CN105238721B

CN105238721B - 一株农药降解菌及其应用

Info

Publication number: CN105238721B
Application number: CN201510715812.9A
Authority: CN
Inventors: 田永强; 龙秀锋; 张帅
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105238721A

Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇杆菌Sphingobacterium griseoflavus SCU‑B140，其保藏编号为KCTC 42158。通过从蟋蟀体表分离、筛选、生理生化鉴定等工作，确定该菌株为杆状（图一），革兰氏阴性菌，好氧，菌落颜色为灰黄色。本发明的鞘氨醇杆菌氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力，同时该菌株能降解农药毒死蜱，具有碱性磷酸酶、酯酶（C4）、脂肪酶（C8）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N‑乙酰‑葡萄糖胺酶等酶活性，可广泛地应用在农药降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。附图是扫描电子显微镜50000倍下观察到的菌株SCU‑B140的形貌。

Description

一株农药降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及其应用领域，具体的说，本发明涉及一种能降解农药的鞘氨醇杆菌及其应用的技术领域。

背景技术

20世纪60年代出现的第一次“绿色革命”为人类的粮食安全做出了重大贡献，其中农药为粮食的增产起到了重要的保障作用。由于农药具有成本低、见效快、省时省力等优点，在世界各国的农业生产中被广泛使用。然而，施用农药后仅有很少部分作用于防治对象本体、大部分都附在农作物表面或者散落在周边环境中。化学农药主要是人工合成的生物外源性物质, 大多数农药本身对人类及其他生物具有毒性, 加之多数农药还具有高残留、难降解的特性, 更使得化学农药的使用严重威胁人类的身心健康和生态环境协调发展。农药污染是我国影响范围最大的一种有机污染，不仅污染土壤环境和农作物，而且还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境，直接威胁着人类的生存环境和身体健康。我国是个农业大国，农药，尤其是化学农药的使用，依然是保证粮食作物增产、稳产的重要的和有效的手段，为了解决这个矛盾，一方面要开发高效、低毒、低残留的化学农药或生物农药，另一方面则是要找到能够高效、快速降解农药残留的方法。

农药的残留广泛分布于土壤、水体、大气及农产品中, 难以利用大规模的工程措施消除。实际上,农药残留在自然界主要依靠微生物缓慢地进行降解,这虽然是依靠自然力量、不产生二次污染的理想途径,但其降解速度无法满足环境保护和治理的要求。近年来,随着对农药残留污染问题的重视,经过大量的研究,已分离到很多能降解或转化某种或几种农药的微生物类群。因此，从自然界分离和筛选具有高效降解特性的微生物并对其进行降解机理的研究,已成为当今研究的热点。

大量研究证明，自然环境中存在的多种微生物在农药降解方面起着重要的作用，科研工作者通过富集培养、分离筛选等技术已发现了许多能够降解农药的微生物。到目前为止,人们已分离了许多可降解农药的微生物,这些微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类。其中,对细菌的研究较为深入,其次是真菌。细菌主要有:假单孢菌属 (Pseudomonas)、芽孢杆菌属 (Bacillus)、节细菌属 (Arthrobacter)、棒状杆菌属 (Corynebacterim)、黄杆菌属 (Flavobacterium)、黄单孢杆菌属 (Xanthomonas)、固瘤细菌属 (Azotomonus)、硫杆菌属 (Thiobacillus)等。真菌主要有:曲霉属 (Aspergillus)、青霉属 (Penlcillium)、木霉属 (Trichoderma)、镰刀菌属 (Fusarium)等。

微生物降解农药机理分为两类:一类是矿化作用，是指微生物直接以农药作为生长基质，将其完全分解成无机物如CO₂和H₂O等；另一类是共代谢作用，是指微生物在有可利用碳源存在时，对原来不能利用的物质进行分解代谢的现象。农药的微生物降解途径大致分为两种: 酶促途径和非酶促途径。酶促反应即微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，通过氧化、脱氢、还原、水解、合成等作用直接作用于农药。或者，虽然不含降解该农药的酶系，但在农药胁迫下，微生物的基因发生重组或改变，产生了新的降解酶系。非酶促反应是微生物活动使环境pH发生变化而引起农药降解，或产生某些辅助因子或化学物质参与农药的转化。

目前，农药微生物降解技术研究中主要存在5个问题：（1）单一菌株的纯培养问题。在实验室内获得纯培养的菌株，然后研究它的特性、降解机理等。然而这一方法与实际情况不太符合，因为在自然状态下是多种微生物共存，通过微生物之间的共同作用来降解农药，并且农药残留往往存在于土壤、水体、农副产品等复杂环境中，即使实验室内一株菌的降解活性再强，到了这种复杂环境下有可能无法生存或起不到期望的作用。（2）受农药污染的环境及食品不能进行有效的处理。受农药污染的环境由于比较分散而且面广，很难集中统一起来处理，特别是被农药污染的食品，不能随便轻易采用微生物来处理，既要保证对农药进行降解，又要保证所使用的微生物对人体健康无害，这在目前是很难做到的，因此对食品更缺乏有效的处理方式。（3）环境条件对微生物降解农药的影响。环境条件对微生物的生长和对农药的降解影响很大，如环境中的温度、pH、水分含量、有机质含量和含氧量等变化会直接影响到微生物对农药的降解。（4）降解过程中微生物与农药接触的难易程度。对于被农药污染的土壤和水体，微生物很容易与其中的残留农药接触，从而能发挥它们的降解功能。但是，对于被农药污染的食品来说，利用微生物降解其中残留的农药很难，因为微生物无法与存在于食品内部的残留农药接触，无法发挥它们的作用。（5）微生物的适应性问题。所接种的微生物能否适应污染的环境，这不仅包括上述提到的物理环境，还涉及到生物之间的关系。接种到环境中的微生物受到抑制物的影响，或者受到包括捕食者在内的土著微生物的影响，甚至受到拮抗作用而不能生长等，这些都可以造成接种的微生物不能成为优势菌从而失去对农药的降解作用。构建多菌株复合系，具有稳定性和抗污染性强的优点，但即使是多菌混合培养的复合系也同样存在能否成为优势群体的问题。

针对上述问题，我们可以从以下几个方向去努力：（1）开发和利用农药高效降解菌，建立高效降解菌的种子库。（2）在识别微生物降解酶基因的基础上，对降解酶基因进行克隆与表达，构建工程菌、提高降解能力，制备降解酶。（3）研究特定农药微生物降解机理、代谢途径。（4）对天然的降解农药的微生物进行研究。在被农药污染的环境中可以诱导出天然的降解农药的微生物，如果采取一定措施控制条件，充分调动这些土著微生物的作用，可采用原位生物修复，而不用人为的接种微生物。

发明内容

针对国内外有关农药降解菌的研究现状，本发明提供一种新的农药降解菌。所述的农药降解菌可利用glycerol、D-galactose、L-rhamnose、D-melibiose、L-arabinose、maltose、D-raffinose，同时与该属其他菌株的16S rRNA基因序列的最高相似性95.06%至97.49%（EzTaxon），这些特征明显区别于已公开报道的其他有效菌种。

本发明提供一株鞘氨醇杆菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140。

本发明通过以不同的温度、pH值、盐浓度和培养基为富集条件，从长期施加农药农田中取样，分离纯化得到多株菌，经过多级筛选确定了一株农药降解菌（Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140），命名为griseoflavus鞘氨醇杆菌。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型菌种保藏中心（KCTC），保藏时间为2014年6月26日，保藏号是KCTC 42158，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。该菌为好氧菌，革兰氏阴性，细胞大小为0.4-0.6µm×1.1-2.0µm，菌落颜色为灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性，脲酶阴性，具有硝酸还原能力。细胞主要脂肪酸为iso-C_15:0, summed feature 3 (iso-C_15:0 2-OH and/or C_16:1 ω7c)和C_16:0，主要呼吸醌为MK-7，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，可利用碳源糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖苷、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸，不能利用碳源淀粉、侧金盏花醇、D-阿拉伯糖、赤藻糖醇、L-果糖、m-肌醇、D-甘露醇、阿洛酮糖、D-山梨醇、木糖醇、丙烯三羧酸、柠檬酸、甲酸、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖胺酸、D-葡萄糖酸、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、γ-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、α-酮丁酸、α-酮戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、奎尼酸、D-葡糖二酸、癸二酸、琥珀酸、溴丁二酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、D-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天门冬氨酸、L-组氨酸、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、D-丝氨酸、D,L-肉碱、γ-氨基丁酸、尿苷酸、肌苷、胸腺嘧啶核苷、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇、丙三醇、D,L-α-磷酸甘油、1-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖。

对该菌株Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的形态观察、生理生化及培养特性和化学分类均按照《放线菌系统学——方法、原理与实践》进行。其中碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，呼吸醌组分和细胞内G+C含量采用高效液相法来测定，使用2.5%戊二醛固定细胞后，在扫描电镜下观察该菌的形貌（图一），参考菌株为Sphingobacterium bambusae IBFC2009用于和测试菌株SCU-B140比较。

本发明通过提取总DNA、16S rRNA基因序列的扩增和测序，根据测序结果，在NCBI上用Blast进行比对分析并构建系统发育树，进一步对该菌的分类地位进行判断。

采用Sanger法对Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的16S rRNA基因测序结果如下（该序列已在NCBI登记，登录号为KJ000806），全长共1314bp：

GAGTGAGAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGAGCAACCTGCCCATATCAGGGGGATAGCCCGGAGAAATCCGGATTAAGACCGCATAACACATCACCTTCGCATGGAGGCGTTGTTAAATATTTATAGGATATGGATGGGCTCGCGTGACATTAGCTGGTTGGTGGGGTAACGGCCCACCAAGGCGACGATGTCTAGGGGCTCTGAGAGGAGAATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAAGGAATATTGGTCAATGGGCGGAAGCCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGACGACTGCCCTATGGGTTGTAAACTGCTTTTGCCGGGGAATAAACCTATCTACGTGTAGATAGCTGAACGTACCCGGAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGATCCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCACTTTAAGTCAGGAGTGAAAGACGGCAGCTCAACTGTCGCAGTGCTCTTGATACTGAAGTGCTTGAATGCCGTTGAAGATGGCGGAATGAGACAAGTAGCGGTGAAATGCATAGATATGTCTCAGAACTCCGATTGCGAAGGCAGCTGTCTAAACGGTGATTGACGCTGATGCACGAAAGCGTGGGGATCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATGACTCGATGTTTGCGATATACGGTAAGCGTCCAAGCGAAAGCGTTAAGTCATCCACCTGGGGAGTACGCCCGCAAGGGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGAGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCCGGGCTTGAAAGTTACTGAATGGTCCAGAGATGGGCCAGTCCTTCGGGACAGGAAACTAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATGTTTAGTTGCCAGCATTTAAGGTGGGGACTCTAAACAGACTGCCCGTGCAAACGGTGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTCCGGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGGGCAGCTACACAGCAATGTGATGCCAATCTCTAAAAGCCATTCACAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTTGGATTCGCTAGTAATCGCGTATCAGCAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAACCCATTA

基于16S rRNA基因构建的系统发育树可以看出Sphingobacterium griseoflavusSCU-B140与鞘氨醇杆菌属的一个有效种Sphingobacterium bambusae IBFC2009聚为一个分支，该菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140与亲缘性最近的菌株Sphingobacterium bambusae IBFC2009的16S rRNA基因序列相似度为97.49%，结合表型、生理生化和基因型比较数据，表明菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140为鞘氨醇杆菌属的一个新种。

通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。

本发明的Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140为好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为0.5%至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶（C4）、脂肪酶（C8）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，可广泛地应用在农药降解酶的开发和各类生物工程酶制剂的生产领域。

附图说明：图一是菌株Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140扫描电子显微镜50000倍下照片。

下面举实施例说明本发明，但是本发明并不限于下述实施例。

具体实施方法

实施例一：Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的筛选和分离

实验用蟋蟀样品为乌头眉纹蟋蟀（teleogryllus occipitalis）的成虫，多分布于农田，于2012年8月份分批次捕捉自四川省成都市双流县四川大学江安校区荒地（30°33’38.04”北104°00’ 20.17”东，海拔481米）。用无菌水将微生物从蟋蟀洗脱后，采用稀释平板法涂布至TSB、查氏、高氏一号、PDA、牛肉膏蛋白胨和虫体无机盐培养基上培养，37℃下培养至可见菌落出现，纯化菌落后进行鉴定。

菌种描述：

好氧菌，革兰氏阴性，菌落呈灰黄色。氧化酶和过氧化氢酶阳性。pH生长范围为6至9，最适生长盐浓度为0.5%至1%。该菌具有碱性磷酸酶、酯酶（C4）、脂肪酶（C8）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶等酶活性，细胞主要脂肪酸为iso-C_15:0, summedfeature 3 (iso-C_15:0 2-OH and/or C_16:1 ω7c)和C_16:0，主要呼吸醌为MK-7，主要极性脂为磷脂酰乙醇胺(PE)，细胞内G+C含量为41.22%。

实施例二：Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的多相分类鉴定

对该菌株Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的碳源利用情况采用Biolog全自动细菌鉴定系统，脂肪酸成分测定采用GC-MS分析，酶学特性采用API ZYM试剂条鉴定，产酸实验采用API50CHE试剂条鉴定，参考菌株为Sphingobacterium bambusaeIBFC2009。结果如下：

可利用碳源：糊精、吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-半乳糖苷、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-棉子糖、L-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸。

具有的酶活性：碱性磷酸盐酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶。

API50CHE鉴定结果对比：从API50 CHE结果来看，菌株Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140和最亲近菌种Sphingobacterium bambusae IBFC2009共有16种底物利用不同，结合进化树数据判断该菌为鞘氨醇菌属的一个新种。

实施例三：16S rRNA基因测序及进化树构建

采用SDS法提取细菌总DNA，通过PCR法扩增菌株16S rRNA基因序列，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。到GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库将各菌株测得的16S rRNA基因部分序列提交注册获得序列号。再在NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)上进行BLAST比对，找到亲缘关系最近的菌株。通过BioEdit将亲缘性最近的相应菌株进行序列比对，然后在软件MEGA 5.2上使用Neighbor-Joinin(N-J)法构建系统进化树。PCR相应引物、反应体系、条件如下：引物27F：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1492R： 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，反应体系（25μL体系）：Mg²⁺2.5μL，27F 2.5μL，1492R 2.5μL，dNTP 0.75μL，H₂O 14μL，Taq酶0.25μL，反应条件95℃预变性5min，94℃变性45s，50℃退火45s，72^oC延伸1min，重复35个循环，72^oC保温10min。

实施例四：鞘氨醇杆菌Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140的应用

硝酸盐还原：滴加格里斯氏试剂A，B到待测细菌培养液中，若变红色，则为硝酸盐还原阳性，若不变色，滴加二苯胺试剂后，仍不呈蓝色，则为硝酸盐还原阴性。结果显示测试菌株SCU-B140^T显红色，所以为硝酸盐还原阳性。

实施例五：Sphingobacterium griseoflavus SCU-B140对农药降解实验

将菌种接至TSB（深孔板，每孔6 mL），37^oC、140rpm培养，第二天同一时间加农药毒死蜱（12g/L，1% Tween 80 助溶）200 μL，取样检测毒死蜱含量，第三天同一时间取样，检测毒死蜱含量。毒死蜱含量检测方法：使用石油醚抽提，测抽提液293nm时的吸光度。实验重复三次，结果取平均值，结果为25.2%。

Claims

1.一株农药降解菌 SCU-B140，该菌株于2014年6月26日保藏于韩国典型菌种保藏中心（KCTC），保藏编号为KCTC 42158。