液；
(3)将丝素蛋白溶液与角蛋白溶液按质量比95:5-5:95进行混合，搅拌，得到纺丝液，然后进行静电纺丝，并以圆柱形收集辊为接收器，得到丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料。
2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中丝素蛋白的分子量为25-325kDa。
3.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白分子量为3-300kDa。
4.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白为还原法、氧化法或水解法得到的角蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中角蛋白为人发、羊毛、家禽羽毛、牛毛提取得到的角蛋白。
6.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中的溶剂为甲酸、六氟异丙醇、氯仿、四氢呋喃中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述溶剂为甲酸。
8.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中静电纺丝工艺参数为：电压13-35kV，接收距离8-22cm，纺丝速率为0.3-1.5ml/h，收集辊转动速率60-130rpm，喷丝孔内径为0.7-0.9mm，纺丝温度20-30℃，纺丝湿度45-65％。
9.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白/角蛋白复合纳米纤维管状材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中圆柱形收集辊的直径为0.6-2cm；收集辊的轴垂直于纺丝喷嘴开口方向，并做匀速转动。
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