CN104004643A - 一种凝胶微阵列反应器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种凝胶微阵列反应器及其制备方法和应用，凝胶微阵列反应器包括凝胶和检测探针，检测探针包裹在凝胶中，凝胶表面均匀分布有用于进样的微孔。本发明提供的凝胶微阵列反应器，检测探针可快速检测离子、小分子或生物分子，而凝胶为检测探针提供的稳定的检测环境，提高了凝胶微阵列反应器的实用性，具有操作简便、检测成本低、特异性强、可实现高通量和大众化检测的优点。

Description

一种凝胶微阵列反应器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分析检测领域，尤其涉及一种凝胶微阵列反应器，还涉及一种凝胶微阵列反应器的制备方法和应用。 
背景技术
随着当前生活环境的日益破坏，环境污染物质（例如重金属离子、毒性小分子）不仅给动植物的生存带来危害，更是直接影响人类的的生活质量以及威胁人类的身体健康。因此，针对环境污染性物质发明有效的检测技术显得十分重要。同时，很多离子、小分子、生物分子的存在情况与人类的生理代谢和身体疾病密切相关，因此，针对这些疾病相关性靶标物质发明有力的检测技术也是十分必要的。现有的针对离子、小分子、生物分子等的分析检测技术，往往表现出许多不足：依赖大型专业仪器、依赖专业技术人员、样品处理复杂、检测步骤繁琐、分析成本高昂，很难实现高通量、大众化应用。因此发明一种通用性强、检测步骤简单、成本低廉、可实现高通量和大众化应用的分析检测技术显得十分重要。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种通用性强、检测成本低，可实现高通量和大众化分析检测应用的凝胶微阵列反应器。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种凝胶微阵列反应器，包括凝胶和检测探针，检测探针包裹在所述凝胶中，凝胶表面均匀分布有用于进样的微孔。
上述的凝胶微阵列反应器，所采用的检测探针为T40核酸探针和抗坏血酸钠的混合物，所述T40核酸探针为具有SEQ ID No.1的DNA序列。优选的，T40核酸探针的浓度为20～1000nM；抗坏血酸钠的浓度为0.2～10mM。
上述的凝胶微阵列反应器厚度为0.4～1.0cm，微孔为具有倒圆锥形、圆柱形或长方体形的微孔，微孔的容积为5～50μL。
上述的凝胶微阵列反应器，所采用的凝胶由琼脂糖或丙烯酰胺制备而成。
在本发明提供的凝胶微阵列反应器中，核酸探针T40和抗坏血酸钠包裹在凝胶中。当从微孔中点样加入铜离子后，铜离子进入凝胶间隙并与寡聚胸腺嘧啶核苷酸和抗坏血酸钠反应。其中T40核酸探针为模板，当反应器中存在铜离子时，铜离子会吸附在T40核酸探针上。而抗坏血酸钠作为还原剂，将T40核酸探针上的铜离子还原为铜原子得到铜纳米颗粒。而铜纳米颗粒是一种具有荧光发射的纳米颗粒，该荧光纳米颗粒的最大激发在340nm左右，最大发射在610nm左右。通过凝胶微孔中荧光强度大小和光斑大小的判断，可以实现对铜离子的定性和定量检测；利用紫外灯照射，就可以很方便地通过裸眼观察到铜离子的存在信息。
凝胶对其内部包裹的探针物质具有保护作用，减少探针物质受到环境的干扰，降低探针的性能发生变化而导致检测信号不准确的可能性，提高凝胶微阵列反应器的检测实用性。
在上述技术方案的同一构思下，本发明还提供了一种凝胶微阵列反应器的制备方法，包括以下步骤：
S1、将凝胶与检测探针混合后制备凝胶溶液；
S2、将梳状微孔模型固定在所述凝胶溶液上，所述梳状微孔模型的梳体插入凝胶溶液中，待凝胶溶液凝固后拔出，得到均匀分布有微孔的凝胶微阵列反应器。
在上述技术方案的同一构思下，本发明还提供了前述凝胶微阵列反应器或前述制备方法制备得到的凝胶微阵列反应器的应用，将被检测的靶物质添加到所述凝胶微阵列反应器的微孔内，可获得可供检测的反应信号。
上述的应用方法中，靶物质为能够穿过凝胶间隙进入凝胶内部的物质。优选的，靶物质为离子、小分子、生物分子中的一种或多种。进一步的优选的，靶物质为Cu2+。
上述的应用方法中，反应信号的产生模式包括激活式、熄灭式、生成式；反应信号为通过仪器采集得到的信号或者裸眼观察得到的信号。优选的，通过仪器采集的信号可以是荧光信号或比色信号。
在本发明提供的应用方法中，靶标物质会扩散到凝胶内部，与凝胶间隙中预先包裹好的检测探针或者反应试剂进行化学反应，从而产生信号。如果产生的是比色信号（即颜色变化），可以直接通过肉眼观察或者相机拍摄记录；如果产生的是荧光信号，可以借助紫外灯照射激发，然后观察其荧光信号变化并可以通过相机拍摄记录。在本发明中，因为铜离子与探针作用带来的是红色荧光信号，当在凝胶微阵列反应器的微孔中加入铜离子后，将凝胶微阵列反应器放置于紫外灯下照射，观察荧光信号的变化，并用相机拍摄记录荧光信号，可以快速知道被检测样品中是否含有铜离子。而微孔中的荧光强度大小和光斑大小可以反映铜离子的浓度信息。
在本发明中凝胶微阵列反应器又名功能化凝胶微阵列反应器。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明提供的凝胶微阵列反应器，以凝胶作为基材，原料来源广泛、检测成本低，同时通过凝胶包裹检测探针，为检测探针提供的稳定的检测环境，避免了探针受到环境干扰而导致检测信号不准确、检测实用性低的缺陷。
2、本发明提供的凝胶微阵列反应器，可根据靶标物质的理化性质，在凝胶中包裹一种或多种检测探针，为靶标物质与检测探针的反应提供稳定的环境；同时凝胶的形状尺度可以根据需要进行调节，方便于携带和实现原位检测。
3、本发明提供的凝胶微阵列反应器的制备方法，不依赖大型仪器制备，操作简单，原料易得，可大众化应用。
4、本发明提供的凝胶微阵列反应器的应用方法，信号获取快捷方便，可实现对靶标物质进行阵列式分析、实现高通量分析检测、操作简单、检测迅速、不依赖大型检测仪器、通用性强、可实现大众化应用。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还具有其他的目的、特征和优点，下面将参照图和实施例对本发明进一步详细说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中凝胶微阵列反应器的制备及其应用的工艺流程图。
图2为本发明实施例1中凝胶微阵列反应器制备过程图。
图3为本发明实施例1中铜离子检测的机理图。
图4为本发明实施例1中铜离子检测的可行性分析结果图。
图5为本发明实施例1中凝胶微阵列反应器用于铜离子检测的灵敏度考察图。
图6为本发明实施例1中凝胶微阵列反应器用于铜离子检测的特异性考察图。
图7为本发明实施例1中凝胶微阵列反应器对DNA探针酶切保护作用的对比图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述，但是本发明可由权利要求限定和覆盖的多种不同的方式实施。
实施例
以下实施例中，所采用的原料和涉及到的仪器均为市售。
实施例1：
凝胶微阵列反应器采用琼脂糖制备凝胶溶液，以具有SEQ ID No.1的DNA序列的T40 核酸探针和抗坏血酸钠的混合物为检测探针，检测探针加入凝胶溶液中，待凝胶溶液凝固成型，得到具有均匀分布有用于进样的微孔的凝胶微阵列反应器。
如图1所示，凝胶微阵列反应器的制备方法和应用方法具体包括以下步骤：
S1、制备琼脂糖溶液：称取质量为0.15g的琼脂糖粉末，置于量程为50ml的小烧杯中，再加入15ml的MOPS缓冲液（10 mM 3-吗啉丙磺酸，150 mM 氯化钠，pH=7.8），得到质量分数为1%（即100mL的溶液中含有1g的琼脂糖）、制胶体积为15ml的琼脂糖溶液。
S2、引入检测探针：将840nM的T40核酸探针和2mM的抗坏血酸钠充分混匀，加入到S1中制备的琼脂糖溶液中，充分混匀，制得含有检测探针的琼脂糖溶液；T40为具有SEQ ID No.1的DNA序列。
S3、制备凝胶：将S2中制备好的含有检测探针的琼脂糖溶液在加热器上加热至沸腾，沸腾持续1min后，停止加热，得到含有检测探针的凝胶溶液；将含有检测探针的凝胶溶液倒入直径为5.6cm，高度为1.2cm的圆形玻璃皿中。
S4、凝胶微阵列反应器的制备与成型：在S3中制备凝胶溶液上插上梳状微孔模型，待凝胶溶液成型成凝胶之后，将梳状微孔模型抽出，得到具有均匀分布有微孔的凝胶微阵列反应器。
本实施例中凝胶微阵列反应器的厚度为0.6cm，有21个倒圆锥体的作为后期进样的微孔，各微孔的容积为20μL；微孔模型通过eppendorf 96-孔板剪切而成。
实施例1为本发明的优选实施例，在本发明中，凝胶微阵列反应器可以为0.4～1.0cm之间任意厚度，微孔的容积可以在5～50μL之间，微孔还可以为圆柱体或长方体，凝胶还可以由丙烯酰胺制备而成。
如图3所示：当从微孔中点样加入铜离子后，铜离子进入凝胶间隙并与寡聚胸腺嘧啶核苷酸（T40）和抗坏血酸钠反应。其中T40核酸探针为模板，当反应器中存在铜离子时，铜离子会吸附在T40核酸探针上。而抗坏血酸钠作为还原剂，将T40核酸探针上的铜离子还原为铜原子得到荧光铜纳米颗粒，从而获得可供检测的荧光信号。具体的检测方法为：
S5、进样：通过移液枪将20μL的铜离子溶液加入到实施例1的凝胶微阵列反应器的微孔内。
S6、信号检测：进样后，室温放置5分钟，将凝胶微阵列反应器放置于紫外灯下照射，观察铜纳米颗粒的荧光，并用相机拍摄记录荧光信号。
在本发明中，实施例1仅为本发明的优选实施例，T40核酸探针的浓度在20～1000nM之间；抗坏血酸钠的浓度在0.2～10mM之间均可以实施。本发明提供的凝胶微阵列反应器并不仅限于包裹T40探针和抗坏血酸钠，还可以包裹其他的分子探针和/或纳米探针，如：荧光染料分子、金纳米粒子等。
同时，本发明提供的凝胶微阵列反应器还可应用于其他能够穿过凝胶间隙进入凝胶内部的物质，如：汞离子等其他重金属离子、ATP等生物分子。
实验例1：关于实施例1的凝胶微阵列反应器检测铜离子的可行性分析。
将500nM 的T40核酸探针和2mM的抗坏血酸钠的混合物分别放入三份缓冲溶液中得到混合溶液（缓冲溶液包含10mM的3-吗啉丙磺酸、150mM的氯化钠；pH=7.8）。
a：前述混合溶液中不加入铜离子；
b：前述混合溶液中加入100μM的铜离子；
c：前述混合溶液中加入100μM的铜离子和1mM的EDTA。
将a、b、c三份溶液在室温反应5分钟，通过荧光分光光度计F-7000测得不同情况下的荧光光谱，考察铜离子的存在与否对荧光信号的影响。
图4A为荧光强度与铜离子存在与否的关系图，当溶液中只有T40和抗坏血酸钠存在时（参见图4A的曲线a），溶液中检测不到荧光信号；当在T40和抗坏血酸钠混合液的体系中加入铜离子时（参见图4A的曲线b），经反应后的溶液检测到很强的荧光信号；当在T40和抗坏血酸钠混合液的体系中存在EDTA的时候（参见图4A的曲线c），因为EDTA能够螯合二价的铜离子，所以再加入铜离子的时候，也是观察不到荧光信号。通过以上三组对照实验，充分的证明了铜离子的存在与否是导致荧光信号有无的直接原因，本发明通过T40核酸探针和抗坏血酸钠混合液作为检测探针可以实现对铜离子的检测。
图4B是铜纳米颗粒荧光信号产生速度的图，在荧光分光光度计时间扫描的模式下，将不含铜离子的b和c溶液扫描至110秒的时候，加入铜离子，继续监测荧光信号的变化。从图4B中的b曲线的变化可知，铜离子与T40和抗坏血酸钠混合物的反应并产生荧光信号的速度十分迅速，在5分钟之内就可以完成。
实验例2：关于实施例1的凝胶微阵列反应器检测铜离子时的灵敏度分析。
分别配置浓度为0μM、20μM、40μM、80μM、0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM、1mM、2mM、4mM、8mM、10mM的铜离子溶液；将各浓度的铜离子溶液20μL连续快速的加入到凝胶上不同的进样微孔中，在紫外灯照射下观察荧光信号。
结果如图5所示，5分钟后，随着铜离子的浓度不断上升，在紫外灯下呈现的荧光光斑不断增大，荧光亮度也不断变亮。在铜离子浓度小到20μM的时候，还可以观察到能够区分于背景的荧光信号，这一检测下限能够满足世界卫生组织（WHO）规定的饮用水中铜离子的安全极限（30μM）。说明利用实施例1中制备的凝胶微阵列反应器可以实现对铜离子的高通量快速灵敏检测。
实验例3：关于实施例1的凝胶微阵列反应器检测铜离子时的选择性考察。
分别将浓度为500μM的铜离子溶液和浓度均为1 mM的Ag+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Sn2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Ba2+、Ca2+、Mg2+溶液各20μL连续快速的加入到凝胶上不同的进样微孔中，在紫外灯照射下观察荧光信号。
检测结果如图6所示：只有铜离子会导致很强荧光信号的产生，而其他离子的存在不带来任何的信号干扰。由此可知，本发明采用凝胶微阵列反应器检测铜离子的方法具有高特异性的优势。
实验例4：凝胶微阵列反应器对DNA探针酶切保护作用的对比考察。
实验组：将包裹了T40和抗坏血酸钠的凝胶微阵列反应器浸泡在S1核酸外切酶溶液（4mM的醋酸钠、30mM的氯化钠、0.2mM的硫酸锌、50单位/ ml的S1核酸外切酶、pH=4.6）中，浸泡30min后，用蒸馏水冲洗3次，转移到含有抗坏血酸钠的MOPS溶液（10mM的3-吗啉丙磺酸、150mM的氯化钠、3mM的抗坏血酸钠、pH=7.8）中，浸泡5min后，将微孔倒干，再在微孔中加入20μL的铜离子液体，在紫外灯照射下观察荧光信号。
对照组为均相溶液体系：先将T40在50单位/ml的S1核酸外切酶溶液中处理10min，再用于检测铜离子，检测条件与实验组相同。
结果如图7所示，在对照组中，T40探针很容易被核酸酶降解，使得被S1核酸外切酶处理过的探针T40不再具备合成荧光铜纳米颗粒的能力，铜离子加入之后没有荧光信号的产生；而实验组中，凝胶微阵列反应器被同等浓度的核酸酶处理更长的时间之后，对铜离子的响应跟没有被处理过的凝胶微阵列反应器一样，这证明了凝胶微阵列反应器对其内部包裹的核酸探针具有很好的酶切保护作用，使得核酸探针T40没有被核酸酶降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 
<110>  湖南大学
<120>  一种凝胶微阵列反应器及其制备方法和应用
<130>  20140321
 
<160>  1    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt                           40

Claims (10)

1.一种凝胶微阵列反应器，其特征在于，包括凝胶和检测探针，所述检测探针包裹在所述凝胶中，所述凝胶的表面均匀分布有用于进样的微孔。
2.根据权利要求1所述的凝胶微阵列反应器，其特征在于，所述检测探针为T40核酸探针和抗坏血酸钠的混合物，所述T40核酸探针为具有SEQ ID No.1的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的凝胶微阵列反应器，其特征在于，所述T40核酸探针的浓度为20～1000nM。
4.根据权利要求2所述的凝胶微阵列反应器，其特征在于，所述抗坏血酸钠的浓度为0.2～10mM。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的凝胶微阵列反应器，其特征在于，所述凝胶微阵列反应器厚度为0.4～1.0cm，所述微孔为倒圆锥体、圆柱体或长方体，所述微孔的容积为5～50μL，所述凝胶由琼脂糖或丙烯酰胺制备而成。
6.一种权利要求1至5中任意一项所述的凝胶微阵列反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将凝胶与检测探针混合后制备凝胶溶液；
S2、将梳状微孔模型固定在所述凝胶溶液上，所述梳状微孔模型的梳体插入所述凝胶溶液中，待所述凝胶溶液凝固后拔出，得到均匀分布有微孔的凝胶微阵列反应器。
7.一种权利要求1至5中任意一项所述的凝胶微阵列反应器或由权利要求6所述制备方法制备得到的凝胶微阵列反应器的应用，其特征在于，将靶物质添加到所述凝胶微阵列反应器的微孔内，待所述靶物质与所述检测探针发生反应，获得可供检测的反应信号。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述靶物质为能够穿过凝胶间隙进入凝胶内部的物质；所述反应信号为通过仪器采集的信号或者裸眼观察的信号。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述通过仪器采集的信号可以是荧光信号或比色信号，所述靶物质为离子、小分子、生物分子中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述靶物质为Cu2+。
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CN107764757A (zh) * 2017-09-15 2018-03-06 南方科技大学 用于检测目标离子含量的装置、系统、制备方法和目标物含量测定方法以及试剂盒

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