CN103966146B

CN103966146B - 一株达木海洋芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103966146B
Application number: CN201410228561.7A
Authority: CN
Inventors: 田永强; 刘波; 龙秀锋
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2034-05-28
Also published as: CN103966146A

Abstract

本发明公开了一种海洋芽孢杆菌<i>Oceanobacillus</i>。（见附图）通过从新疆莎车县盐碱土分离、筛选、生理生化鉴定等工作，确定该菌株为好氧，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状，大小范围为0.2-0.4×1.0-1.2μm，端生孢子，孢子囊些微肿胀，菌落呈奶油色，形状呈圆形规则，边缘光滑。NaCl耐受范围为3-20%(最佳盐浓度为10%-15%)，pH生长范围为6.5-11.0(最佳pH范围为7.5-9.0)，温度生长范围为15-40℃(最佳生长温度为30-37℃)。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，可以水解淀粉，不能水解吐温-80，明胶和纤维素。可广泛应用于淀粉酶的生产和各类基因工程产品的高盐浓度发酵。附图是扫描电子显微镜15000倍下PT-20的照片。

Description

一株达木海洋芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种海洋芽孢杆菌及其应用的技术领域。

背景技术

中度嗜盐菌并非分类学上的专业名词，而是对一类最佳耐盐浓度在3%-15%的极端微生物的统称。它广泛分布在各类高盐环境中，如海洋、盐湖、盐碱地、盐池这些自然环境及很多发酵食品中都能被发现。由于这菌的独特生存环境，故它们有以下特点，较高盐浓度下发酵生长，避免发酵过程中的染菌风险，不需要复杂的培养条件，生理生化多样性，有很大的潜在应用价值。

传统的食品发酵工业中，嗜盐微生物的应用由来已久，如食品调味酱就是通过将小麦、谷子和大豆等农作物密封浸泡在19%左右的NaCl溶液中，经发酵9-10个月而成。科学家们发现，在此过程中，有一种名为Tetragenococcushalophilus的中度嗜盐菌起到了主要的发酵推动与承担作用，其高达108CFU/mL的培养基细胞浓度不仅能抑制其他细菌生长，还能保证在混合氨基酸缺乏的环境下酱的风味浓郁不散而且美味可口。在韩国，人们经常喜欢将海产品进行腌制，而这过程中起到主要作用的菌株也是一类中度嗜盐菌，名为Halomonasalimentaria。许多中度嗜盐菌的菌落也十分好看，多呈橙色或粉红色，而其中的有益品种亦被用来生产天然食品添加剂。

海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）是2002年由JieLu和YuichiNogi等人提出的，最初的菌株从深海中分离得到，至今已有16个有效种和2个有效亚种，该属菌特点为革兰氏阳性，对盐浓度有较高的耐受性，其应用的相关报道较少。

发明内容

针对国内外有关海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus）的研究现状，本发明提供一种达木海洋芽孢杆菌及其应用。所述的达木海洋芽孢杆菌碱性磷酸酶阴性、脂肪酶（C₁₄）阳性、β-半乳糖苷酶阴性、β-葡萄糖苷酶阳性、酯酶（C₄）阴性，这些特征已明显区别于已公开报道的其他海洋芽孢杆菌属有效种。

本发明具体提供一种达木海洋芽孢杆菌（Oceanobacillusdamuensis，附图1）

本发明通过以不同的温度、PH值、盐浓度和培养基为富集条件，从新疆莎车盐湖中取样，分离纯化培养到多株菌，经过多级筛选确定一株嗜盐海洋芽孢杆菌（OceanobacillusdamuensisPT-20^T），命名为达木海洋芽孢杆菌，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏单位（KCTC）保藏时间分别为2013年3月6日，保藏号分别是KCTC33146，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和技术研究所，邮编是305-806，经微生物多相分类鉴定为海洋芽孢杆菌（OceanobacillusdamuensisPT-20^T=KCTC33146^T。细胞好氧，革兰氏阳性，运动性，呈短杆状，大小范围为0.2-0.4×1.0-1.2μm，端生孢子，孢子囊些微肿胀，菌落呈奶油色，形状呈圆形规则，边缘光滑。NaCl耐受范围为3-20%(最佳盐浓度为10%-15%)，pH生长范围为6.5-11.0(最佳pH范围为7.5-9.0)，温度生长范围为15-40℃(最佳生长温度为30-37℃)。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，可以水解淀粉，不能水解吐温-80，明胶和纤维素。其生长过程中不产生H₂S和吲哚，M.R.和V.P.实验阴性。能利用碳源：糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、万古霉素、四唑紫、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、α-D-葡萄糖、L-岩藻糖1%乳酸钠、梭链孢酸、D-阿拉伯醇、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、醋竹桃霉素、利福霉素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、林可霉素、盐酸胍、果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、葡罗酰胺、D-乳酸甲酯、柠檬酸、α-氧代戊二酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化锂、吐温-40、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、α-氧代丁酸、乙酰乙酸、氨曲南和丁酸钠；不能利用碳源：D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、四唑蓝、D-蜜三糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神经氨酸、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-丝氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天门冬氨酸、D-丝氨酸、二甲胺四环素、明胶、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、硫酸四癸钠、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、D-苹果酸、亚碲酸钾、γ-氨基丁酸、丙酸、醋酸、甲酸和溴酸钠。细胞壁主要肽聚糖类型为内消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，主要醌型为MK-7，主要脂肪酸为anteiso-C_15:0和iso-C_15:0，主要极性脂为磷脂酰甘油(PG)，G+C含量为39.2mol%

对该菌株OceanobacillusdamuensisPT-20^T的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《放线菌系统学——方法、原理与实践》进行。其中碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，采用高效液相法来测定该菌的醌组分和细胞内GC含量，使用2.5%戊二醛固定该菌后，在扫描电镜下观察该菌的形貌（图1），参考菌株为OceanobacillusprofundusCL-MP28^T(DSM18246^T)、OrnithinibacillusbavariensisWSBC24001^T、Oceanobacillusiheynsis用于和测试菌株PT-20比较。

本发明通过DNA的提取，16SrDNA的PCR及测序，同时根据在NCBI山上比对结果和进化树的构建，进一步对该菌的分类地位进行判断。

采用Sanger法对OceanobacillusdamuensisPT-20^T的16SrDNA测序结果如下（该序列已在NCBI登记，登录号为HQ620695），全长共1592bp：

CAAGTCGAGCGCGGGAAGCTTTTCTGACCCCTTCGGGGTGAAGAAGAGTGGAACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGATTGGGATAACTCGCGGAAACGTGAGCTAATACCGGATAATACTTTTTGTCTCCTGACAGAAAGATGAAAGGCGGCTTTTAGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCGCCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCTCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAGGACTTGAGTACAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACCACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACTAATGATTGGGG

基于16SrDNA基因构建的系统发育树见图2，从图上可以看出达木海洋芽孢杆菌OceanobacillusdamuensisPT-20^T与海洋芽孢杆菌的一个有效种OceanobacillusprofundusCL-MP28^T（DSM18246^T）聚为一个分支，该海洋芽孢杆菌Oceanobacillusdamuensis亲缘性最近的菌株OceanobacillusprofundusCL-MP28^T（DSM18246^T）的16SrDNA相似度为97.267%，结合表型、生理生化和基因型比较数据，表明达木海洋芽孢杆菌Oceanobacillusdamuensis为海洋芽孢杆菌属Oceanobacillus的一个新种。

基于该菌为短杆状革兰氏阳性菌，严格好氧，产芽孢，具有运动性，细胞大小为0.2-0.4×1.0-1.5μm，菌落呈奶油色。NaCl耐受范围为3-20%(最佳盐浓度为10%-15%)，PH生长范围为6.5-11.0(最佳PH范围为7.5-9.0)，温度生长范围为15-40℃(最佳生长温度为30-37℃)。氧化酶和过氧化氢酶阳性，具有硝酸还原能力，可以水解淀粉、糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、吐温-40、β-羟基丁酸、α-氧代丁酸，同时具有脂肪酶（C14）活性。本发明可广泛应用于各类基因工程产品的高盐浓度发酵中。同时该菌能利用以下碳源生长：糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、万古霉素、四唑紫、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、α-D-葡萄糖、L-岩藻糖1%乳酸钠、梭链孢酸、D-阿拉伯醇、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、醋竹桃霉素、利福霉素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、林可霉素、盐酸胍、果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、葡罗酰胺、D-乳酸甲酯、柠檬酸、α-氧代戊二酸、L-苹果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化锂、吐温-40、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、α-氧代丁酸、乙酰乙酸、氨曲南和丁酸钠；不能利用碳源：D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、四唑蓝、D-蜜三糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神经氨酸、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-岩藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-丝氨酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-天门冬氨酸、D-丝氨酸、二甲胺四环素、明胶、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、硫酸四癸钠、L-半乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、粘酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、D-苹果酸、亚碲酸钾、γ-氨基丁酸、丙酸、醋酸、甲酸和溴酸钠。

本发明的达木海洋芽孢杆菌OceanobacillusdamuensisPT-20^T=KCTC33146^T可在较高盐浓度下正常生长，硝酸盐还原阳性，能够水解淀粉，具有酯酶（C₈）、脂肪酶（C₁₄）和β-葡糖苷酶活性，可广泛应用在脂肪酶、酯酶生产和各种基因工程产品高盐浓度下发酵领域。

附图说明：图1是扫描电子显微镜15000倍下PT-20的照片。图2是PT-20与临近菌构建的NJ进化树。图3是PT20碳源利用情况，其中1、profundus2、PT-11；3、PT-20；4、iheynsis；5、bavariensis。图4是PT-20及其临近菌的化学特征，其中1、PT-11；2、bavariensis；3、profundus；4、PT-20。图5是PT-20酶活特性，其中1、profundus；2、PT-11；3、PT-20。

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

具体实施方式

实施例一：达木海洋芽孢杆菌Oceanobacillusdamuensis的筛选和分离

样品采集与菌株筛选分离

样品采集于新疆维吾尔族自治区莎车县。样品来自多个区域，分布于东经76°1′57″至77°46′30″、北纬37°27′30″至39°15″之间。用无菌玻璃瓶收取距表层5-10cm土壤，经风干，研磨，过筛，置于4℃保存，用于后续分离。筛选培养基选用苯酚富集培养基(PT)，腐殖酸富集培养基(HVA)，钼酸钠富集培养基(HNA)和高盐富集培养基(YCSS)，纯化培养基选用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB+10%NaCl)，通过接种不同的富集培养基对菌株进行筛选。将1g土样加入装有25ml液体培养基的摇瓶中，在28℃下振荡培养7天。然后用移液枪吸取富集液，作10倍梯度稀释，取200μl10-1~10-4倍数稀释液分别涂布到对应培养基平板上，置于28℃下继续培养一周。观察生长状况与形态特征，将长出的菌落转接至TSB固体培养基，经多次划线，再挑取单菌落转接至TSB斜面培养基，置于4℃作短期保藏。同时取新鲜菌液混合25%浓度甘油，置于-80℃作长期保藏。（所有培养基配方见下表）

苯酚富集培养基(PT)：酪蛋白胨7.5g，氯化钠100g，酵母浸出物10g，苯酚690μl，MS混合液1unit，无菌水1000ml，pH8.2-8.5。

腐殖酸富集培养基(HVA)：腐殖酸1g，氯化钠150g，MS混合液1unit，无菌水1000ml，pH8.2-8.5。

钼酸钠富集培养基(HNA)：酪蛋白胨7.5g，氯化钠150g，酵母浸出物10g，MS混合液1unit，无菌水1000ml，pH8.2-8.5。

高盐富集培养基(YCSS)：酪蛋白胨7.5g，氯化钠250g，酵母浸出物10g，MS混合液1unit，无菌水1000ml，pH8.2-8.5。

MS混合液：浓度为0.05g/L相容性物质(甜菜碱，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨酸盐)混合液1.5ml；浓度为0.05g/L氨基酸（天冬氨酸，组氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，缬氨酸，亮氨酸，酪氨酸，谷氨酸）混合液15ml；浓度为0.025mg/L维生素（VB1，VB2，VB12，VB6，VH，VM，VPP）混合液0.25ml。

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB+10%NaCl)：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl100g，琼脂粉18g，蒸馏水1000ml，pH8.0-8.2。

菌株描述：

该菌株为短杆状革兰氏阳性菌，严格好氧，产芽孢，具有运动性，细胞大小为0.2-0.4×1.0-1.5μm，菌落呈奶油色。NaCl耐受范围为3-20%(最佳盐浓度为10%-15%)，pH生长范围为6.5-11.0(最佳pH范围为7.5-9.0)，温度生长范围为15-40℃(最佳生长温度为30-37℃)。

实施例二：达木海洋芽孢杆菌Oceanobacillusdamuensis的多相分类鉴定

对该菌株OceanobacillusdamuensisPT-20^T的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《放线菌系统学——方法、原理与实践》进行。其中碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，采用高效液相法来测定该菌的醌组分和细胞内GC含量，脂肪酸成分测定采用美国MIDI公司Sherolock全自动细菌鉴定系统分析，酶学特性采用APIZYM试剂条鉴定，参考菌株为OceanobacillusprofundusCL-MP28^T(DSM18246^T)、Oceanobacillusiheynsis、OrnithinibacillusbavariensisWSBC24001^T，碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统测定。结果见图3、图4和图5.

从酶活结果来看，该菌株PT-11与亲缘性最近对照模式菌OceanobacillusprofundusDSM18246^T有6种酶活性不同；在碳源利用方面，共有13种情况不同；模式菌株GC含量低于测试菌株PT-20，结合进化树数据，判断该株菌为海洋芽孢杆菌属的一个新种。

实施例三：16SrDNA测序及进化树构建

采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16SrRNA基因序列，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库将各菌株测得的16SrRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌株。通过BioEdit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA5.0上分别使用Neighbor-Joinin(N-J)法构建系统进化树，进化树bootstrap为1000。PCR相应引物、反应体系、条件如下：引物PA₈:5'-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和PB₁:5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，反应体系（25μl体系）：Mg²⁺2.5μl，PA₈2.5μl，PB₁2.5μl，dNTP0.75μl，H₂O14μl，Taq酶0.25μl，反应条件95℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，延伸1min，重复35个循环，72℃保温10min。构建的进化树见图2。

实施例四：达木海洋芽孢杆菌OceanobacillusdamuensisPT-20^T=KCTC33146^T的应用

硝酸盐还原：滴加格里斯氏试剂A，B到待测细菌培养液中，若变红色，则为硝酸盐还原阳性，若不变色，滴加二苯胺试剂后，仍不呈蓝色，则为硝酸盐还原阴性。结果显示测试菌株PT-11显红色，所以为硝酸盐还原阳性。

实施例五：达木海洋芽孢杆菌OceanobacillusdamuensisPT-20^T=KCTC33146^T的应用

淀粉水解：将测试菌株PT-20接种到含有1%的可溶性淀粉的TSA培养基上，滴加碘液染色，观察是否有透明水解圈出现，若出现则为阳性，若否，则为阴性。结果显示有水解出现，证明该菌株有淀粉酶活性。

Claims

1.一株海洋芽孢杆菌（Oceanobacillusdamuensis）PT-20，其保藏编号为KCTC33146。

2.如权利要求1所述海洋芽孢杆菌OceanobacillusdamuensisPT-20，其保藏编号为KCTC33146，其特征为短杆状革兰氏阳性菌，严格好氧，产芽孢，具有运动性，细胞大小为0.2-0.4×1.0-1.5μm，菌落呈奶油色，NaCl耐受范围为3-20%，pH生长范围为6.5-11.0，温度生长范围为15-40℃，氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，可以水解淀粉，不能水解吐温-80，明胶和纤维素，其生长过程中不产生H₂S和吲哚，M.R.和V.P.实验阴性，细胞主要脂肪酸为anteiso-C15:0和iso-C15:0，主要呼吸醌为MK-7，细胞壁肽聚糖类型主要为内消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，DNA(G+C)含量为39.2mol%，主要极性脂为磷脂酰甘油(PG)。