CN103926358A

CN103926358A - 一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法

Info

Publication number: CN103926358A
Application number: CN201410097432.9A
Authority: CN
Inventors: 阳海; 张帆; 刘华杰; 曾健; 易兵
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2014-03-17
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明公开了一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法，首先借助光催化技术过程中产生的ROSs模拟水体环境中自由基离子对有机农药进行降解，然后利用现代分离分析技术，对其降解中间产物进行分离和鉴定，再利用理论计算中前线轨道理论对ROSs和有机农药的反应活性位点进行预测，并结合可能降解产物活化能大小的计算，从而得到水体环境中浓度相对较低的有机农药的代谢产物和降解途径。

Description

一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法

技术领域

本发明属于环境保护领域，具体而言，涉及一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法。

背景技术

残留在水体环境中的有机农药的浓度相对较低、代谢途径复杂，因此，难以捕捉有机农药在水体环境中的代谢产物、并且难以分析其代谢途径，而这些有机农药的代谢产物对水生生态系统和人类健康存在危害。

因此，如何弄清楚残留在水体环境中有机农药的代谢产物以及代谢途径，从而为进一步探索这些代谢产物的生态毒理作用是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。

本发明涉及一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）配置浓度在50-500μM芳香性农药的水溶液，取适量的体积的芳香性水溶液于光催化反应装置内，然后加入0.2-5.0g/L的P25TiO₂催化剂，制得悬浮液；继续搅拌10-60min，使其达到吸附-脱附平衡；打开高压汞灯，在预先设定的时间间隔中取出少量的悬浮液体，过0.2μm滤膜，备用分析；

（2）在Cometro6000系列的HPLC(kromasilC18,250×4.6mm,5μm)上完成分析，流动相A(CH₃OH):B(纯水)=20:80-80:20(v/v),柱温为23-30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL；从而得在不同光催化时间芳香胺类农药的峰面积。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的光催化反应装置为：10-1000W 主波长在200-400nm的紫外灯为光源，容器为30-300mL的双层派瑞克玻璃，紫外灯与反应器平行放置；紫外灯和光催化反应容器两者的距离保持在10-50cm，使得达到光催化反应容器表面的光强约为0.02-1.40mW/cm²，并通过循环水冷却保持反应器恒温在0-50℃。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述的芳香性农药选自苯胺类、取代脲类、三嗪类和硝基苯类；优选地，苯胺类农药选自甲草胺（AL），乙草胺（AC），毒草胺（PR），丁草胺（BU）和异丙草胺（ME），其结构式为：

在本发明的另一个优选实施方式中，依据HPLC分析结果，利用Langmuir-Hinshelwood动力学模型对芳香胺类农药光催化降解过程进行模拟。

在本发明的一个优选实施方式中，苯胺类的代谢途径包括羟基化、醚键的断裂和氯乙酰胺基的断裂步骤。

通过本发明的方法，可以弄清楚芳香性农药在水体环境中活性氧物种作用下的代谢产物以及代谢途径，从而为芳香性农药在水体环境中迁移转化规律及其环境影响评价提供理论依据。

附图说明：

图1：100μmol/L甲草胺(AR)，乙草胺(AC)，毒草胺(PR)，丁草胺(BU)和异丙草胺(ME)在催化剂TiO₂用量为1.0g/L时的光催化降解曲线；内图：光催化降解过程中-ln(C/C₀)对时间作图。

图2：100μmol/L甲草胺(AR)，乙草胺(AC)，毒草胺(PR)，丁草胺(BU)和异丙草胺(ME)在催化剂TiO₂用量为1.0g/L时暗吸附量的比较。

图3：Gaussian体系B3LYP/6-31+G(d,p)基组对毒草胺吸氢反应、取代反应和加成反应的相对能量变化图。

图4：甲草胺(AR)，乙草胺(AC)，毒草胺(PR)，丁草胺(BU)和异丙草胺(ME)光催化降解60分钟时的降解产物HPLC分布图。

具体实施方式：

实施例1：

1.光催化反应装置：10-1000W主波长在200-400nm的紫外灯为光源，容器为30-300mL的双层派瑞克玻璃，紫外灯与反应器平行放置。紫外灯和光催化反应容器两者的距离保持在10-50cm，使得达到光催化反应容器表面的光强约为0.02-1.40mW/cm²，并通过循环水冷却保持反应器恒温在0-50℃。

2.配置浓度在50-500μM芳香性农药的水溶液，取适量的体积的芳香性水溶液于光催化反应仪的容器内，然后加入0.2-5.0g/L的P25TiO2催化剂，制得悬浮液。继续搅拌10-60min，使其达到吸附-脱附平衡。打开高压汞灯，在预先设定的时间间隔中取出少量的悬浮液体，过0.2μm滤膜，备用分析。

3.芳香性农药包括四类：苯胺类、取代脲类、三嗪类和硝基苯类；

其中苯胺类农药包括甲草胺（AL），乙草胺（AC），毒草胺（PR），丁草胺（BU）和异丙草胺（ME），其结构通式为：

4.芳香胺类农药的光催化降解动力学分析是在Cometro6000系列的HPLC(kromasilC18,250×4.6mm,5μm)上完成，流动相A(CH₃OH):B(纯水)=20:80-80:20(v/v),柱温为23-30℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL；从而得在不同光催化时间芳香胺类农药的峰面积。

芳香胺类农药降解动力学的比较研究，利用Langmuir-Hinshelwood动力学模型对芳香胺类农药光催化降解过程进行模拟。

芳香胺类农药光催化降解速率方程可表示为：

r=-dc/dt=kKC/(1+KC) (1)

芳香胺类农药浓度为微摩尔级（μM），反应浓度很低，因此可以忽略KC(KC<<1)，所以由方程(2)可以得到假一级动力学方程表达式：

r=-dc/dt=kKC=k₁C (2)

对方程(3)两边同时积分得到：

ln(C/C₀)=-k₁t+常数 (3)

式中：

r-------总反应速率

t-------光催化降解时间

k------内反应速率常数

C------光催化降解过程中芳香胺类农药的浓度

C₀------芳香胺类农药初始浓度

K------Langmuir常数

k₁------假一级动力学常数

根据方程(3)，利用ln(C/C₀)对反应时间作图，所得直线的斜率即该化合物降解数率常数，从确定ROSs物种对水体环境有机农药降解速率的快慢，结果如图1所示。

以苯胺类农药为例：初始浓度为100μM的苯胺类除草剂在1.0g/L的TiO2下，经过90分钟的光催化降解均能基本去除。AL,AC,BU,PR和ME对应的降解动力学常数分别为0.115min^-1,0.087min^-1,0.067min^-1,0.058min^-1and0.080min^-1。因此，这五种苯胺类除草剂的降解动力学常数大小为：AL﹥AC﹥ME﹥BU﹥PR。

这五个苯胺类农药具有不同的光催化降解速率常数，可能是由于其具有不同的取代基团。这五个化合物都具有相同的氯乙酰苯胺结构，然而与N原子相连的醚键和苯环上连接的烷基却不一样。而这些不同的基团能进一步的影响这些苯胺类除草剂在光催化剂表面的吸附，从而导致了这些化合物不同的光催化降解速率。为了确认上述结构，五个苯胺类除草剂在光催化剂表面的吸附做了一组对比实验，结果如图2。从图中可以看出ME在光催化剂表面的吸附量要明显小于其它四种苯胺类除草剂，这是因为在ME分子与N原子相连的是异丙基而不是醚键并且苯环上也不存在其它的取代基。因此，我们可以得出极性基团相对于非极性基团可能更容易吸附在光催化剂表面。

5.芳香胺类农药前线电子云密度的量子化学计算是在Gaussian03软件上完成，首先在B3LYP/6-31G(d)水平上对其结构进行全优化和频率分析以确保最稳定构型，然后在HF/3-21下做轨道布局分析，通过福井谦一的前线轨道理论计算出每个原子的前线电子云密度，所有的计算均在单机上完成。根据前线轨道理论，具有2FED² _HOMO最大值的原子最容易在光生空穴的作用下丢失电子而发生氧化反应，具有2FED_LUMO ²最大值的原子容易受光生电子的攻击而发生还原反应，具有FED_HOMO ²+FED_LUMO ²最大值的原子则最容易被羟基自由基攻击而发生自由基反应。

以苯胺类化合物为例：

在研究活性氧物种与苯胺类除草剂反应活性位点前，我们首先运用前线轨道理论对反应活性位点进行了预测，结果如表1。从表中可以看出5个苯胺类除草剂的C3和C6具有较大的FED_HOMO ²+FED_LUMO ²值。其中AL,AC,BU,PR和ME分子中C3的FED_HOMO ²+FED_LUMO ²值分别为0.3654,0.3654,0.3591,0.3691和0.4599，C6的FED_HOMO ²+FED_LUMO ²值分别为0.3550,0.3551,0.3464,0.3504和0.5042。这就说明了苯环上和N原子直接相连的C原子及其对位容易和·OH发生自由基反应。基于表中2FED_HOMO ²的计算结果，我们可以看出N原子的邻对位容易受到光生空穴的攻击而发生亲核反应，然而光生空穴仅仅存在于光催化剂的表面。因此苯胺类除草剂要与光生空穴发生亲核反应，其必须先吸附在光催化剂的表面。所以我们对5个苯胺类除草剂的点电荷（PC）进行了研究。研究发现5个苯胺类除草剂呈现出相同的变化趋势：正电荷集中在C8原子上，而负电荷则更多出现在N7,O9以及醚键中的氧原子上。综上所述，5个苯胺类除草剂当中应该是氯乙酰基和醚基更容易吸附在光催化剂的表面，从而在光催化降解的初始阶段和光生空穴发生反应。

表1在G_aussi_an03中B3LYP/6-31G*基组下对五种苯胺类农药前线电子云密度和点电荷计算结果

6.芳香胺类农药主要光催化降解产物中间体过渡态的计算主要是通过Gaussian03软件完成。计算水平和计算方法的选择是根据计算精确度、计算方便性和计算经济性来选择的。首先降解中间产物反应物、产物和中间体过渡态等结构的优化是在没有任何对称性限制下通过B3LYP函数中的6-31++G(d,p)基组来完成，然后通过IRC路径分析确定中间产物过渡态寻找的正确性。在过渡态优化过程中用PCM模型模拟水溶液对芳香性农药和·OH的反应。

以苯胺类除草剂当中毒草胺和羟基自由基反应为例：

从上式可以看出毒草胺和·OH的反应途径主要分为11条，而这11条途径又主要分为三类:第一类为Cl原子的取代反应，即对应着Sub1；第二类对应着·OH的加成反应，即对应着Add1-5；第三类对应着H的提取反应，即对应着Abs1-5。而图3则给出了这11条反应途径的反应势能图。首先对于取代反应，具有最大的活化能，即410kJ/mol。这说明该反应不容易发生，然而生成物具有最低的能量这说明了该产物为热力学控制产物。其次我们探讨了5个加成反应的能量变化情况，Add1,Add3和Add5具有相似的活化能，然后Add2和Add4的反应活化能则分别为970kJ/mol和-20kJ/mol。这说明苯环上氨基的邻对位以及羰基中的C原子容易受到·OH的攻击而发生自由基反应，苯环上氨基的对位及其直接和N原子相连的C原子由于位阻和诱导效应而不容易发生加成反应。最后，我们对吸H反应进行了探讨。研究发现Abs1,Abs2和Abs3这3个吸H反应的活化能分别为45kJ/mol,41kJ/mol和27kJ/mol.这告诉我们苯环上H原子同样倾向于发生吸H反应，并对应的产物均有属于动力学控制产物。然而对于Abs4和Abs5两种反应由于具有相对较大的活化能，因此该反应难以发生。通过比较上述3种反应的活化能大小及其生成产物的稳定程度，可以得出由吸H反应和加成反应所得到的产物属于动力学控制产物，而由取代反应得到的产物属于热力学控制产物。

7.芳香胺类农药光催化降解中间产物的鉴定是通过HPLC/MS/MS完成，岛津公司的液相色谱，配置kromasil色谱柱(kromasilC18,250×4.6mm,5μm)，LC-10AT泵，联用API4000质谱分析仪。其中流速0.5mL/min,50%A+50%B。质谱条件为：电子喷雾界面用作MS和MS-MS的测定，并采用正离子全扫描模式进行。其中碰撞电压根据不同的化合物而调整。其中ESI电压为2.5-7.5kV,sourceblock和desolvation温度分别为80-150℃和300-500℃，用高纯N₂做desolvation和nebulizer气体，流速设定为4-10L/min。高纯N₂同时也用做2000-3000mbar下的碰撞气体。

对五种苯胺类AL,AC,BU,PR和ME光催化降解中间产物首先运用HPLC/MS/MS进行了分离鉴定，其HPLC图谱如图4。从图中可以看出在AL的光催化降解过程中检测到了5个光催化降解中间产物，分别Al-I，Al-II，Al-III，Al-IV和Al-V，并且5个降解中间产物的极性均大于Al。同样，在Ac的降解过程检测到5个降解中间产物，分别为Ac-I，Ac-II，Ac-III，Ac-IV和Ac-V；在Bu的降解过程检测到4个降解中间产物，分别为Bu-I，Bu-II，Bu-III 和Bu-IV；在Pr的降解过程检测到4个降解中间产物，分别为Pr-I，Pr-II，Pr-III和Pr-IV；在Me的降解过程检测到4个降解中间产物，分别为Me-I，Me-II，Me-III和Me-IV。

接下来，我们对这5个苯胺类除草剂的光催化降解中间产物进行了MS-MS的鉴定，结果如表2：

首先苯胺类除草剂Al，在其母体化合物的质谱裂解碎片中，M:M+2约为3:1这说明该化合物中Cl原子的存在，而碎片238，162和90则可能是对应着[M+H⁺-OCH₃]⁺，[M+H⁺-CH₂OCH₃-COCH₂Cl]⁺和[C₆H₅NH₃]⁺。代谢中间产物Al-I和Al-II具有相同的m/z=285，对应着在母体化合物加上16个质量单元。因此，这两个化合物可能归结为单羟基取代产物。在代谢产物Al-II的裂解碎片中，同位素峰的存在暗示着该化合物中Cl原子的存在，而裂解碎片m/z=268，254，242则分别对应着[M+H-H₂O]⁺，[M+H-OCH₃]⁺和[M+H-CH₂OCH₃]⁺。但是对于降解中间产物Al-II中则没有找到更多的裂解碎片。降解中间产物Al-III则可能是2,6-二乙基苯胺，它是由于N原子上氯乙酰基和醚基的断裂而产生的。代谢产物Al-IV和Al-V分别具有m/z=226和m/z=194则可能分别对应N原子上醚键和氯乙酰键的断裂而形成的产物。

乙草胺和甲草胺都具有苯胺类除草剂核心结构氯乙酰基。在乙草胺的光催化降解过程中，我们检测到了Ac-I,Ac-II,Ac-III,Ac-IV和Ac-V等5个代谢产物。在除草剂Ac的质谱裂解碎片中，m/z=272和224分别对应着同位素峰和[M+H-CH₃CH₂O]⁺峰。而代谢产物Ac-I和Ac-II具有相同的分子离子峰为m/z=286，其对应着在Ac母体化合物上加16个质量单元，因此，这两个化合物可能对应着Ac单羟基化产物。代谢产物Ac-III的质谱裂解碎片中由于[M+H-CH₃O]⁺峰消失但是同位素峰仍然存在，所以推测该化合物可能是由于醚键的断裂而产生的。代谢产物Ac-IV则可能是对应芳香胺。在代谢产物Ac-V的质谱中，同位素峰明显消失而出现[M+H⁺-H₂O]⁺的裂解碎片。因此，该化合物可能是由于羟基自由基对N原子上侧链的攻击而产生的代谢产物。

接下来，对丁草胺的光催化过程中代谢产物进行了分析。丁草胺和甲草胺相比，两者的分子结构非常类似，苯环上具有两个相同乙基，而仅仅只是N原子上带有不同的醚键。同位素峰，以及m/z=286，276，258和238，对应着[M+H⁺-Cl]⁺，[M+H⁺-CH₃]⁺，[M+H⁺-C₄H₉Cl]⁺和[M+H⁺-COCH₂Cl]⁺碎片，均在丁草胺的质谱裂解碎片中检测到了。代谢产物Bu-I的m/z为327，其对应着丁草胺的羟基化产物。在它的质谱裂解碎片中，同位素峰的存在暗示着氯原子的存在，而碎片[M+H⁺-18]⁺则说明该化合物存在-OH。代谢产物Bu-II的m/z为228，在其质谱的裂解碎片中显示Cl原子的存在，因此该化合物可能是由于N原子上醚键的断裂而引起的。代谢产物Bu-III的m/z为180，在该化合物中Cl原子的信号消失，而偶数的分子离子峰则说明该化合物中存在奇数个N原子。并且该化合物的极性和母体化合物极性相比明显增大，所以该化合物可能是由于N原子上氯乙酰键的断裂以及醚键的部分断裂而造成。

毒草胺的分子结构和其它四种苯胺类除草剂的结构不同，N原子上异丙基代替了醚键，而氯乙酰苯胺和核心结果依然保留。在毒草胺的光催化降解过程中，我们检测到了Pr-I，Pr-II，Pr-III和Pr-IV等四种代谢产物。在毒草胺母体化合物的质谱裂解碎片中m/z=196，170和136，分别对应着[M+H-CH₃]⁺，[M+H-CH(CH₃)₂]⁺和[M+H-COCH₂Cl]⁺。代谢产物Pr-I的m/z为228，其可能对应着毒草胺的羟基化产物。在该化合物的质谱裂解碎片中，同位素的信号依然存在，并且也检测到了m/z=210，186和150，分别对应着[M+H-H₂O]⁺，[M+H-CH(CH₃)₂]⁺和[M+H-COCH₂Cl]⁺裂解碎片。代谢产物Pr-II的m/z为136，其可能是由于氯乙酰键的断裂而产生的。其质谱裂解碎片m/z=121和93，分别对应着[M+H-CH₃]⁺和[M+H-CH(CH₃)₂]⁺。代谢产物Pr-III的m/z为170，其可能对应着醚键的断裂而形成的氯乙酰苯胺产物，在其质谱的裂解碎片中，Cl原子以及芳香胺的信号依然存在。代谢产物Pr-VI的m/z为194，其可能是对应着毒草胺分子中氯原子被·OH所取代，这是因为在其分子裂解碎片中Cl原子的信号消失，而对应出现了[M+H-18]⁺碎片信息。

和乙草胺的分子结构非常的相似，异丙草胺具有氯乙酰苯胺的核心结构，并且在苯环上的取代烷基相同。异丙草胺光催化降解过程中，检测到了5种光催化降解中间产物。在异丙草胺的质谱裂解碎片中，m/z=286，284，252和206，分别对应着[M+H]⁺，[M+H+2]⁺，[M+H-CH₃O]⁺和[M+H-COCH₂Cl]⁺。代谢产物Me-I和Me-II具有相同的m/z为300，对应着在母体化合物上加16个质量单位。同位素碎片在这两个化合物中均被检测到，并且[M+H-18]⁺峰的出现暗示在这两个代谢产物中-OH基的存在。代谢产物Me-III和Me-IV的m/z分别为212和136。然而具有同样m/z的化合物在乙草胺的降解过程也被检测到。因此，Me-III可能对应着N原子上醚键的断裂产物，而Me-IV则对应N原子上氯乙酰键的进一步断裂而形成的芳香胺。代谢产物Me-V的m/z为282，在其质谱的裂解碎片中，Cl原子信号的消失以及[M+H-18]⁺信号的出现说明该化合物中-OH的存在。因此，该化合物可能是Cl被羟基自由基取代而生成的。

表2五种苯胺类除草剂及其在ROS_s作用下降解产物的分子离子峰和裂解碎片

8.通过结合对水体环境中有机农药与活性氧物种反应活性位点的预测结果和运用现代分离分析手段对其代谢产物的鉴定结果，对同一类农药在活性氧物种作用下的转化规律进行总结。

以苯胺类除草剂为例：

AL:R₁=C₂H₅;R₂=C₂H₅;R₃=CH₂OCH₃;AC:R₁=CH₃;R₂=C₂H₅;R₃=CH₂OCH₂CH₃;PR:R₁=H;R₂=H;R₃=CH(CH₃)₂;

BU:R₁=C₂H₅;R₂=C₂H₅;R₃=CH₂OCH₂CH₂CH₂CH₃;ME:R₁=CH₃;R₂=C₂H₅;R₃=CH(CH₃)CH₂OCH₃

通过比较上述5个苯胺类除草剂降解中间产物的鉴定，并结合上述理论计算的结果。对苯胺类除草剂在活性氧物种作用下转化的一般机制进行了总结，如上式。研究发现其代谢途径主要有三条：其一，羟基化。在这5个苯胺类除草剂的代谢过程，均检测到了羟基化产物，如在甲草胺代谢过程中检测到的m/z=285，在乙草胺代谢过程中检测到的m/z=300,在毒草胺代谢过程中检测到的m/z=227，在丁草胺代谢过程中检测到的m/z=327和在异丙草胺代谢过程中检测到的m/z=285等；其二，醚键的断裂。由醚键的断裂而直接形成氯乙酰苯胺化合物，如在甲草胺代谢过程中检测到的m/z=226,在乙草胺代谢过程中检测到的m/z=211,在毒草胺代谢过程中检测到的m/z=170,在丁草胺代谢过程中检测到的m/z=226和在异丙草胺代谢过程中检测到的m/z=212等；其三，氯乙酰胺基的断裂。如在甲草胺代谢过程中检测到的m/z=194，在毒草胺代谢过程中检测到的m/z=136和在丁草胺代谢过程中检测到的m/z=180等均是由于氯乙酰胺基的断裂而产生的。

以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种模拟水体环境中活性氧物种对芳香性农药转化机制的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）配置浓度在50-500μM芳香性农药的水溶液，取适量的体积的芳香性农药水溶液于光催化反应装置内，然后加入0.2-5.0g/L的P25TiO₂催化剂，制得悬浮液；继续搅拌10-60min，使其达到吸附-脱附平衡；打开高压汞灯，在预先设定的时间间隔中取出少量的悬浮液体，过0.2μm滤膜，备用分析；

2.根据权利要求1所述的方法，所述的光催化反应装置为：10-1000W主波长在200-400nm的紫外灯为光源，容器为30-300mL的双层派瑞克玻璃，紫外灯与反应器平行放置；紫外灯和光催化反应容器两者的距离保持在10-50cm，使得达到光催化反应容器表面的光强约为0.02-1.40mW/cm²，并通过循环水冷却保持反应器恒温在0-50℃。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的芳香性农药选自苯胺类、取代脲类、三嗪类和硝基苯类；优选地，苯胺类农药选自甲草胺（AL），乙草胺（AC），毒草胺（PR），丁草胺（BU）和异丙草胺（ME），其结构式为：

4.根据权利要求3所述的方法，依据HPLC分析结果，利用Langmuir-Hinshelwood动力学模型对芳香胺类农药光催化降解过程进行模拟。

5.根据权利要求3或4所述的方法，苯胺类的代谢途径包括羟基化、醚键的断裂和氯乙酰胺基的断裂步骤。