CN104004753A - 一种分离调控花生胚发育基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离调控花生胚发育基因的方法，属于功能基因组学领域，所述AhHsfa4A基因序列如SEQIDNO:1所示，将筛选得到受钙诱导引起花生早期胚细胞程序性死亡的密切相关重要基因AhHsfa4A，并通过改良的RACE技术从所构建的全组织全长文库得到了AhHsfa4A基因的全序列。本发明建立了一种高效筛选缺钙诱导的花生早期胚重要基因的方法（SSHaLL）并利用该方法筛选到一个引起花生早期胚细胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A并对其进行了表达鉴定。该发明为高效筛选花生胚发育的重要差异表达基因，从而进一步阐明花生胚发育的分子机理奠定了良好的基础。

Description

一种分离调控花生胚发育基因的方法

技术领域

本发明涉及一种分离调控花生胚发育基因的方法，属于功能基因组学领域。

背景技术

植物的生长、发育、开花、结果、衰老和死亡等生命过程伴随着复杂的生理生化变化，是植物体内基因在时间和空间上有序表达和调控的结果。基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关，成为生命科学的重要研究课题。比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提。分离差异表达基因对于了解和揭示植物体的生长发育规律，进而进行生物的改良、抗逆、抗病等研究具有重要的意义。目前寻找差异表达基因成为功能基因研究的一个非常重要的内容。

目前分离差异表达基因的技术主要包括mRNA差异显示（differential display of reverse transcriptase-polymerase chain reaction，DDRT-PCR）、代表性差异分析（representational difference analysis，RDA）、消减杂交（subtractive hybridization，SH）、抑制性消减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）、基因表达的序列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、基因芯片技术（DNA microarray）及转录组测序。

mRNA差异显示（DDRT-PCR）是一种极其有效的研究差异基因的方法，该方法简单、快速，灵敏度高、重复性好、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，可同时显示多种生物性状的差异及同时获得高丰度和低丰度表达的基因等优点。在分离与植物胚胎发育、形态发生、信号传导、植物抗逆、抗病虫等相关的基因方面得到了广泛应用。但是假阳性率高，特异的cDNA片段太短且差异片段一般需要变性聚丙烯酰胺凝胶分离严重限制了这一技术的广泛应用。近年来，大型荧光差异显示系统的出现，在一定程度上克服了这些不足，但是设备价格昂贵，使其不能普及使用，依然制约了它的发展。代表性差异分析（RDA）的出现，避免了一些无关基因被筛选和克隆，克服了mRNA 差异显示方法中易于出现的假阳性率高的问题，减少了后续基因片段鉴定的工作量和挑选差异克隆的随意性，同时RDA 还可使mRNA 差异显示方法中难以显示的稀有mRNA 的cDNA 得以富集，更具有代表性、富集效率更高。目前，该方法已经在动物、人类及植物的基因克隆中发挥作用。但是它步骤繁多，工作量大，周期长，易被污染，这些缺点也成为RAD 在实际应用中的限制因素。

基因表达的序列分析（SAGE）通过快速而详细地分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组表达信息。它不但能快速、详细地同时分析成千上万个基因转录子的丰富信息，还能发现新基因，因此是基因表达定性和定量研究的一种有效工具。但是该方法操作较为复杂，这成为该技术应用的一个主要限制因素。基因芯片技术（DNA microarray）是近年发展起来的一种新型实用的高新生物技术，已成为目前国际上生命科学研究的热点之一。其突出特点是具有高度的并行性、多样性、微型性和自动化，已成为高效、快速、大规模获取相关生物信息的重要手段。虽然基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，但是仍然存在许多不足之处，如靶分子浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度等对杂交的动力学影响，探针对杂交体的稳定性影响还不是很清楚。目前存在的主要问题是芯片制作与分析系统的价格较昂贵，使其实际应用受到一定限制。SSH是基于PCR技术的简单有效的分离差异表达基因的技术，具有较明显的优越性：（1）操作简便、周期短：SSH 方法设计巧妙，操作简便，前后只需3～4天，即可得到PCR扩增的差减cDNA群体。由于巧妙地引入抑制PCR扩增，摆脱了传统的物理方法分离单双链这一繁琐困难的操作，能选择性地扩增目的cDNA片段，使目的分子得到有效富集。（2）具有高度敏感性：SSH方法可以使低丰度的mRNA得以高于1 000倍的富集，较适于在转录水平上研究生物受生物或非生物逆境胁迫后基因的差异表达。（3）效率高：一次SSH反应可同时分离上百至上千个差异表达的基因片段。适用于大规模的基因表达分析。（4）组织特异性cDNA能被用作杂交筛选的探针，这使得该技术在克隆差异表达基因方面更为通用。（5）提高了基因差异表达的特异性，降低了假阳性率：这是该方法的最大优点。以抑制PCR 为基础，补平接头后非特异的基因片段由于形成发夹结构不能被扩增，较高程度地分离了特异cDNA 片段。

当前，SSH cDNA文库的筛选方法主要是基于PCR技术的点阵膜杂交。该方法费时费力、价格昂贵。因此，开发一种简单、高效的从SSH cDNA文库中筛选差异表达基因的技术具有很重要的意义。

钙对花生荚果的发育产生重要作用。当荚果在结实区内不能获得足够的钙时，虽然能够膨大、成熟，但饱满度降低，空壳率增加。缺钙不仅严重影响花生荚果的发育，而且引起花生荚果出现某种病害。长期以来，花生胚败育而出现大量空荚导致大幅度减产的现象长期困扰着我省尤其是沿海地区砂质土壤的花生生产，其中一个主要原因是土壤缺钙。福建省红黄壤酸性强，土壤盐基饱和度低，加上南方雨水多，易造成钙元素大量淋失。这种现状严重地制约当地农业生产和农民增收。然而，花生胚胎发育的分子机理，特别是缺钙导致的花生胚胎败育的分子机理尚未明确。因此，分离缺钙条件下花生胚中的差异表达基因对于揭示花生胚胎发育的分子机理具有重要意义。

本发明针对以上研究背景，建立了一种高效筛选缺钙诱导的花生早期胚重要基因的方法（SSHaLL）并利用该方法筛选到一个引起花生早期胚细胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A并对其进行了表达鉴定。该发明为高效筛选花生胚发育的重要差异表达基因，从而进一步阐明花生胚发育的分子机理奠定了良好的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离调控花生胚发育基因的方法，建立了一种高效筛选缺钙诱导的花生早期胚重要基因的方法（SSHaLL）并利用该方法筛选到一个引起花生早期胚细胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A并对其进行了表达鉴定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种调控花生胚发育重要基因，基因序列如SEQ ID NO:1所示。

一种调控花生胚发育基因的分离方法，筛选得到受钙诱导引起花生早期胚细胞程序性死亡的密切相关重要基因AhHsfa4A，并通过改良的RACE技术从所构建的全组织全长文库得到了AhHsfa4A基因的全序列。

qRT-PCR鉴定所述基因在缺、足钙诱导的花生早期胚中及花生果针入土不同时期花生胚中AhHsfa4A的表达。 

所述的入土不同时期为10、20、30、40、50、60 DAP。

所述的AhHsfa4A基因可用于研究花生胚发育的机理。

本发明的高效筛选差异表达基因的SSHaLL方法主要是在构建SSH cDNA文库基础上，利用反转录产物或者文库构建过程中实验组或驱动组二次PCR产物以地高辛标记探针，用菌落杂交进行文库筛选。具体来说本发明利用SSH技术构建了缺、足钙条件下花生早期胚的正反向抑制消减杂交文库，经鉴定后利用菌落杂交的方法进行文库筛选，通过对比缺钙、足钙探针杂交缺钙差异cDNA文库的信号差别，找出缺钙条件下差异表达的克隆，进行测序及生物信息学分析。

本发明的利用高效筛选差异表达基因的SSHaLL方法筛选得到的引起花生早期胚细胞程序性死亡的重要基因AhHsfa4A，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。利用qRT-PCR的方法对其在缺、足钙条件下的花生胚发育不同时期（6、9、15、30DAP）及正常条件下花生胚发育不同时期（10、20、30、40、50、60DAP）中的表达情况进行了鉴定和分析。在正常条件下，花生果针入土15d之前，该基因在花生胚中表达量很低，在30DAP时表达量急剧增加，之后下降并一直保持表达量较低的水平。缺钙条件下该基因在6、9、15DAP时表达诱导一定的诱导，但在30DAP时表达量急剧下降。即在缺钙胁迫初期，该基因受到诱导表达量有增加的趋势，这是植物的防御反应。但是当花生胚到了迅速生长发育阶段，缺钙条件下该基因表达量急剧下降，严重影响了细胞的生物化学过程，从而导致了花生胚的细胞性程序死亡。

本发明的筛选差异表达基因的SSHaLL方法简单、经济、高效，为进一步高效筛选与花生胚发育相关的重要功能基因奠定了基础。利用该方法筛选得到的AhHsfa4A基因能够引起花生早期胚的程序性细胞死亡。这为阐明缺钙导致花生胚败育的分子机制提供了有力的证据。

附图说明

图1为缺、足钙条件下花生胚发育对比图；A为足钙条件下花生胚发育正常；B为缺钙条件下花生果针入土15d之前外观发育正常，但30d时表现空瘪；C. (a)足钙条件下花生成熟荚果饱满 (b) 缺钙条件下花生成熟荚果胚败育；其中A、B 分别5 mm，C为10 mm。

图2为缺钙诱导的花生早期胚抑制消减杂交文库菌落杂交结果；A为足钙探针杂交缺钙差异文库. B为缺钙探针杂交。

图3为AhHsfA4a基因在缺、足钙条件下的表达鉴定。（图A，为花生 Hsf基因在足钙下的相对表达情况；图B，为Hsf基因在花生缺钙下不同的时间的表达情况；图C，为Hsf基因在缺足钙的表达的对比。

具体实施方式

【实施例1】缺、足钙花生早期胚总RNA的提取

   以福建农林大学油料所选育的花生优良品种闽花6号为材料，在福建省平潭县选择典型缺钙的花生空荚产地，土壤中可交换钙含量为49.54 ug/kg，以此水平为缺钙处理，在此基础上，每亩施石灰75kg，土壤中可交换钙含量达129.61 mg/kg（引起花生缺钙的土壤中可交换钙含量为100mg/kg），以此为足钙处理。取缺、足钙条件下花生果针入土后的第6、9、15 天的幼果，剥取幼胚迅速投入液氮，贮于-80℃备用。将1.7mlCTAB抽提液（65℃）与80μl巯基乙醇预热至65℃；加入研磨好的材料，涡旋2min，65℃温浴15-30min，其间颠倒混匀3-4次，加入1/10体积的无水乙醇，1/10体积的3MKAc，等体积酚/氯仿／异戊醇(25：24：1)，于室温下颠倒混匀10min。4℃，12000r/min离心15min；取上清，加入等体积的氯仿／异戊醇(24：1)，于室温下颠倒混匀10分钟。4℃，12000r/min离心15min。上清液加1/3体积的10mol·L-1 LiC1，-80℃过夜沉淀；4℃，12000r/min离心15min，弃上清，用75%乙醇洗涤1次，室温干燥或者真空干燥沉淀；加入 TE（10 mmol·I Tris-HCl pH8.0.1 mmol/L EDTA）溶解沉淀，再加入等体积水饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，12000 r／min离心15 min，移上清至新离心管；上清液加1/3体积的10mol·L-1 LiC1，-80℃沉淀1h；4℃，12000r/min离心15min，弃上清，用75%乙醇洗涤2次。室温干燥，或者真空干燥后保存于水或适量去离子甲酰胺中，-80℃保存备用。

【实施例2】抑制消减杂交文库的构建

缺、足钙条件下花生早期胚抑制消减杂交文库的构建按照PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit试剂盒(BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA)进行。当缺钙条件下花生早期胚为检测组时，足钙条件下花生早期胚为驱动组；反之，当足钙条件下花生早期胚为检测组时，缺钙条件下花生早期胚为驱动组。分别取检测组与驱动组1μg mRNA按照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan)进行逆转录合成cDNA，检测组cDNA用RsaⅠ于37°C 酶切1.5 h，之后于16°C,过夜连接接头1(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’/5’-TGGACGGGCC-3’)与2R(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTG GTCGCGGCCGAGGT-3’/5’-TGGAGCCGGC-3’)。之后驱动组cDNA分别加入每一个检测组样本中，加入杂交液。上述混合液经高温变性后，于68°C退火杂交8h。将第一次杂交后的两个样本混合，加入新的变性的驱动组cDNA于68°C杂交过夜。用巢式引物(Nested PCR primer1: 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'; Nested PCR primer2R: 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3')进行PCR扩增差异表达基因。消减后的差异cDNA连接到pGEM-T Easy载体(Promega, Madison, WI)中，电击(BTX ECM 630)转化至大肠杆菌DH5α中，将菌液均匀涂布于LB培养基(含有100mg/L Amp与X-gal/IPTG)中放于37°C过夜培养。

【实施例3】缺钙诱导的花生早期胚抑制消减杂交文库的筛选

分别取2μg消减后的缺、足钙条件下花生早期胚双链cDNA，用DIG-dUTP(Roche)根据DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche)进行探针标记。分别取1μl -70℃保存的扩增文库，用LB液体培养基分别稀释至10³，10⁴，10⁵，分别取1μl，加入100μl液体LB，涂在含100μg/ml氨苄的LB固体培养基平板上，过夜培养后，计算长出的克隆数。将Hybond-N+尼龙膜（Amersham）铺在含有100μg/ml氨苄的LB平板上，应尽量避免产生气泡。根据滴度检测结果，按照每板2000 clones取适量的文库菌液均匀涂板，于超净台上吹干，大约1h，放于37℃培养箱过夜。超净台上铺一层保鲜膜，上面放一张15cm的高压灭菌过的滤纸，用镊子夹起主膜，轻轻铺在滤纸上。将一新的杂交膜铺在新的氨苄板上，湿润后，用镊子轻轻夹起，小心铺在主膜上，使之与主膜完全吻合，之后，在上面铺一层滤纸，用手轻轻压进行复制。然后用针头在边缘处扎三个孔，用铅笔作标记。完后，将主膜与copy1都放在新的氨苄板上于37℃培养。每张主膜复制两张即Copy1 ，Copy2。主膜板培养3-5h后拿出，放于4℃保存；Copy膜培养数小时直至克隆大小合适时为止，之后进行下一步实验。分别用Solution1（0.5M NaOH，1.5M NaCl）与Solution2（0.5M Tris，1.5M NaCl）处理长有克隆的尼龙膜7min，之后用Solution3（0.4M NaOH），Solution4（4×SSPE）各处理7min，于80℃烘干1h。将膜置于杂交管中，用磷酸钠/SDS缓冲液（2% (w/v) SDS, 0.15 M Sodium Phosphate, pH 7）洗膜。加入预热的杂交液（1% (w/v) BSA, 1 mM EDTA, 7% (w/v) SDS, 0.5 M Sodium Phosphate, pH 7）于65°C进行预杂交1h。倒掉预杂交液，加入新的含有50ng/ml的预热的杂交液20ml，65°C杂交过夜。倒掉并收集含有探针的杂交液（可重复利用）。用磷酸钠/SDS缓冲液（2% (w/v) SDS, 0.15 M Sodium Phosphate, pH 7）于65°C洗膜三次，每次10min，用TST（0.1% (v/v) Tween 20, 0.5 M NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5）于室温洗膜三次，每次5min。用TST plus Milk（0.1% (v/v) Tween 20, 4% (w/v) Powered Milk, 0.5 M NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5）于室温洗膜5min。在含有1:10,000的Anti-Digoxigenin Alkaline Phosphatase的TST plus Milk中培养1h。用TST洗三次。然后置于Detection buffer（0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5）中，之后按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II进行免疫检测。通过对比缺钙、足钙探针杂交缺钙差异cDNA文库的信号差别，找出缺钙条件下差异表达的克隆，重新摇菌，做穿刺培养后送上海生工测序。

【实施例4】AhHsfA4a的qRT-PCR鉴定

利用改良CTAB法分别提取缺、足钙条件下花生早期胚（6, 9, 15, 30 DAP）及正常花生胚发育不同时期（10, 20, 30, 40, 50, 60DAP）的总RNA，分别取3μg用Primescript（TaKaRa）进行逆转录。按照SYBR Premix Ex Taq kit (Takara)用Mastercylcer ep realplex (Eppendorf)以特异引物（Ah HsfA4a_RT_F ：5’-CAAGCTCCACTGACAGAATCAG-3’)；Ah HsfA4a_RT_R 5’-CAGGTTTCTGCAGTACACTGG A-3’）进行qRT-PCR。按照ΔΔCT法分析该基因在样本中的表达情况。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  福建农林大学

 

<120>  一种分离调控花生胚发育基因的方法

 

<130>  9

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  264

<212>  DNA

<213>  AhHsfa4A基因

 

<400>  1

tcatagtcat tctttacaga atcttcaggc gcaagctcca ctgacagaat cagaaaggat     60

 

gagtttacaa gatgaaatag agaggcttaa ccgtgaaaaa gaacagcttc ttatggagct    120

 

acagagacat gaacaggagt ggcaagaata tgagattcga atacactgct cgaaagaccg    180

 

tgtggagaag atggagcaga agcatcaaaa gatgatctct tctgtttcca gtgtactgca    240

 

gaaacctgga attgacttga atca                                           264

 

 

<210>  2

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt                      44

 

 

<210>  3

<211>  10

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tggacgggcc                                                            10

 

 

<210>  4

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

ctaatacgac tcactatagg gcagcgtggt cgcggccgag gt                        42

 

 

<210>  5

<211>  10

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tggagccggc                                                            10

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

tcgagcggcc gcccgggcag gt                                              22

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

agcgtggtcg cggccgaggt                                                 20

 

 

<210>  8

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

caagctccac tgacagaatc ag                                              22

 

 

<210>  9

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

caggtttctg cagtacactg ga                                              22

 

 

Claims (5)

1.一种调控花生胚发育重要基因，其特征在于：所述AhHsfa4A基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的调控花生胚发育基因的分离方法，其特征在于：筛选得到受钙诱导引起花生早期胚细胞程序性死亡的密切相关重要基因AhHsfa4A，并通过改良的RACE技术从所构建的全组织全长文库得到了AhHsfa4A基因的全序列。

3.根据权利要求2我所述的调控花生胚发育基因的分离方法，其特征在于：qRT-PCR鉴定所述基因在缺、足钙诱导的花生早期胚中及花生果针入土不同时期花生胚中AhHsfa4A的表达。

4. 根据权利要求2我所述的调控花生胚发育基因的分离方法，其特征在于：所述的入土不同时期为10、20、30、40、50、60 DAP。

5.一种如权利要求1所述的一种调控花生胚发育重要基因的应用，其特征在于：所述的AhHsfa4A基因用于研究花生胚发育的机理。