CN103978200A

CN103978200A - 一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列

Info

Publication number: CN103978200A
Application number: CN201410231987.8A
Authority: CN
Inventors: 闫兵; 吴青; 焦青; 刘寅; 李飞; 张秋; 江翠娟; 翟淑梅
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2014-08-13

Abstract

本发明公开了一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列，是通过调节非氢键基团配位体和氢键受体或供体基团配位体的相对比例，并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得。本发明阵列不仅可以用来研究纳米颗粒与细胞之间的作用机制，还可以指导靶向载运药物、生物显影、疾病诊断及基因治疗等生物医学领域的载体的设计。

Description

一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列

技术领域

本发明涉及一种金纳米颗粒阵列，尤其涉及一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列及其在研究纳米颗粒材料与细胞间相互作用中的应用；属纳米材料表面的功能化修饰技术领域。

背景技术

随着纳米技术的迅速发展，纳米材料作为一种新兴材料在新能源、新材料、环境科学及生物医学等领域的应用不断取得突破性进展，尤其是在生物医学领域，如药物载体、癌症治疗、抗菌材料、组织工程、医学诊断和生物传感等方面具有广泛的应用前景。纳米材料的广泛使用，使其以各种不同的方式和途径进入了我们所处的环境，对环境和人类健康有可能带来潜在的不利影响。因此，详尽了解纳米材料与生物体(细胞、蛋白质等)之间的相互作用规律对理解和控制纳米材料的生物活性极为重要。纳米材料与生物分子的相互作用主要包括：氢键作用、静电作用、疏水作用、立体作用等。其中利用纳米材料与细胞间的氢键作用已被研究用于载运基因、增强细胞摄取和内吞体逃逸等。而纳米材料的表面氢键密度也与其组织扩散、生物分布、细胞摄取、细胞毒性以及蛋白结合能力等生物行为相关。

为了研究纳米材料与细胞间的氢键作用，通常采用在纳米材料表面修饰带氢键的配位体分子。但这些带氢键的配位体分子可能同时提供除氢键作用以外的其他作用力，从而产生混合的相互作用力，影响了人们在理解纳米材料与细胞间相互作用时氢键所起的真实作用。例如，通常认为氢键给体比例对巨噬细胞摄取纳米颗粒的影响较大，而电荷密度对非巨噬细胞摄取纳米颗粒的影响较大。这些结果说明纳米材料的表面物理化学性质对其细胞摄取行为有很大的影响。

申请人发现利用表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列可以系统研究纳米材料与细胞之间的氢键作用，而文献检索未见有类似的研究报道。

发明内容

针对现有纳米材料表面化学修饰存在的不足，本发明的目的在于提供一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列及其在研究纳米颗粒材料与细胞间相互作用中的应用。

本发明所述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列，是通过调节非氢键基团配位体和氢键受体或供体基团配位体的相对比例，并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得，其特征在于：所述非氢键基团配位体选硫辛酰胺，以配位体3标示，所述氢键受体基团配位体选(N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺，以配位体1标示，所述氢键供体基团配位体选N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺，以配位体2标示，所述配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接，制得的金纳米颗粒阵列中金纳米颗粒的粒径为8.0±0.1纳米，由10种金纳米颗粒组成，分别以HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HD1、HD2、HD3、HD4、HD5表示，HA代表氢键受体阵列，HD代表氢键供体阵列；其中HA1、HA2、HA3、HA4或HA5表面连接有相对比例之和为100％的配位体1和配位体3，且 HA1至HA5表面的配位体1与配位体3的比例呈现连续变化，配位体1与配位体3的比例由20％与80％变化为100％与0％；其中HD1、HD2、HD3、HD4或HD5表面连接有相对比例之和为100％的配位体2和配位体3，且HD1至HD5表面的配位体2与配位体3的比例呈现连续变化，配位体2与配位体3的比例由20％与80％变化为100％与0％。

本发明所述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列示意图见图1，其表面配位体分子数见表1，每种金纳米颗粒的配位体分子比例见表3。

表1：氢键密度连续变化的金纳米阵列表面配位体分子数

注：HA为氢键受体系列，HD为氢键给体系列，命名标号数字越大表示氢键受体(供体)比例越高。

上述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列中所述配位体1-3的分子结构式如下：

本发明所述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列在研究纳米颗粒材料与细胞间相互作用中的应用。

上述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列，是选取了一个非氢键基团配位体和一个氢键受体/供体基团配位体，同时控制这两个配位体的其他性质，例如保持亲疏水性、电荷密度、π键性质和空间拓扑结构等相似，使这两个配位体分子的唯一差别仅在于氢键，来实现利用阵列表面氢键密度的连续变化研究纳米材料与细胞间相互作用时氢键作用力的影响。

为了更好地理解本发明的实质和它的应用价值，下面用金纳米颗粒的制备实验和表征结果来说明本发明所述金纳米阵列表面氢键密度的连续变化以及它在研究纳米材料与细胞间相互作用时氢键作用力影响的应用。

1.金纳米阵列的制备：

将单配位体分子硫辛酰胺或者不同比例的双配位体分子(N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺与N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺溶于DMF中，加入氯金酸溶液，室温下搅拌30分钟。滴加硼氢化钠的水溶液，在室温下继续搅拌4小时。用盐酸中和掉过量的硼氢化钠。所得的金纳米颗粒溶液用透析或者超滤洗涤的方法进行纯化。

2.金纳米阵列的形貌分析：

选择金纳米阵列中的几种纳米颗粒作为代表进行透视电子显微镜(JEM-1011低分辨透射电子显微镜，JEOL，日本)观察。在电压80KV，AMT2k CCD镜头下观察到的金纳米颗粒形貌如图2所示，金纳米颗粒呈近似球形，平均粒径在8.0纳米左右。

3.金纳米颗粒动态光散射粒径测量：

将每种金纳米材料取适量，稀释至50μg/mL，用移液枪移取1.0mL稀释好的样品溶液，加入DLS检测池中，待激光粒度分析仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国)预热半小时后，进行粒径分布检测。

4.金纳米颗粒的表面Zeta电位分析：

将每种金纳米材料取适量，稀释至50μg/mL，用1.0mL注射器吸取稀释好的溶液，缓慢注射进Zeta电位检测池中，进行表面Zeta电位的检测。

结果见表2。

表2：氢键密度变连续化金纳米阵列的DLS以及Zeta电位结果

5.表面氢键密度连续变化金纳米阵列用于研究纳米材料的细胞摄入：

THP-1细胞培养在含小牛血清、抗生素和β-巯基乙醇的1640培养基中。

将上述细胞接种到24孔板里，加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)使THP-1细胞贴壁。放在恒温培养箱中孵育24小时后，吸掉每个孔的培养基，并用PBS缓冲溶液轻洗三遍，去除未贴壁细胞。然后将含0.5mL金纳米颗粒的细胞培养基溶液加到孔里，再放在恒温培养箱中孵育，2小时后吸掉每个孔的培养基，并用PBS缓冲溶液洗三遍，加入胰酶，把细胞从孔底上消化下来。加入培养基终止消化，对细胞计数。每个实验平行做三次。

取消化下来的细胞，加入王水，放在37℃过夜以彻底消解纳米颗粒成离子。从中取细胞分解液，用等离子体共振耦合-质谱(ICP-MS)仪通过标准工作曲线法测定细胞消解液中金离子的浓度，计算细胞内纳米材料含量(即细胞摄取量)，结果见图5。

由以上实验结果可以得出以下结论：

根据测定结果可以计算出所制备的金纳米阵列中纳米颗粒表面配位体分子数的比例，从而得到金纳米颗粒阵列的表面氢键密度。由此可以阐明本发明所述的金纳米颗粒阵列的表面氢键密度连续变化。进一步的，用此阵列研究纳米材料与细胞间氢键作用发现，随着金纳米颗粒表面氢键受体密度增加，进入细胞的纳米材料量变少，随氢键供体密度增加进入细胞的纳米材料先增加后减少，证明氢键密度会影响纳米颗粒与细胞之间的相互作用。

本发明为了研究纳米材料与细胞间的相互作用中单一变量氢键的影响，通过在同一纳米材料表面修饰不同比例的含氢键受(供)体或不含氢键的配位体分子，构建了氢键密度连续变化的金纳米阵列。因上述两种配位体分子的其他性质非常类似，保证了纳米材料表面性质的单一化，以此实现了通过本发明中的单一氢键密度变化阵列研究纳米材料与细胞之间的氢键作用。

本发明公开的表面氢键密度连续变化的金纳米阵列由10种金纳米颗粒组成，由于这些纳米颗粒表面氢键密度不同，因而在与细胞发生相互作用时表现出不同的作用，可用于纳米颗粒与细胞之间的作用机制研究，还可以指导靶向载运药物、生物显影、疾病诊断及基因治疗等生物医学领域的载体的设计。

附图说明

图1：本发明所述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列示意图。

图2：制备的金纳米颗粒粒径表征。其中：

a：为HA1在透射电子显微镜下的图片；图中比例尺为20nm；

b：为HA5在透射电子显微镜下的图片；图中比例尺为20nm；

c：为HD1在透射电子显微镜下的图片；图中比例尺为20nm；

d：为HD5在透射电子显微镜下的图片；图中比例尺为20nm。

图3：配位体1的HPLC-MS和NMR定性分析结果。

图4：配位体2的HPLC-MS和NMR定性分析结果。

图5：表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列的细胞摄取量。

具体实施方式

实施例1：配位体分子的制备

(1)配位体1((N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺)的合成

30mmol四乙二醇单甲醚与8.7mL三乙胺放入250mL圆底烧瓶，加入30mL二氯甲烷，搅拌。冰浴条件下，将6.2702g对甲苯磺酰氯滴加于上述溶液中。滴加完毕后，室温反应时间。反应结束后蒸干溶剂，过柱得到2#中间产物13.1325g。分别称取7.2494g2#产物、4.4402g邻苯二甲酰亚胺和1.2720g十六烷基三丁基溴化膦至250mL三口圆底烧瓶中，通N2保护，100℃油浴加热回流反应4h。反应完成后，抽滤，蒸干溶剂，过柱得到3#中间产物3.6502g。

称取3.1891g3#产物到250mL的圆底烧瓶中，加入189mL无水乙醇和1.14mL水合肼(MW＝50.06，18.9mmol)，80℃下反应4h，反应结束后蒸干溶剂，加入二氯甲烷析出沉淀，抽滤除去沉淀，蒸干溶剂得4#中间产物3.1101g。

称取3.5804g(MW＝206.32，17.4mmol)硫辛酸至250mL圆底烧瓶中，加入101.5mL二氯甲烷，搅拌溶解。加入3.5804g(MW＝206.33，17.4mmol)DCC，活化1.5h后，加入3.0000g上述所得4#产物和0.1772g(MW122.17，1.45mmol)DMAP，室温下搅拌反应过夜。反应结束后抽滤，收集滤液加入乙酸乙酯，析出沉淀，抽滤除去沉淀，继续加乙酸乙酯至没有沉淀析出，过柱得到1.1464g产物配位体1，(N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺。

(2)配位体2(N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺)的合成

称取2.0602g(MW＝206.32，10mmol)硫辛酸至100mL圆底烧瓶中，加入4.1201g(MW＝206.33，20mmol)DCC和0.4055g(MW＝135.13，3mmol)HOBT，与2.3532g(MW＝181.19，13mmol)D-葡糖胺混合于40mL的THF中，再加入1.9301g(MW＝101.19，13mmol)三乙胺反应，HPLC-MS方法检测反应产物。反应结束后将反应液过滤，弃掉滤液，用高纯水将滤饼洗至白色，收集滤液，用乙酸乙酯萃取，取有机层蒸干，得浅黄色固体配位体2，N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺。

上述两种配位体(配位体1、配位体2)的合成路线见如下反应式：

(3)金纳米颗粒阵列的制备：

将0.064mmol单配位体分子硫辛酰胺与不同比例的双配位体分子(N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺与N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺(相关比例见表3，两分子总量是0.064mmol)溶于20mL DMF中，然后将氯金酸(25.0mg,0.064mmol)加到此溶液中并在室温下搅拌30分钟。硼氢化钠(7.2mg,0.19mmol)的水溶液(12mL)滴加入其中。在室温下继续搅拌4小时。用1N HCl中和掉没反应完的硼氢化钠。所得的金纳米颗粒溶液用透析(截留分子量3500)或者超滤(截留分子量5000)洗涤的方法进行纯化。

表3金纳米颗粒阵列制备中配位体分子的投料比例

实施例2：用透视电子显微镜对金纳米颗粒进行形貌表征

选择HA1，HA5，HD1和HD5作为代表进行透视电子显微镜(JEM-1011低分辨透射电子显微镜，JEOL，日本)观察。在电压80KV，AMT2k CCD镜头下观察到的金纳米颗粒形貌如图2所示，金纳米颗粒呈近似球形，平均粒径在8.0纳米左右。

实施例3：通过碘切的方法和高效液相色谱-质谱联用仪对连接在金纳米颗粒表面的配位体分子进行定量分析

采用碘切的方法和高效液相色谱-质谱联用仪对HA1，HA2，HA3，HA4，HA5和HD1,HD2，HD3，HD4，HD5配位体分子定量分析。将2.0mg金纳米颗粒分散到100μL甲醇中，100μL碘的甲醇溶液(10mg/mL)加入其中并在室温下孵育30分钟。裸金通过离心(1,3000转/分钟，30分钟)去掉，20μL上清注入高效液相色谱/质谱/氮检测器(HPLC/MS/CLND)系统进行分析。流动相的条件：0分钟，10％甲醇；4.5分钟，95％甲醇；5.5分钟，95％甲醇；6.5分钟，10％甲醇；7分钟，10％甲醇。流动速率0.7mL/min。所得分析结果见图3和图4。

实施例4：金纳米颗粒水合动态粒径及表面zeta电位的测定

将HA1～HA5和HD1～HD5金纳米颗粒分别取适量，稀释至50μg/mL，用移液枪移取1.0mL稀释好的样品溶液，加入DLS检测池中，待激光粒度分析仪(Zetasizer NanoZS90，Malvern，英国)预热半小时后，测定纳米颗粒的粒度分布；用1.0mL注射器吸取1mL左右稀释好的样品溶液，缓慢注射进Zeta电位检测池中(切勿注入气泡)，测定纳米颗粒的Zeta电位，每个样品平行测定三次。结果见表2。

实施例5：金纳米颗粒亲疏水性指数LogP的测定

溶剂的预饱和：将等体积的正辛醇(优级纯)和高纯水混合，搅拌24h，静置分层，分别取两相，保存备用。上层为水饱和的正辛醇溶液，下层为正辛醇饱和的水溶液。

亲疏水性指数LogP的测定步骤如下：

1)取含0.3mgGNPs的样品溶液，置于5mL离心管中，加入正辛醇饱和的水溶液至总体积为1mL，超声混匀后，加入1mL水饱和的正辛醇溶液，缠好封口膜，置于振摇器，25℃振摇24h。

2)振摇24h后，将离心管取下，静置分层，待两相分离界线清晰(大约0.5-1.0h)，用移液枪分别取出两相溶液，再将固定体积两相溶液(视浓度而定)分别加入到10mL比色管中，120℃真空干燥至溶剂完全挥发。

3)每支比色管中分别加入500μL新制王水，消解12h后，加入高纯水，定容至10mL，酸度为5％。

4)配制标准曲线：根据计算的浓度范围，配制一系列浓度的标准溶液，保证酸度与样品一致。

5)用ICP-MS测定油相(正辛醇层)和水相中Au的含量，利用公式logP＝lg(Co/Cw)计算每种金纳米颗粒的亲疏水性指数logP的值。结果参考表4和表5。

表4氢键受体连续变化的纳米系列的LogP值

实施例6：细胞培养和细胞摄取纳米材料：

THP-1细胞培养在含10％小牛血清、1％抗生素和1‰β-巯基乙醇的1640培养基中。将上述细胞接种到24孔板里，密度为40万/孔，加入终浓度为50ng/mL的丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)使THP-1细胞贴壁。放在37℃，5％CO₂的恒温培养箱中孵育24小时后，吸掉每个孔培养基并用PBS缓冲溶液轻洗三遍，去除未贴壁细胞。然后将含0.5mL纳米颗粒的细胞培养基溶液(50μg/mL)加到孔里，再放在37℃、5％CO₂的恒温培养箱中孵育2小时后，吸掉每个孔的培养基并用PBS缓冲溶液洗三遍，加入200μL胰酶(0.25％Tripsin in PBS)，把细胞从孔底上消化下来，再加入200μL培养基终止消化，对细胞计数。每个实验平行做三次。

实施例7：用ICP-MS测量细胞内的纳米材料含量：

取200μL消化下来的细胞，加入400μL王水，放在37℃过夜以彻底消解纳米颗粒成离子。从中取100μL的细胞分解液，用含50ppb236Y内标，1％硝酸的溶液稀释成5mL。并用此溶液配置金浓度标准溶液(1000，500，250，100，50，10，5和1ppb)，作出标准曲线，用此曲线计算细胞消解液中金的浓度。然后计算出每个细胞的纳米材料含量，同时还可以通过模拟计算每个细胞中金纳米球的个数，结果见图5。

Claims

1.一种表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列，是通过调节非氢键基团配位体和氢键受体或供体基团配位体的相对比例，并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得，其特征在于：所述非氢键基团配位体选硫辛酰胺，以配位体3标示，所述氢键受体基团配位体选(N-3,6,9,12-四氧代十三烷基)-硫辛酰胺，以配位体1标示，所述氢键供体基团配位体选N-(D-葡糖胺基)-硫辛酰胺，以配位体2标示，所述配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接，制得的金纳米颗粒阵列中金纳米颗粒的粒径为8.0±0.1纳米，由10种金纳米颗粒组成，分别以HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HD1、HD2、HD3、HD4、HD5表示，HA代表氢键受体阵列，HD代表氢键供体阵列；其中HA1、HA2、HA3、HA4或HA5表面连接有相对比例之和为100％的配位体1和配位体3，且HA1至HA5表面的配位体1与配位体3的比例呈现连续变化，配位体1与配位体3的比例由20％与80％变化为100％与0％；其中HD1、HD2、HD3、HD4或HD5表面连接有相对比例之和为100％的配位体2和配位体3，且HD1至HD5表面的配位体2与配位体3的比例呈现连续变化，配位体2与配位体3的比例由20％与80％变化为100％与0％。

2.权利要求1所述表面氢键密度连续变化的金纳米颗粒阵列在研究纳米颗粒材料与细胞间相互作用中的应用。