CN102352404A

CN102352404A - 一种评价her2靶位治疗药物及手段的体外检测方法

Info

Publication number: CN102352404A
Application number: CN2011102546308A
Authority: CN
Inventors: 吕品; 王少雄; 刘培培; 裘莉娟
Original assignee: GENOR BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: GENOR BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-08-31
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法。本发明公开了一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，其能够快速、准确、高效的对针对HER2靶位治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性进行检测，该方法专属性好、特异性强、准确性高，活性测定范围达到50％-150％；精密度高，重复性，日间差以及人员操作误差RSD均小于10％，并且双复孔的CV％小于10％，4参数拟合的拟合常数R²均大于0.98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对HER2靶位、抑制肿瘤细胞生长活性的治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。

Description

一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法。

背景技术

乳腺癌具有高发病率和高致命性，是女性最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内，每年约有超过1200万的女性被确诊患有乳腺癌，严重影响着女性的健康生活。目前治疗乳腺癌仍主要依赖放疗和化疗，毒副作用较大，并且特异性差，易产生并发症状。随着乳腺癌发病理论研究的不断深入，研究人员发现乳腺癌其实是某些与细胞增殖相关的原癌基因发生突变所导致的一种复杂分子疾病。而人表皮生长因子受体2(HER2)则是公认的与乳腺癌发病密切相关的原癌基因之一。研究表明，约25％-30％乳腺癌患者的癌细胞存在HER2的过度表达，而它的过量表达能够不断与人表皮生长因子受体家族的其他成员如HER1，HER3形成异源二聚体，通过磷酸化作用激活各种下游信号转导途径如MAPK，P13K/AKT/mTOR等，从而引起一系列的细胞反应包括促血管生成，抗凋亡，促细胞生长等，使癌细胞一直处于失控的持续增殖状态之中。基于此，HER2是研究治疗和诊断乳腺癌的一个最重要的靶分子，而围绕该靶分子所开发出的包括单克隆抗体，激酶抑制剂，反义寡核苷酸等生物治疗药物及手段也因其高效，特异性强和毒副作用较小等特点迅速引起了研究人员的高度重视和大量投入。此外，HER2的高表达在宫颈癌细胞中同样存在，因此该靶点也是研究治疗和诊断宫颈癌的重要突破口之一。

在生物治疗药物及手段的开发过程中，为了便于大量具有生物活性治疗药物及手段的筛选，研究人员需要通过一种快速，高效的检测手段能够准确的评价候选治疗药物及手段的生物活性，效果及其稳定性。这种方法必须满足下列几个条件：首先该法最好是体外实验，基于细胞水平，如增殖抑制，ADCC，CDC等，或基于酶促反应；其次，该方法的实验机理与药物及手段在体内的作用机理应尽可能一致，通过体外实验能够真实的反应该治疗药物及手段在体内作用的疗效，包括在细胞系的选择上也应尽量与真实病患情况接近；第三，该法必须通过方法验证，满足方法专属性，准确性，精密度以及耐用性等方面的要求，如针对同一样品检测的重复性，日间差，人员操作误差等结果的RSD应该满足小于10％。在此基础上，才能保证生物活性检测结果的可靠，并用于指导治疗药物及手段筛选工作。最后，在相同的实验条件下，该方法越简单，操作步骤越少越好，因为这样的方法更加灵活，更有利于推广，并且适用于高通量工作。

以基于靶分子HER2进行生物治疗药物及手段研发为例，关于该原癌基因的作用机制已经逐渐阐明。乳腺癌细胞过量表达HER2，随之通过一系列级联反应，并最终处于失控的持续增殖状态中。根据实验设计作用机理一致性原则，研究人员通常利用该治疗药物及手段对高表达HER2细胞的体外增殖抑制作用来评价其生物活性及效果。常用的高表达HER2的细胞系主要是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3和人乳腺导管癌细胞BT-474。然而到目前为止，从文献报道来看，该增殖抑制的细胞学活性方法并未得到公认或标准化，例如细胞系的选择，细胞铺板密度，治疗药物及手段作用时间，显色时间以及显色方式等都各不相同。更重要的是，在已经报道的增殖抑制活性方法中，也缺乏对检测体系专属性，准确性，重复性等方面的相关评价，包括对实验结果的评价方式也存在不同，难以保证检测结果的稳定性与可靠性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上存在的问题与不足，提供一种在评价HER2靶位治疗药物及手段过程中，对具有生物活性治疗药物及手段进行筛选以及稳定性评价的细胞增殖抑制生物活性检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性，准确性，精密度包括重复性，日间差，人员操作误差，以及耐用性等方面的要求，能够对大量生物活性治疗药物及手段进行快速，准确，高通量的筛选，满足治疗药物及手段在研发过程中的需求。。

为此，本发明公开了一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤：

a 取对数生长期表达HER2的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整至合适的活细胞密度为n×10⁵个/ml，n＝1-3，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔被加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养过夜；

b 取对照品及待测样品，用完全培养基进行系列梯度稀释，得到系列稀释浓度的对照品及待测样品；

c 取步骤a的细胞培养板，除去上清。

d 将系列稀释浓度的对照品及待测样品依次等体积加入步骤a所述细胞培养板不同孔中，空白对照孔则加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72-74h；

e 采用检测活细胞或死细胞量的检测体系对细胞培养板进行显色反应；

f 显色反应完成后，测定显色反应的结果，并根据测定结果计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性。

本发明术语“对照品”是指已公知其对表达HER2的细胞表现出细胞增殖抑制作用活性的化合物或组合物。

在一些实施例中，所述及HER2靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合，其中优选为单克隆抗体。

在一些实施例中，所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3或人乳腺导管癌细胞BT-474，其中优选人乳腺导管癌细胞BT-474。BT-474细胞相对SK-BR-3细胞而言，对针对HER2的单克隆抗体治疗药物及手段更加敏感，治疗药物及手段对其细胞增殖抑制作用更强，这有利于扩大方法对不同活性治疗药物及手段的筛选范围。

在一些实施例中，所述完全培养基是含10％FBS的RPMI1640完全培养基；

在一些实施例中，所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。

在一些实施例中，在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。

在一些实施例中，所述四唑类化合物为MTT、MTS、CCK-8，其中优选为CCK-8。相对于其他四唑类化合物如MTT，MTS而言，CCK-8所形成的还原显色物质可直接溶于水相，无需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，检测灵敏度也较高。

在一些实施例中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，以便于高通量地进行药物评价。

本发明能够快速，准确，高效的对针对HER2靶位治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性进行检测。该方法专属性好，特异性强，准确性高，测定活性范围达到50％-150％；精密度高，重复性，日间差以及人员操作误差RSD均小于10％，并且双复孔的CV％小于10％，4参数拟合的拟合常数R²均大于0.98。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，便于推广以及高通量操作，完全能够满足其在进行具有针对HER2靶位，抑制肿瘤细胞生长，具有生物活性治疗药物及手段的筛选及其稳定性评价的需要。

附图说明

图1Herceptin及参考品4参数拟合图。

图2参考品及Avastin4参数拟合图。

图3细胞铺板后直接加药条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

图4加药后细胞孵育24h条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

图5加药后细胞孵育48h条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

图6加药后细胞孵育96h条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

图7MTT显色条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

图8AlamarBlue显色条件下Herceptin及参考品4参数拟合图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

一、材料和试剂

材料：针对HER2靶位单克隆抗体药物Herceptin(产于Roche，批号：B3403)，针对HER2靶位单克隆抗体药物参考品(嘉和生物药业制备)，针对HER2靶位单克隆抗体药物待测样品(嘉和生物药业制备)，不针对HER2靶位的单克隆抗体药物Avastin(产于Roche，批号：B9005B02)。

试剂：染色液CCK-8(Dojindo，Cat.No.CK04-20)，RPMI1640培养基粉末(GIBCO，Cat.No.31800-022)，链霉素/青霉素双抗(GIBCO，Cat.No.15070-063)，胰蛋白酶(GIBCO，Cat.No.25200-07)，FBS(GIBCO，Cat.No.10099-141)，MTT粉末(Sigma，Cat.No.M2128)，AlamarBlue(Invitrogen，Ca t.No.DAL1100)。

溶液配制：

RPMI1640培养基：取1000ml烧杯，倒入RPMI 1640培养基粉末1袋，碳酸氢钠2.0g，加入约900ml超纯水，避光磁力搅拌直至溶解，用稀盐酸调pH值至7.00±0.05，将溶液倒入量筒，定容至1000ml，经0.22μm滤膜无菌过滤即得，分装后4℃避光保存。

RPMI1640完全培养基：量取胎牛血清(FBS)50ml，加RPMI 1640培养基445ml，再加入链霉素/青霉素双抗5ml，即得，4℃避光保存。

细胞株：SK-BR-3细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCHu49)，BT-474细胞株(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCHu143)

二、检测方法步骤

1)细胞铺板：取对数生长期的BT-474细胞经胰蛋白酶消化后用RPMI1640完全培养基制成单细胞悬液。计数，并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度至1.0-3.0×10⁵个/ml，以100μl/孔加入96孔细胞培养板中。空白对照孔则以100μl/孔加入RPMI1640完全培养基。完成后将细胞培养板置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24-26h，使细胞贴壁。

2)参考品及待测样品稀释：取对照品及待测样品，根据标示浓度，用RPMI1640完全培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度。

3)加样：取贴壁后的细胞培养板，除去上清。接着将稀释好的系列稀释浓度的对照品及待测样品以100μl/孔依次加入铺好细胞的细胞培养板中，空白对照孔则以100μl/孔加入完全培养基，2-3复孔。完成后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养72-74h。

4)显色：采用CCK-8显色体系分别对细胞培养板中对照品孔，待测样品孔，空白对照孔中以10μl/孔加入CCK-8。完成后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续孵育2-4h。

5)读数：取出细胞培养板混匀，放入酶标仪，以650nm为参比波长，在450nm下测定对照品孔，待测样品孔及空白对照孔的OD_450-650，记录测定结果。

6)结果分析：扣除空白对照孔的OD值后，分别用对照品孔和待测样品孔OD值与加药浓度的量效关系进行4参数拟合，确定对照品与待测样品的EC₅₀值，曲线拟合常数R²，复孔CV％。按照下列公式计算待测样品的细胞增殖抑制生物活性：

实施例1 评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法

以参考品和Herceptin为材料，Herceptin作为对照品，用RPMI1640完全培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度，采用上述检测方法步骤考察参考品相对Herceptin的生物学活性。

结果如图1所示，Herceptin及参考品4参数拟合情况良好，曲线拟合常数R²均满足＞0.98，不同加药稀释浓度下3复孔检测OD值的CV％均满足＜10％。通过与Herceptin EC₅₀值的比较，参考品的细胞增殖抑制生物活性为97％。

实施例2 专属性评价试验

以Avastin和参考品(同实施例1)为材料，用RPMI1640完全培养基稀释至合适浓度，在新的96孔细胞培养板中做2倍系列梯度稀释，得到11个稀释度，采用上述检测方法步骤检测其增殖抑制活性。

结果如图2，将该方法应用于Avastin时，尽管不同加药稀释浓度下3复孔检测OD值的CV％均满足＜10％，但无法对结果进行4参数拟合，该药物并不能对高表达HER2的人乳腺导管癌细胞BT-474的增殖产生抑制作用。相对的，参考品的检测结果则能够正常进行4参数拟合，同时满足拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％＜10％。该实验结果表明，本发明所述方法具有特异性。

实施例3 准确性评价试验

以参考品(同实施例1)为材料，用RPMI1640完全培养基将其稀释成效价水平分别为50％，75％，100％，125％，150％的待测样品，3名实验人员(Analyst1、2、3)各自独立的采用上述检测方法步骤对这5个待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测。

结果如表1，对效价水平分别为50％，75％，100％，125％，150％的5个待测样品，3名不同实验人员利用本发明方法对这些样品的检测结果均满足参考品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％均满足＜10％，并且不同人员对不同效价水平的实测值相对于理论值的平均偏差均满足＜5％。这说明在检测针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时，本发明方法对活性范围在50％-150％内待测样品，能够达到准确性要求。

表1.针对HER2靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测准确性评价结果汇总表

实施例4 精密度评价试验

以参考品(同实施例1)及待测样品为材料，对本发明所述方法的精密度进行评价。首先由1名实验人员采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测，平行实验6次，考察方法的重复性，接着由1名实验人员在不同的3天内采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测，考察方法的日间差，最后由3名实验人员(Analyst1、2、3)采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测，考察方法的人员操作误差。

如表2，利用上述检测方法，由1名实验人员对同一待测样品进行6次平行检测，结果均满足参考品和待测样品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％均满足＜10％，并且6次检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时，本发明方法的重复性能够达到精密度要求。

如表3，由1名实验人员在不同的3天内对同一待测样品进行平行检测，结果均满足参考品和待测样品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％均满足＜10％，并且3次检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时，本发明方法的日间差能够达到精密度要求。

如表4，由3名实验人员对同一待测样品进行平行检测，结果均满足参考品和待测样品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％均满足＜10％，并且3次检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时，本发明方法的人员操作误差能够达到精密度要求。

表2.针对HER2靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测重复性评价结果汇总表

表3.针对HER2靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测日间差评价结果汇总表

表4.针对HER2靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测人员操作误差评价结果汇总表

实施例5 耐用性评价试验

以参考品(同实施例1)及待测样品为材料，选择不同细胞代次(10、19、29、40)的BT-474细胞，采用上述检测方法步骤对同一待测样品进行细胞增殖抑制生物活性检测。

表5.针对HER2靶位单克隆抗体药物细胞增殖抑制生物活性检测耐用性(细胞代次)评价结果汇总表

如表5，使用不同细胞代次的BT-474细胞，利用该检测方法对同一待测样品进行检测，结果均满足参考品和待测样品的4参数拟合曲线的拟合常数R²＞0.98，3复孔的CV％均满足＜10％，并且不同细胞代次条件下(40代以内)，同一待测样品检测结果的RSD满足＜10％，说明在检测针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性时，本发明方法能够达到耐用性对细胞代次的要求。

实施例6 不同加药时间的影响

以参考品(同实施例1)和Herceptin为材料，步骤和条件同实施例1，只对加药时间进行调整，调整包括2个方面：

BT-474细胞铺板结束后，随即进行样品稀释，并按照调整前的方案进行加样；

加样结束后，将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养72-74h，接着向各个样品孔以及空白对照孔中以20μl/孔加入CCK-8，并完成后续读数检测。

按照调整后的步骤，考察参考品相对Herceptin的生物学活性，结果见图3。在这种实验条件下，复孔间的CV％值相对较大，曲线拟合R²＜0.98，并且药物对细胞的最大增殖抑制率仅为约40％，药物对细胞的增殖抑制作用并未完全表现，细胞与药物的相互作用并未处于稳定状态，该方法无法对样品的生物学活性进行准确判断。此外，拟合曲线的斜率较大，也容易产生波动。因此，在实际应用过程中，应该待细胞铺板生长过夜后，再进行后续加药并完成检测。

实施例7 加药后不同细胞孵育时间的影响。

以参考品(同实施例1)和Herceptin为材料，在完成BT-474细胞铺板以及加药操作后，选择不同的细胞孵育时间(24h，48h，96h)，采用上述检测方法步骤考察参考品相对Herceptin的生物学活性。

加药后细胞孵育24h时的检测结果见图4。可以发现在这种实验条件下，由于药物作用时间较短，药物对细胞的最大细胞增殖抑制率仅为24％，药物对细胞的增殖抑制作用并未完全表现，无法对药物的生物学活性进行准确判断。

加药后细胞孵育48h时的检测结果见图5。可以发现在这种实验条件下，由于药物作用时间较短，药物对细胞的最大细胞增殖抑制率仅为37％，药物对细胞的增殖抑制作用并未完全表现，无法对药物的生物学活性进行准确判断。

加药后细胞孵育96h时的检测结果见图6。可以发现在这种实验条件下，由于药物作用时间较长，药物浓度差异引起的药效差异逐渐变小，导致拟合曲线的斜率较大(接近3)，线性范围内的样品点较少，这种情况下的线性拟合容易产生偏差，难以对药物的生物学活性进行准确判断。此外孵育时间过长还将增加时间成本。

而在加药后细胞孵育时间在72-74h时(图1)除了能够满足复孔CV％，曲线拟合R²之外，还能控制时间成本，并保证药物与细胞完全作用(最大细胞增殖抑制率约50％)的同时，控制曲线拟合的斜率。

实施例8 不同显色方式的影响

以参考品(同实施例1)和Herceptin为材料，除了显色步骤外其他同实施例1，采用不同的显色方法(MTT/AlamarBlue)完成对参考品相对Herceptin生物学活性的考察。

MTT显色方法：向各个样品孔以及空白对照孔中以100μl/孔加入MTT的PBS水溶液(0.5mg/ml)。完成后将细胞培养板放置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续孵育3h。接着小心吸去细胞培养板中的上清，再以150μl/孔加入DMSO(0.22μm过滤)，轻轻振荡混匀，30mi n后，显色物完全溶解，将细胞培养板放入酶标仪，在590nm下测定各个样品孔及空白对照孔的OD₅₉₀，记录测定结果。

AlamarBlue显色方法：与上述CCK-8法完全一致，只是在酶标仪上读板时，设置544nm处激发，检测590nm发射波长下的荧光强度。

利用MTT法检测结果见图7。该显色方法步骤繁琐，并且存在样品点3复孔的CV％超过10％，并且曲线拟合R²＜0.98，相对CCK-8显色方法而言，该显色方式稳定性较差。

利用AlamarBlue法检测结果见图8。该显色方法步骤简单，但在相同显色时间条件下，存在样品点3复孔的CV％超过10％，并且曲线拟合R²＜0.98，相对CCK-8显色方法而言，该显色方式稳定性较差。

由此，为了保证本发明方法的稳定性与可靠性，我们最终确定利用CCK-8显色方式来进行活细胞数的定量分析。

综上所述，本发明建立了一种针对HER2靶位生物治疗药物及手段的细胞增殖抑制生物活性检测方法，该方法快速，高效，易推广，适合高通量作业，通过对方法专属性，准确度，精密度以及耐用性等多方面验证和考察证实了该发明方法具有稳定性强，适用性好等特点，能够满足针对HER2靶位生物治疗药物及手段的研发过程中，对具有细胞增殖抑制生物活性物质的筛选以及稳定性评价。

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种评价HER2靶位治疗药物及手段的体外检测方法，包括下列步骤：

a 取对数生长期表达HER2的细胞经酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，计数并计算细胞密度及活率，调整活细胞密度为n×10⁵个/ml，将细胞悬液等体积加入细胞培养板孔中，同时设立空白对照孔，空白对照孔被加入等体积完全培养基，然后将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养过夜；

c 取步骤a的细胞培养板，除去上清。

d 将系列稀释浓度的对照品及待测样品以等体积依次加入步骤a所述细胞培养板孔中，空白对照孔则加入等体积的完全培养基，然后将细胞培养板放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养72-74h；

2.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述HER2靶位治疗药物是单克隆抗体、激酶抑制剂、反义寡核苷酸、化合物、中药提取物或中药复方提取物中之一或它们的任何组合。

3.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述n＝1-3。

4.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺腺癌细胞SK-BR-3或人乳腺导管癌细胞BT-474。

5.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述对数生长期表达HER2的细胞是人乳腺导管癌细胞BT-474。

6.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述完全培养基是含10％FBS的RPMI1640完全培养基。

7.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述系列梯度稀释是2倍系列梯度稀释。

8.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于在步骤e中，所述检测活细胞或死细胞量的检测体系包括四唑类化合物氧化还原检测体系、ATP总量检测体系或LDH释放量检测体系等。

9.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述四唑类化合物为MTT、MTS或CCK-8。

10.如权利要求1所述的体外检测方法，其特征在于所述细胞培养板为96孔细胞培养板。