CN103923838B - 一种高油脂含量的四尾栅藻及其构建方法 - Google Patents
一种高油脂含量的四尾栅藻及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种高油脂含量的四尾栅藻及其构建方法。它涉及一种高油脂含量的微藻及其构建方法。它解决了现有四尾栅藻含油量低，影响生物柴油产量的问题。高油脂含量的四尾栅藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。构建方法：一、构建质粒pMD-DGAT1；二、获得重组质粒pBI121-DGAT1；三、电击转化；四、黑暗环境培养。本发明可用于水处理和生物柴油生产领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种高油脂含量的微藻及其构建方法。
背景技术
生物柴油具有能量高、燃烧充分、润滑性好、含硫量低等优良性能，还具有储运安全、抗爆性能好、易生物降解等特点，可作为优质的化石能源替代品然而传统的生物柴油以大豆、玉米、棕榈树、麻风树等农作物为原料，由于原料成本占到生产生物柴油总成本的70％～85％这不仅导致粮食价格上涨也大大增加了生产成本。
我国大庆地区地热水资源较为丰富，地热水是从地表渗透或地下抽取上来，可直接地用于温泉沐浴、采暖、理疗等方面。使用后的地热废水，大多不经处理而直接排入附近的沟渠之中。大庆地区地热水中的含盐量比较高，而且还含有氟、砷、汞等有害的化学成分，尤其是氟，其含量最高达6mg/L左右。地热废水若不经过适当处理而随意排放，废水中较高含盐量会造成土壤盐碱化加重，并且其中的氟及其它有害成分就会因为渗透、迁移、富集作用而造成土壤侵蚀、地下水污染等许多环境问题，甚至进入食物链直接危害人体健康。
微藻环境适应能力强、种类繁多、生长周期短、光合效率高，可以利用地热废水培养微藻生产生物柴油，即可实现废水净化，又能生产生物柴油，可谓是一举两得。
四尾栅藻学名Scenedesmusquadricauda，栅藻科，栅藻属，是淡水中常见的浮游藻类，分布极广，极喜在营养丰富的静水中繁殖，夏秋可大量繁殖，繁殖速度快；对有机污染物具有较强的耐性，是乙型中污带的指示种，能耐受高氟、砷、汞等有害的化学成分。因此四尾栅藻是利用大庆地区地热水资源制备生物柴油的合适微藻。但是四尾栅藻本身含油量低，所以导致利用四尾栅藻生产生物柴油的产量一直受到影响。
发明内容
本发明是为了解决现有四尾栅藻含油量低，影响生物柴油产量的问题，而提供的一种高油脂含量的四尾栅藻及其构建方法。
本发明高油脂含量的四尾栅藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
上述高油脂含量的四尾栅藻的构建方法，其特征在于高油脂含量的四尾栅藻按以下步骤构建：
一、用质粒pMD19-T载体和人工DGAT1基因构建质粒pMD-DGAT1；
二、提取质粒pMD-DGAT1和质粒pBI121分别用XbaI和BamHI进行双酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和载体pBI121，然后连接人工DGAT1基因和载体pBI121，获得重组质粒pBI121-DGAT1；
三、取培养至对数中期的四尾栅藻藻液放入离心管中8000r/min离心5min收集藻体细胞并用预冷的渗透液洗涤藻体，然后加入渗透液冰上放置1h，再8000r/min离心5min，重悬直至四尾栅藻细胞密度达到108cells/mL；然后将四尾栅藻悬液放入水浴锅中42℃热激10min、冰浴5min并沿管壁加入重组质粒pBI121-DGAT1与鲑精DNA，之后吹打混匀置于冰上10min，再用脉冲电压为1500v、脉冲持续时间为2ms的脉冲电击；
四、将步骤三电击转化的四尾栅藻细胞用微藻培养液清洗两次，再置于微藻培养液中于22～25℃黑暗环境中培养24h，即获得高油脂含量的四尾栅藻；
其中，步骤一中人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
本发明高油脂含量的四尾栅藻的油脂含量达细胞干重的11.8％，是未基因重组的四尾栅藻的油脂含量的近2倍，可显著提高用四尾栅藻的生物柴油产量，为工业化生物柴油生产奠定了基础。而且，本发明高油脂含量的四尾栅藻对地热废水中的污染物具有良好的耐受性和去除率，特别是是对氟的去除率更是达到了81％。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式高油脂含量的四尾栅藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
本实施方式对天然紫苏的DGAT1基因进行了人为的改造，与天然紫苏DGAT1基因的同源性为97％。
具体实施方式二：本实施方式高油脂含量的四尾栅藻按以下步骤构建：
一、用质粒pMD19-T载体和人工DGAT1基因构建质粒pMD-DGAT1；
二、提取质粒pMD-DGAT1和质粒pBI121分别用XbaI和BamHI进行双酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和载体pBI121，然后连接人工DGAT1基因和载体pBI121，获得重组质粒pBI121-DGAT1；
三、取培养至对数中期的四尾栅藻藻液放入离心管中8000r/min离心5min收集藻体细胞并用预冷的渗透液洗涤藻体，然后加入渗透液冰上放置1h，再8000r/min离心5min，重悬直至四尾栅藻细胞密度达到108cells/mL；然后将四尾栅藻悬液放入水浴锅中42℃热激10min、冰浴5min并沿管壁加入重组质粒pBI121-DGAT1与鲑精DNA，之后吹打混匀置于冰上10min，再用脉冲电压为1500v、脉冲持续时间为2ms的脉冲电击；
四、将步骤三电击转化的四尾栅藻细胞用微藻培养液清洗两次，再置于微藻培养液中于22～25℃黑暗环境中培养24h，即获得高油脂含量的四尾栅藻；
其中，步骤一中人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
利用天然紫苏的DGAT1基因(紫苏DGAT1基因的cDNA序列如SEQIDNO：2所示)介导转化的四尾栅藻发生基因沉默，并没有获得油脂含量提高的四尾栅藻。当然转基因微藻中的外源基因沉默是常见问题，也是主要难题，其原因可能是外源基因在受体细胞中出现转录、翻译及修饰等多方面的问题，任何一步中出现差错均可能导致外源基因沉默。而且即使是成功的将与微藻油脂合成主要限速酶转化到微藻中也未必可以提高微藻的油脂含量，如Dunahay等人成功地将编码乙酰CoA羧化酶(ACCase)基因转化到硅藻中，使得硅藻中ACCase的活性提高到对照组的2～3倍，然而微藻的油脂含量并没有显著增加。
本实施方式对天然紫苏的DGAT1基因进行了人为的改造，与天然紫苏DGAT1基因的同源性为97％。采用本实施方式构建的高油脂含量的四尾栅藻，可以明显提高四尾栅藻的油脂含量，为工业化四尾栅藻生产生物柴油的实现奠定了基础。
本实施方式中利用载体pBI121构建的重组质粒pBI121-DGAT1中包含CaMV35S启动子。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：步骤二用获得的重组质粒pBI121-DGAT1转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，然后进行蓝白斑筛选，挑选白色菌落进行PCR验证和酶切验证。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三的不同点是：步骤三中渗透液中甘油的体积浓度为10％、甘露醇的浓度为0.2mol/L、山梨醇的浓度为0.2mol/L。其它步骤及参数与实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二、三或四的不同点是：步骤三中鲑精DNA的终浓度为25μg/mL。其它步骤及参数与实施方式二、三或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一的不同点是：步骤四中微藻培养液为BG11液体培养基。其它步骤及参数与实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一的不同点是：步骤四中将获得的高油脂含量的四尾栅藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BG11固体培养基平板上，未加重组质粒的四尾栅藻同样处理作为对照；15天后挑取在卡那霉素固体培养基平板上长出的转化子四尾栅藻群落转接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液体培养基中，继续培养15天后转接到没有抗生素的固体培养基上，隔代在抗生素与无抗生素的培养基中进行交替培养，获得性状稳定的高油脂含量的四尾栅藻。其它步骤及参数与实施方式二至六之一相同。
实施例1
高油脂含量的四尾栅藻按以下步骤构建：
一、用质粒pMD19-T载体和人工DGAT1基因构建质粒pMD-DGAT1；
二、提取质粒pMD-DGAT1和质粒pBI121分别用XbaI和BamHI进行双酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和载体pBI121，然后连接人工DGAT1基因和载体pBI121，获得重组质粒pBI121-DGAT1；
三、取培养至对数中期的四尾栅藻藻液放入离心管中8000r/min离心5min收集藻体细胞并用预冷的渗透液洗涤藻体，然后加入渗透液冰上放置1h，再8000r/min离心5min，重悬直至四尾栅藻细胞密度达到108cells/mL；然后将四尾栅藻悬液放入水浴锅中42℃热激10min、冰浴5min并沿管壁加入重组质粒pBI121-DGAT1与鲑精DNA，之后吹打混匀置于冰上10min，再用脉冲电压为1500v、脉冲持续时间为2ms的脉冲电击；
四、将步骤三电击转化的四尾栅藻细胞用微藻培养液清洗两次，再置于微藻培养液中于22～25℃黑暗环境中培养24h，即获得高油脂含量的四尾栅藻；
其中，步骤一中人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
步骤三中渗透液中甘油的体积浓度为10％、甘露醇的浓度为0.2mol/L、山梨醇的浓度为0.2mol/L；
步骤三中鲑精DNA的终浓度为25μg/mL；
步骤四中微藻培养液为BG11液体培养基；
步骤四中将获得的高油脂含量的四尾栅藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BG11固体培养基平板上，未加重组质粒的四尾栅藻同样处理作为对照；15天后挑取在卡那霉素固体培养基平板上长出的转化子四尾栅藻群落转接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液体培养基中，继续培养15天后转接到没有抗生素的固体培养基上，隔代在抗生素与无抗生素的培养基中进行交替培养，获得性状稳定的高油脂含量的四尾栅藻。
取本实施例获得的高油脂含量的四尾栅藻、未基因重组的四尾栅藻和电击转化天然紫苏DGAT1基因的四尾栅藻进行试验。
按1.0g/L的量分别接入高油脂含量的四尾栅藻、未基因重组的四尾栅藻和电击转化天然紫苏DGAT1基因(cDNA序列如SEQIDNO：2所示)的四尾栅藻于锥形瓶中对地热废水进行处理，以藻体干重为检验指标，对藻体生长、水体除污和生物柴油产量进行试验。试验在温度为25℃、光照强度为5500lx、通气量为220L/h的条件下对地热废水处理11天。
本实施例中地热废水取自大庆市林甸县四季青镇温室大棚保温管道内排出的地热废水，pH值为7～9。本实施例中选用同一种四尾栅藻，购自于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)，藻种编号为FACHB-1476。
将处理11天之后的高油脂含量的四尾栅藻藻液在4000r/min条件下离心获得藻泥并置于80℃烘箱中干燥两小时，待重组四尾栅藻烘干后收集藻粉。取藻粉用研钵粉碎取粉碎后样品5g将其用干净滤纸包好并称重，然后放入脂肪测定仪之中，用石油醚萃取抽提脂肪(分成多组取平均值)，每抽提6小时取出称重，待差值稳定后即为微藻中油脂的粗重，并计算微藻的产油率。
高油脂含量的四尾栅藻的油脂含量达细胞干重的11.8％；未基因重组的四尾栅藻的油脂含量达细胞干重的6.3％；电击转化天然紫苏DGAT1基因的四尾栅藻的油脂含量达细胞干重的2.1％。
实验结果表明本发明构建的高油脂含量的四尾栅藻具有实际应用价值，可明显提高生物柴油的产量。
地热废水中COD、总氮、总磷及氟含量的实验数据如表1所示。
表1
Claims (4)
1.一种高油脂含量的四尾栅藻，其特征在于高油脂含量的四尾栅藻中含有人工DGAT1基因，人工DGAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
其中高油脂含量的四尾栅藻按以下步骤构建：
一、用质粒pMD19-T载体和人工DGAT1基因构建质粒pMD-DGAT1；
二、提取质粒pMD-DGAT1和质粒pBI121分别用XbaI和BamHI进行双酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和载体pBI121，然后连接人工DGAT1基因和载体pBI121，获得重组质粒pBI121-DGAT1；
三、取培养至对数中期的四尾栅藻藻液放入离心管中8000r/min离心5min收集藻体细胞并用预冷的渗透液洗涤藻体，然后加入渗透液冰上放置1h，再8000r/min离心5min，重悬直至四尾栅藻细胞密度达到108cells/ml；然后将四尾栅藻悬液放入水浴锅中42℃热激10min、冰浴5min并沿管壁加入重组质粒pBI121-DGAT1与鲑精DNA，之后吹打混匀置于冰上10min，再用脉冲电压为1500v、脉冲持续时间为2ms的脉冲电击；
四、将步骤三电击转化的四尾栅藻细胞用微藻培养液清洗两次，再置于微藻培养液中于22~25℃黑暗环境中培养24h，即获得高油脂含量的四尾栅藻；
其中，步骤三中渗透液中甘油的体积浓度为10%、甘露醇的浓度为0.2mol/L、山梨醇的浓度为0.2mol/L；
步骤三中鲑精DNA的终浓度为25μg/ml；
步骤四中将获得的高油脂含量的四尾栅藻涂布于含有0.3mg/ml卡那霉素的BG11固体培养基平板上，未加重组质粒的四尾栅藻同样处理作为对照；15天后挑取在卡那霉素固体培养基平板上长出的转化子四尾栅藻群落转接于含有0.3mg/ml卡那霉素的液体培养基中，继续培养15天后转接到没有抗生素的固体培养基上，隔代在抗生素与无抗生素的培养基中进行交替培养，获得性状稳定的高油脂含量的四尾栅藻。
2.权利要求1所述高油脂含量的四尾栅藻的构建方法，其特征在于高油脂含量的四尾栅藻按以下步骤构建：
一、用质粒pMD19-T载体和人工DGAT1基因构建质粒pMD-DGAT1；
二、提取质粒pMD-DGAT1和质粒pBI121分别用XbaI和BamHI进行双酶切，回收目的基因人工DGAT1基因和载体pBI121，然后连接人工DGAT1基因和载体pBI121，获得重组质粒pBI121-DGAT1；
三、取培养至对数中期的四尾栅藻藻液放入离心管中8000r/min离心5min收集藻体细胞并用预冷的渗透液洗涤藻体，然后加入渗透液冰上放置1h，再8000r/min离心5min，重悬直至四尾栅藻细胞密度达到108cells/ml；然后将四尾栅藻悬液放入水浴锅中42℃热激10min、冰浴5min并沿管壁加入重组质粒pBI121-DGAT1与鲑精DNA，之后吹打混匀置于冰上10min，再用脉冲电压为1500v、脉冲持续时间为2ms的脉冲电击；
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