CN103961349A

CN103961349A - 抗风湿类药物来氟米特(Leflunomide)抑制神经母细胞瘤生长

Info

Publication number: CN103961349A
Application number: CN201310046878.4A
Authority: CN
Inventors: 崔红娟; 祝顺琴; 汪琳; 夏庆友; 向仲怀
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q; Southwest University
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center Beijing Entry-Exit Inspection and Q; Southwest University
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明公开了抗风湿药物来氟米特的一种新功能，即来氟米特对神经母细胞瘤的抗癌功能。发明人通过实验发现，来氟米特具有抑制神经母细胞瘤细胞系BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ生长，其机理主要是通过阻断细胞周期以及促进细胞凋亡。进一步通过神经母细胞瘤小鼠模型体内实验证实来氟米特具有抑制神经母细胞瘤生长的功能，这表明来氟米特可以作为一种潜在的抗神经母细胞瘤药物用于临床研究和开发。

Description

抗风湿类药物来氟米特(Leflunomide)抑制神经母细胞瘤生长

技术领域：

本发明涉及抗风湿类药物来氟米特具有抑制神经母细胞瘤生长的功能，其机理主要是通过阻断细胞周期以及促进细胞凋亡，来达到抑制神经母细胞的生长。进一步通过神经母细胞瘤小鼠模型体内实验证实来氟米特可以抑制神经母细胞瘤的生长，这表明来氟米特可以作为一种潜在的抗神经母细胞瘤药物用于临床研究和开发。

背景技术

神经母细胞瘤是一种儿童常见的交感神经系统恶性肿瘤，该病多发于10岁以下儿童，占儿童肿瘤发生率的10％及儿童肿瘤死亡率的15％。神经母细胞瘤是从发育中的脊髓外层迁移过来的神经母细胞或原始神经嵴细胞所衍化的，其治疗效果与诊断时患儿的年龄及临床分期有关，患儿年龄越大，分期越高，肿瘤越容易扩散，则预后越差。尽管对该肿瘤的治疗方法研究从未间断，也取得了一些研究进展，但是疗效甚微。因此探讨发现新神经母细胞瘤的治疗手段具有重要的临床意义。

来氟米特(leflunomide)，商品名爱若华，是一种合成的异恶唑类化合物，具有免疫抑制及抗增殖作用。美国食品及药物管理局(FDA)于1998年批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)，1999年中国药品食品监督管理局(SFDA)批准在中国上市。与其他免疫抑制剂相比，来氟米特(leflunomide)具有抑制嘧啶合成、抑制蛋白酪氨酸激酶活性等的特点，并具有抗病毒作用等优点。主要用于自身免疫性疾病如类风湿性关节炎的治疗以及系统性红斑狼疮(SLE)等，且药物副作用较其他抗风湿药小。

来氟米特作为临床用药，其毒副作用清楚。在我们的研究中，开发了来氟米特药物的老药新用的用途。我们首次发现来氟米特具有抑制神经母细胞瘤生长的新功能，主要通过阻断细胞周期以及促进细胞凋亡，来达到抑制神经母细胞的生长。进一步通过神经母细胞瘤小鼠模型体内实验证实来氟米特可以抑制神经母细胞瘤的生长，这表明来氟米特可以作为一种潜在的抗神经母细胞瘤药物用于临床研究和开发。

发明内容

本发明的目的在于，实验表明用于治疗类风湿性关节炎(RA)的来氟米特具有抑制神经母细胞瘤生长的功能，其机理是通过阻断细胞周期以及促进细胞凋亡，来达到抑制神经母细胞的生长。基于此来氟米特可以作为一种抗神经母细胞瘤药物用于临床研究和开发。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

采用神经母细胞瘤细胞系BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ为研究对象，研究抗风湿类药物来氟米特在制备抗神经母细胞瘤药物中的应用。

发明人通过实验发现：

1.来氟米特能抑制细胞的生长。

2.来氟米特可以阻断神经母细胞瘤细胞的周期。

3.来氟米特可以加速神经母细胞瘤的凋亡。

4.来氟米特在神经母细胞瘤的荷瘤鼠模型上具有抑制肿瘤生长的功能。

附图说明：

图1为来氟米特能够抑制神经母细胞瘤细胞BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ的生长；A.100μM的来氟米特处理不同的神经母细胞瘤细胞BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞3天，细胞数量明显减少；B.CCK-8实验测定细胞的生长曲线显示不同浓度的来氟米特对三种神经母细胞瘤细胞系的生长抑制作用随浓度的增加，抑制程度增强；C.统计分析Brdu细胞增殖检测100μM的来氟米特处理3天对三种神经母细胞瘤的增殖抑制作用(*表示与对照组比较P＜0.05，**表示P＜0.01)。

图2为来氟米特能够阻断神经母细胞瘤细胞BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ的细胞周期；A.100μM的来氟米特处理不同的神经母细胞瘤细胞BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞3天，流式细胞术检测细胞周期图谱；B.流式细胞术检测细胞周期图谱结果统计分析显示100μM的来氟米特处理3天对神经母细胞瘤细胞S期有阻滞作用(*表示与对照组比较P＜0.05，**表示P＜0.01)。

图3为来氟米特可以加速神经母细胞瘤BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞的凋亡；A.100μM的来氟米特处理不同的神经母细胞瘤细胞BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞3天，流式细胞技术分析Annexin-V/FITC标记细胞凋亡图谱；B.流式细胞术检测细胞凋亡图谱统计分析显示100μM的来氟米特处理3天，可以明显加速细胞凋亡(*表示与对照组比较P＜0.05，**表示P＜0.01)。

图4为来氟米特在神经母细胞瘤的荷瘤鼠模型上具有抑制肿瘤生长的功能；A.肿瘤形态大小展示；B.肿瘤体积生长曲线；C.肿瘤重量结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、实验方法与步骤：

1.1、细胞培养

人神经母细胞瘤细胞系BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞呈贴壁生长，BE2-C培养于10％胎牛血清，青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM/F12培养基中，SK-N-F1，SK-N-DZ培养于10％胎牛血清，青霉素、链霉素各100U/mL的DMEM培养基中，在37℃，5％CO₂条件下培养，每2-3天更换培养基或传代培养。

1.2、药物处理

来氟米特(leflunomide)购买于sigma公司，溶解于100％DMSO中，配制成200mM的存储液，分装，-20℃保存。梯度稀释为12.5μM，25μM，50μM，100μM，200μM二工作浓度，DMSO作为对照。

1.3CCK-8生长曲线测定

将含2000各细胞的200μL细胞悬液接种于96孔板上，5孔/组，共接种4板，置于37℃，5％C0₂条件下培养，从铺板开始，每两天去除一板，弃去培养液，PBS清洗一遍，每孔加100μL的培养液，10μL CCK-8，继续孵育2小时，在酶标仪上测定450nm下测定吸光度值。取吸光度的平均值，以DMSO为100％，计算药物组相对对照组的生长速率，绘制生长曲线。

1.4免疫荧光

取对数生长期细胞，稀释成10000个细胞/孔，接种于24孔板细胞爬片上，24小时贴壁后，实验组用100μM的来氟米特处理BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ3天，同等体积的DMSO作为对照。3天后，按照Brdu免疫荧光操作步骤进行操作，荧光显微镜下观察。

1.5细胞周期检测

实验组采用100μM来氟米特处理BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ3天，同等体积DMSO作为对照，每组设三个重复。分别收集各组细胞，PBS洗两次，用70％冰冷乙醇固定24h，PBS洗1次，加入RNA酶37℃作用1-2h，加入Triton X-100PI(100μg/ml)100μl，混匀置冰上30min，在流式细胞仪检测，实验重复三次。

1.6细胞凋亡检测

实验组采用100μM来氟米特处理BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ3天，同等体积DMSO作为对照，每组设三个重复。分别收集各组细胞，PBS洗两次，利用Annexin-V/FITC双标记，在流式细胞仪检测细胞凋亡，实验重复三次。

1.7荷瘤鼠动物模型检测

对免疫缺陷鼠采取皮下注射神经母细胞瘤BE2-C细胞(100万个)，待出现肉眼可见肿瘤(14天可出现)，实验组按7.5mg/kg/天的来氟米特腹腔给药，对照组注射等体积的溶剂DMSO，连续给药12天。于3、6、9、12天用游标卡尺测量荷瘤鼠身上的肿瘤体积，12天以后对荷瘤鼠进行C0₂处死，取出肿瘤，称重并测量体积。

2、实验结果及分析

2.1来氟米特抑制神经母细胞瘤BE2-C，SK-N-F1，SK-N-DZ细胞的生长

细胞培养发现，来氟米特处理细胞后，细胞数量明显减少(图1.A)。CCK-8细胞增殖曲线的测定的结果显示，leflunomide能明显抑制肿瘤细胞的增殖，并呈现浓度依赖趋势(图1.B)为了进一步证实该结果，我们进行了Brdu免疫荧光标记，结果显示来氟米特处理后，Brdu阳性细胞明显减少，进一步证实来氟米特可以抑制细胞的增殖(图1.C)。

2.2来氟米特阻断细胞神经母细胞瘤细胞周期

肿瘤细胞最主要的特征是持续不断地增殖。细胞周期分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有丝分裂期)4个时期，流式细胞周期检测能检测各时期细胞所占的比例。我们研究发现，100μM来氟米特处理细胞3天后，细胞的周期明显被抑制于S期(图2.A-B)，即S期细胞明显增加BE2-C(药物组79.17％，对照38.06％)，SK-N-F1(药物组53.62％，对照组15.17％)，SK-N-DZ(药物组67.71％，对照组39.19％)，这表明肿瘤细胞被抑制生长的原因之一是因为细胞周期的阻滞所引起的。

2.3来氟米特加速神经母细胞瘤的凋亡

在我们实验中发现，药物处理细胞后，有大量的细胞从培养皿中漂起来，贴壁的细胞也出现细胞变尖等现象，这意味着药物可能促进了细胞的凋亡。利用流式细胞仪，采用AnnexinV-FITC/PI检测细胞的凋亡情况，发现100μM来氟米特处理细胞3天后，细胞的凋亡率明显增加(图3.A-B)，BE2-C(药物组92.8％，对照60％)，SK-N-F1(药物组46.0％，对照组19.9％)，SK-N-DZ(药物组43.5％，对照组28.3％)。这说明来氟米特能加速神经母细胞瘤的凋亡。

2.4来氟米特在神经母细胞瘤的荷瘤鼠模型上具有抑制肿瘤生长的功能

体外实验结果显示来氟米特能够显著抑制肿瘤细胞的生长。我们利用神经母细胞瘤的荷瘤鼠模型，进行体内实验研究，实验结果显示在不影响荷瘤鼠正常活动的情况下，药物组荷瘤鼠肿瘤的生长情况明显受到抑制(图4.A-C)，表明来氟米特在神经母细胞瘤动物模型上也具有抗肿瘤的功能。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说可以根据上述说明加以改进或者变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.首次发现来氟米特具有抑制神经母细胞瘤生长的新功能，主要通过阻断细胞周期以及促进细胞凋亡，来达到抑制神经母细胞的生长，通过神经母细胞瘤小鼠模型体内实验进一步证实了来氟米特可以抑制神经母细胞瘤的生长，这表明来氟米特可以作为一种抗神经母细胞瘤药物用于临床研究和开发。

2.根据权利要求1所述的应用制备获得的抗癌药物。