CN103926411B - 针对蛋白药物的elisa检测用特异性抗体对的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对蛋白药物的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括下列步骤：初步筛选能够用于ELISA夹心法检测蛋白药物的抗体对，包括捕获抗体和检测抗体；经过第一次检测确认所述的捕获抗体和所述的检测抗体能够阻断蛋白药物与其作用靶点的结合；第二次检测确认所述的捕获抗体和所述的检测抗体是针对蛋白药物与其作用靶点的结合表位；第三次检测确认利用所述的捕获抗体和所述的检测抗体对建立ELISA夹心法能用于不同基质中的样品检测。本方法能够比较全面、系统、高效的对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对进行筛选。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品检测领域，特别涉及ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，具体涉及一种针对蛋白药物的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法。
背景技术
随着生物技术的不断进步，生物大分子蛋白药物逐渐成为当今药物发展最为活跃和迅速的研究重点而受到广泛关注。生物蛋白药物包括蛋白多肽类似物或衍生物、融合蛋白、单克隆抗体药物等，是通过细菌、酵母或哺乳动物细胞等表达系统利用基因工程生产所得。在生物蛋白药物的市场上排在前列的是单克隆抗体类药物，它能够特异性的与治疗靶点结合，抑制肿瘤细胞生长或杀死肿瘤细胞，副作用相对小分子化药要小得多。近些年，随着一些早期的单抗类药物的专利即将到期，国内外各大药厂纷纷进行生物仿制药的研发，形成一阵热潮。
在蛋白药物的研制过程中，临床前和临床的药代动力学研究数据是必不可少的，也被药监部门认为是十分重要的，因为它直接关系到药物的安全性和有效性。药代动力学重点研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄，与药效学和毒理学研究一起构成蛋白药物药理学研究和评价的核心。
药代动力学研究的关键是建立稳定可靠的，能在复杂基质环境中检测到目标药物的定量方法，方法学的优劣直接影响研究质量。小分子化学药物结构简单，分子量小，常规色谱技术即能够实现对这一类药物的定量分析，实现难度不大。大分子蛋白药物则不然，以单克隆抗体药物为例，分子量达到150KD，有多聚物及电荷异质体的存在，有复杂的翻译后修饰，有内源性结构类似物等，这些都给药物定量方法学的建立带来了挑战，用于小分子化药药代动力学研究的实验手段也难以满足大分子蛋白药物的要求。
常见的用于蛋白药物药代动力学研究的分析方法包括基于同位素标记的分离分析技术和免疫分析方法，其中基于免疫分析的定量ELISA夹心法则是最常用的。该方法基于抗原/抗体间高亲和力的特异性结合，能够在药代动力学研究中涉及的样本如血清、尿液、唾液等复杂基质中实现对蛋白药物的微量分析。
建立ELISA夹心法的关键是寻找合适的抗体对，即针对同一待测蛋白药物的捕获抗体和检测抗体，抗体对能够分别与待测抗原的不同表位结合从而形成免疫复合物，通过偶联在检测抗体上的酶标记物、荧光标记等显色基团实现对目标抗原的检测。常规ELISA夹心法的构建在筛选抗体对时主要关注捕获抗体与检测抗体是否能够同时与待测抗原结合形成稳定的抗体对，与待测抗原之间的结合是否有足够的亲和力，尽量满足能够针对待测抗原的不同表位等，使得检测方法具有较高的灵敏度和较宽的检测范围。在针对生物蛋白药物的药代动力学研究来进行ELISA方法开发时，研究人员往往利用常规思路来筛选抗体对，并没有考虑到蛋白药物药代动力学研究的特殊性。
前已述及，蛋白药物分子量大，结构复杂，是针对人体内的作用靶点来设计的。蛋白药物注射到体内之后，为了减少机体产生免疫排斥反应，如免疫原性，在进行蛋白药物设计时会对蛋白药物的氨基酸序列进行人源化改造，即尽可能使药物蛋白接近人体自身蛋白，有时也直接用人体自身蛋白的氨基酸序列进行药物设计。所以很显然蛋白药物在人体内会存在许多结构类似物。这些结构类似物会对人体内目标蛋白药物的ELISA定量检测造成干扰。
另一方面，蛋白药物生产出来存在很多翻译后修饰，注射到体内也会有降解、代谢、修饰等现象出现，这些“残缺”的蛋白药物分子可能无法与体内作用靶点结合而发挥生物学功能。这些“残缺”的蛋白药物分子并不是药代动力学研究进行蛋白药物定量的目标，但会对“完整”的目标蛋白药物分子的定量检测造成干扰。
此外，即使是同一个抗体分子，在不同基质环境中与同一个蛋白药物的结合能力是有区别的，以血清为例，正常人血清中存在着大量不同类型的蛋白分子如细胞因子、补体、抗体等，这些都不可避免的会对抗原抗体间的结合造成干扰，所以一般情况下，针对同一抗原抗体反应，在血清中反应的检测信号值要低于在普通Buffer如PBS中反应的检测信号值。这些来源于基质环境中的干扰同样在进行蛋白药物药代动力学研究方法学建立过程中是需要考察和克服的。
正是由于生物蛋白药物相对于小分子化合物药物存在着上述这些复杂性和特殊性，针对某蛋白药物的药代动力学研究来建立相应的定量分析方法是十分困难的，所构建的ELISA夹心法必须能特异性的检测目标蛋白药物分子，捕获抗体和检测抗体不仅仅要满足高亲和力和不同表位的要求，对其所针对的表位还要进行选择，才能克服来自结构类似物以及基质环境的干扰，对目标蛋白药物分子进行准确定量，并满足灵敏度和检测范围的要求。
现有的文献资料并无对生物蛋白药物药代动力学研究定量分析ELISA夹心法建立，包括抗体对筛选方法的系统报道，传统、常规的ELISA抗体对筛选方法并不能满足复杂基质以及存在大量结构类似物的条件下对目标药物蛋白进行定量检测的需求。所以一种能使得整个筛选过程更加系统，筛选得到的抗体对能够针对蛋白药物与靶点的结合表位，最大程度的满足特异性检测目标蛋白药物的要求，排除结构类似物以及复杂基质对检测的干扰，利用筛选得到的抗体对所构建的ELISA夹心法具有较好的灵敏度和检测范围，能够满足实际针对蛋白药物包括多肽类、融合蛋白、单克隆抗体药物等进行临床前或临床药代动力学研究的检测需求的针对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法是十分必须的。
发明内容
本发明的一个目的是针对上述现有技术的不足，提供一种在进行生物蛋白药物药代动力学研究时，具有较好的灵敏度和检测范围，排除结构类似物以及复杂基质对检测的干扰的针对该蛋白药物的定量ELISA夹心法检测用特异性抗体对的筛选方法。
为实现上述目的，本发明提供的针对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括下列步骤：
a.初步筛选能够用于ELISA夹心法检测蛋白药物的抗体对，包括捕获抗体和检测抗体；
b.检测确认所筛选捕获抗体和检测抗体能够阻断蛋白药物与其作用靶点的结合；
c.检测确认所筛选捕获抗体和检测抗体是针对蛋白药物与其作用靶点的结合表位；
d.检测确认利用所筛选捕获抗体和检测抗体对建立ELISA夹心法能用于不同基质中的样品检测。
较佳的，所述的ELISA检测包括但不限于固相反应和液相反应。
较佳的，所述的蛋白药物包括但不限于单克隆抗体药物、融合蛋白、多肽类药物等
较佳的，在步骤a中，所述的检测蛋白药物的抗体对是针对蛋白药物的单克隆抗体。
较佳的，在步骤b中，所述的检测包括但不限于竞争性ELISA检测。
较佳的，在步骤d中，所述的基质包括但不限于盐离子缓冲液、培养基、人血清、动物血清、尿液、唾液等。
本发明的有益效果具体在于：采用本发明的方法，能够在已经初步筛选得到一些可用于ELISA夹心法检测蛋白药物的抗体对的基础上，比较系统全面的进一步筛选得到能够满足蛋白药物药代动力学研究所需的抗体对。利用筛选所得抗体对所建立的针对药物蛋白的ELISA夹心法具有较优的灵敏度和检测范围，能够排除结构类似物以及复杂基质环境对ELISA定量检测的干扰，满足蛋白药物包括多肽、融合蛋白、单克隆抗体药物等进行临床前或临床药代动力学研究的检测需求。
本发明在常规ELISA抗体对筛选的基础上对抗体对的检测特异性进行进一步筛选，直接针对蛋白药物与靶点间的作用位点，与此同时还对抗体对在不同基质环境中的检测情况进行考察。利用最终筛选得到的抗体对构建的ELISA夹心法具有较优的检测限和检测范围，能够满足在结构类似物以及复杂基质环境中对目标蛋白药物的检测需要，为生物药物的药代动力学研究提供实验工具。
本方法能够比较全面、系统、高效的对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对进行筛选，筛选得到的捕获抗体分子和检测抗体分子是特异性的针对蛋白药物与作用靶点的结合位点，能够阻断蛋白药物与作用靶点的结合，且不受各种基质环境的影响，基于该抗体对建立的ELISA夹心法在不同基质环境下反应，均具有较优的检测范围和检测限，能够满足针对不同多肽类、融合蛋白、单克隆抗体等生物蛋白药物的临床前及临床药代动力学研究的检测需求。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明方法的具体步骤如下：
步骤一：利用常规ELISA抗体对筛选技术针对目标蛋白药物进行抗体对筛选，包括捕获抗体和检测抗体，筛选得到的抗体对能够对蛋白药物进行ELISA检测，并且具有较优的检测灵敏度和检测范围。这些捕获抗体或检测抗体分子都满足针对蛋白药物的某特定表位。
步骤二：将步骤一中筛选得到的捕获抗体或检测抗体分别包被在96孔板中，接着加入标记有显色基团的蛋白药物，和一定量的蛋白药物作用的目标靶分子，在96孔板中进行竞争性的结合反应。反应一段时间后考察显色基团的信号值。该实验的目的是检测确认筛选得到的捕获抗体或检测抗体是否能够阻断蛋白药物与其作用靶点的结合，挑选阻断成功的待筛选抗体分子进行后续步骤。
步骤三：将步骤二中得到的抗体分子进行进一步的筛选确认它们针对的是蛋白药物与作用靶点间的结合表位。先将抗体分子分别标记生物素和显色化合物，分别得到标记生物素的抗体分子和标记显色化合物的抗体分子。根据蛋白药物与靶点的结合位点出现的位置，选择合适的蛋白水解酶对蛋白药物进行酶切，得到含有前述结合位点的蛋白药物的酶切肽段。然后利用包被亲和素的ELISA板，以标记生物素的抗体分子为捕获抗体，标记显色化合物的抗体分子为检测抗体，对含有结合表位的蛋白药物的酶切肽段进行ELISA检测，筛选合适的能够用于该酶切肽段ELISA夹心法检测的抗体对，满足具有较优的检测灵敏度和检测范围。
步骤四：选择蛋白药物临床前或临床药代动力学研究检测过程中可能涉及的不同基质环境，对经步骤三筛选得到的抗体对进行更进一步的筛选。在一般Buffer以及各种基质环境下，利用分别标记生物素和显色化合物的抗体对，对蛋白药物进行ELISA检测，比较不同基质环境下，方法的检测灵敏度及检测范围，挑选受基质环境影响最小的抗体对。
针对某生物大分子单克隆抗体药物药代动力学研究ELISA夹心法检测用特异性抗体对的筛选。
1、实验目的
针对某大分子单克隆抗体药物的临床药代动力学研究建立ELISA夹心检测法，在人血清样品中对该蛋白药物进行定量分析，该大分子单克隆抗体药物的作用靶点是某细胞因子。用于ELISA夹心法建立的抗体对来自于通过免疫小鼠杂交瘤融合技术得到的若干针对该单克隆抗体药物的特异性抗体，从这些抗体中筛选出合适的抗体对构建ELISA分析方法。
2、实验过程及结果
步骤一：利用商品化试剂盒（氨基活化偶联法）分别对待筛选的针对蛋白药物的10个特异性抗体Mab1-10分别偶联生物素（Biotin）和偶联辣根过氧化物酶（HRP），分别检测是否成功偶联，接着以包被亲和素（Avidin）的ELISA孔板，以偶联生物素的抗体为捕获抗体，偶联HRP标记的抗体为检测抗体，对一定量的蛋白药物进行ELISA检测，考察检测信号，并从中筛选出能够用于ELISA检测用的6组抗体对（Mab1-B,Mab6-H）、(Mab2-B,Mab7-H)、(Mab2-B,Mab8-H)、(Mab3-B,Mab6-H)、(Mab4-B,Mab1-H)、（Mab5-B,Mab6-H）。
步骤二：待筛选抗体是否能够阻断蛋白药物与作用靶点的结合：对步骤一中筛选得到的5组抗体对，共8个单抗是否具有阻断蛋白药物与作用靶点结合的性质进行考察。取包被有羊抗鼠IgG的ELISA板，分别加入8个特异性单抗与羊抗鼠IgG偶联，并对ELISA板未偶联蛋白的区域用BSA（牛血清白蛋白）封闭。接着加入标记有辣根过氧化物酶（HRP）的蛋白药物和一定量的该蛋白药物作用的目标细胞因子，此时偶联在ELISA板上的特异性待筛选单抗以及目标细胞因子与带HRP标记的蛋白药物竞争性结合，如果待筛选单抗能够阻断蛋白药物和靶点的相互作用，则与待筛选单抗结合的蛋白药物就较少，相对于没有加入目标细胞因子的检测信号则较低。结果见表1，“+”越多则代表相对于没有加入目标细胞因子的情况下，HRP检测信号越强。可以发现Mab8对应的相对检测结果的信号值较强，说明它并不能阻断蛋白药物与靶点的结合，并不是特异性的针对蛋白药物与靶点的结合表位，不适合用于蛋白药物的药代动力学研究。排除抗体对(Mab2-B,Mab8-H)进行下一轮的筛选。
表1待筛选抗体竞争性ELISA检测
| 待筛选特异性抗体 | 检测结果 |
| Mab1 | - |
| Mab2 | - |
| Mab3 | - |
| Mab4 | - |
| Mab5 | - |
| Mab6 | - |
| Mab7 | - |
| Mab8 | + |
步骤三：进一步确认待筛选抗体对是针对蛋白药物与靶点的结合表位进行识别并检测。对单克隆抗体类药物而言，与靶点的特异性结合部分位于Fab区域的可变区，将单抗药物用木瓜蛋白酶酶切可以得到单抗药物的Fab肽段。利用待筛选的5组抗体对（Mab1-B,Mab6-H）、(Mab2-B,Mab7-H)、(Mab3-B,Mab6-H)、(Mab4-B,Mab1-H)、（Mab5-B,Mab6-H），取包被亲和素的ELISA板，对系列浓度的Fab肽段进行ELISA定量检测，考察方法的检测下限和检测范围。结果见表2，根据“+”的数量表示检测结果的相对优劣。可以发现尽管待筛选的5组抗体对均能阻断单抗药物与靶点的结合，但它们在检测Fab肽段时是有区别的，基于抗体对(Mab3-B,Mab6-H)和（Mab5-B,Mab6-H）所构建的ELISA夹心法有较优的检测下限和检测范围，进一步确证了这2组抗体很可能均针对单抗药物Fab肽段的可变区，并且与该区域具有较大亲和力。
表2抗体对单抗药物Fab肽段检测考察（Buffer）
步骤四：基质筛选及结果确证：针对该单抗药物的临床药代动力学研究的主要检测样本是人血清，之前的筛选过程都是在常规Buffer的基质中进行的，我们需要对抗体对在人血清中的检测情况进行考察。同样利用上述待筛选的5组抗体对(Mab1-B,Mab6-H)、(Mab2-B,Mab7-H)、(Mab3-B,Mab6-H)、(Mab4-B,Mab1-H)、(Mab5-B,Mab6-H)，取包被亲和素的ELSIA板，在正常人血清的基质中，检测系列浓度的单抗药物，考察ELISA夹心法的检测范围和检测下限。结果见表3，根据“+”的数量表示检测结果的相对优劣。通过步骤三，能够筛选到特异性针对单抗药物与作用靶点结合位点的抗体对，因其特异性较强，更能够克服复杂基质以及结构类似物存在的情况下对检测信号的干扰。从表3结果可以发现经过步骤三单抗药物Fab肽段筛选的抗体对的相对优劣与它们在复杂基质中应用的相对优劣是基本一致的，该结果验证了实验设计。然而，该基质筛选步骤也是不可或缺的，抗体对(Mab5-B,Mab6-H)尽管在Buffer中能够顺利的检测单抗药物Fab肽段，但它在血清中却无法完成对目标单抗药物的检测，这很可能是受到血清中某些结构类似物复杂成分的干扰造成的。因此，通过步骤四，我们最终从6组潜在能够用于单抗药物ELISA夹心法方法开发的抗体对，筛选得到了能够在复杂基质中完成对目标单抗药物定量分析的抗体对(Mab3-B,Mab6-H)，在血清中的检测下限的数量级达到了100ng。该抗体对很可能针对单抗药物与作用靶点的结合位点，能够满足临床血清样本的药代动力学研究检测需求。
表3抗体对单抗药物检测考察（正常人血清）
由上述实施例可以看出，在蛋白药物药代动力学研究ELISA检测用特异性抗体对的筛选过程中，为了克服可能存在的复杂基质环境以及结构类似物的影响，在传统ELISA夹心法抗体对筛选的基础上，我们需要系统的进一步确认待筛选抗体对的特异性，是否针对蛋白药物上与作用靶点相互作用的结合表位，与此同时还要筛选出在不同基质条件下具有高亲和力的抗体对，使方法在不同基质条件下均具有较优的检测下限和检测范围。
综上所述，本发明建立了一种针对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，利用该方法在常规ELISA夹心法抗体对筛选的基础上，进一步考察抗体对的特异性，克服复杂基质以及结构类似物的干扰。基于该方法筛选抗体对所建立的ELISA夹心法在复杂基质条件下具有较优的检测范围和检测限，能够满足多肽类、融合蛋白、单克隆抗体等蛋白药物的临床前或临床药代动力学研究。
本方法能够比较全面、系统、高效的对蛋白药物药代动力学研究的ELISA检测用特异性抗体对进行筛选，筛选得到的捕获抗体分子和检测抗体分子是特异性的针对蛋白药物与作用靶点的结合位点，能够阻断蛋白药物与作用靶点的结合，且不受各种基质环境的影响。基于该抗体对建立的ELISA夹心法在不同基质环境下反应，均具有较优的检测范围和检测限，能够满足针对不同多肽类、融合蛋白、单克隆抗体等生物蛋白药物的临床前及临床药代动力学研究的检测需求。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (7)
1.一种针对蛋白药物的ELISA检测用特异性抗体对的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：初步筛选能够用于ELISA夹心法检测蛋白药物的抗体对，包括捕获抗体和检测抗体；
步骤二：经过第一次检测确认所述的捕获抗体和所述的检测抗体能够阻断蛋白药物与其作用靶点的结合；
步骤三：经过第二次检测确认所述的捕获抗体和所述的检测抗体是针对蛋白药物与其作用靶点的结合表位；
步骤四：经过第三次检测确认利用所述的捕获抗体和所述的检测抗体对建立ELISA夹心法能用于不同基质中的样品检测。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的ELISA夹心法检测的过程包括固相反应和液相反应。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的蛋白药物包括单克隆抗体药物、融合蛋白或多肽类药物。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的抗体对为针对蛋白药物的单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的第一次检测的过程包括竞争性ELISA检测。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的不同基质包括盐离子缓冲液、培养基、动物血清、尿液以及唾液。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述的动物血清包括人血清。
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