CN103902849A - 基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学技术领域，涉及基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法。本发明方法包括建立基因共表达网络、划分共表达网络为模块、共表达网络性质和模块的癌症特异性计算和建立酶网络、预测关键酶和代谢物。本发明方法可预测对于癌症代谢的关建酶，作为癌症治疗的药物候选靶点；每一个预测的癌症关键酶基因可对应到所涉及反应的代谢物，作为每种癌症的关键代谢物预测结果，该代谢物也可作为候选的药物设计基础代谢物；本方法能明显缩小实验搜寻的范围并加快靶点寻找进程，节约时间及费用，可用于筛选癌症及其他与代谢重调相关的复杂疾病的药物靶点，具有推广价值。

Description

基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法

技术领域

本发明属医学技术领域，涉及癌症关键代谢酶及候选药物靶点，具体涉及一种基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法，尤其涉及寻找癌症关键代谢酶以作为候选药物治疗靶点的方法（Met-express）；本方法可有效地预测癌症中处于关键地位可能可重调代谢过程的酶以为药物开发提供候选靶点。

背景技术

近几十年来，癌症诊断和治疗领域取得了若干的进展，然而，目前癌症仍然是危及人类健康和寿命的最严重疾病之一；为了减少病痛及由癌症引起的死亡，癌症相关领域的研究仍引起有关研究人员的密切关注。其中，在癌症的致病机理研究中，很多关于癌症的高通量实验数据被发布在公共数据库中，例如，GEO数据库中的基因表达芯片数据数量庞大，通常有助于各实验特定的研究目的，其中的大量信息可被跨实验综合利用。

现有技术公开了，在癌细胞中有许多代谢通路被重调以适应癌症的特定需求或促进癌症的发生发展；有研究通过计算方法挖掘整合公共数据库中的高通量数据以研究癌细胞相对的代谢变化，寻找居于核心地位的酶，以期通过影响这些酶的表达来影响癌细胞代谢过程，进而起到治疗癌症的作用。

关于对大规模数据的处理，本领域公知，其中除了依赖于数据的质量，还依赖于适宜的计算方法；由于计算模拟方法具有易操作性，通过计算机模拟进行癌症代谢特征分析并预测候选靶点可以为下一步大规模实验验证节约大量的时间和经费。目前，迫切需要一种可以通过大规模数据预测癌症治疗靶点的计算方法，为癌症的治疗方案的设计提供新的可能性。

与本发明有关的参考文献：

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3.Ruan J，Zhang W：Identifying network communities with a high resolution.Phys Rev E Stat Nonlin SoftMatter Phys 2008，77(1 Pt 2)：016104.

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11.Langbein S，Zerilli M，Zur Hausen A et al：Expression of transketolase TKTL1 predicts colon andurothelial cancer patient survival：Warburg effect reinterpreted.Br J Cancer 2006，94(4)：578-585.

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发明内容

本发明的目的在于提供一种基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法，尤其涉及寻找癌症关键代谢酶以作为候选药物治疗靶点的方法（Met-express）；本方法采用基因表达芯片，从中建立基因共表达网络，将之划分为共表达模块，与代谢网络整合，结合多个数据集的结果，最终给出预测；本方法可有效地预测癌症中处于关键地位可能可重调代谢过程的酶以进一步为药物开发提供候选靶点。

具体而言，本发明的一种基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）选择具有人类癌症、正常样本对照的基因表达芯片数据，建立共表达网络；

（2）将共表达网络划分为模块，并鉴定模块的癌症特异性；

（3）将共表达网络模块与人类代谢网络整合，对代谢网络中的每个酶进行打分；

（4）结合来自不同癌症、不同数据集的结果，给出高分酶作为预测结果。

本发明中，基于基因表达芯片数据和代谢网络，将共表达网络与代谢网络整合，对所有存在于共表达网络中的酶进行重要性打分，得分高的酶设定其在癌症代谢中处于关键地位，拟定为治疗靶点，则方法（Met-express）中通过：若给定一个癌症特异的基因共表达模块，该模块中的基因将处在相关的生物过程中或被共调控，若其中一个酶编码基因与其在代谢网络中的较多近邻共存在此共表达模块中，那么该酶基因具有更大的改变癌细胞代谢状况的可能性；

本发明所述的方法（Met-express）中，将癌症的表达芯片数据划分为共表达模块，并将该信息与KEGG的代谢网络整合，根据模块特异性及酶与代谢近邻在模块中的共存情况对每个酶基因进行打分，综合来自不同表达芯片数据的结果，得到高分的预测；预测所得的酶基因和其相关代谢物（底物或产物）经文献验证，对有关癌症具有重要的潜在治疗价值（如图1所示）。

本发明的方法步骤（1）中，建立基因共表达网络的步骤为，

从GEO数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载癌症的GDS数据，小于10个样本的数据集不纳入考虑；所选取的数据集必须同时包括癌症样本和正常样本，尤其是来自组织而非细胞系的数据；实验所用的样本必须是未经药物或其他刺激处理过的，因此，所选取的数据集在实验背景上较为一致，更具有可比性，且由于选取的是组织数据，更接近于体内情况；

首先，对数据进行如下预处理：①在一个数据集中，对于每一个基因，若对应探针的表达中位值有不少于80％为空缺值，则该基因将被删除，不用于后续分析；②对于每一种癌症，选取两个数据集共有的基因进行后续分析；③对于每一个数据集，上述步骤之后留下的每一个基因，表达值取其对应的所有探针表达值的中位值；④对于每一个数据集，做Qauntile标准化（使用R中limma包的normalizeQuantiles函数）；⑤对于每一个数据集，用KNN的方法补缺失值（使用R中impute包的impute.knn函数）；⑥将每一个数据集上表达值做log2转化；

然后，依照Ruan等提出的基于表达相似度排序的构建基因共表达网络的方法，对于每一个数据集建立一个共表达网络；其中，表达相似度使用皮尔森相关系数（PearsonCorrelation Coefficient，PCC）度量，对于每个基因，将其他所有基因与之的表达相关度进行排序，取前三个基因作为共表达的基因；

本发明方法的步骤（2）中，划分共表达网络为模块的步骤为:

采用Qcut对每一个共表达网络进行模块划分，所得的亚网络结构具有最优化的模块度（Modularity函数function(Q)），且模块内连接比随机期待高；所述Qcut已经在合成网络、社会网络和真实生物学网络中检测过，该方法被证明能够有效地找到特别有意义的、在特异GO terms（gene ontology terms）中富集基因的亚网络（模块）；每一个数据集所划分为模块后，只选取基因数不小于10个的模块进行之后的分析；

本发明方法的步骤（3）中，共表达网络性质和模块的癌症特异性计算的步骤为：

对每一个数据集，计算其中连接度与对应点的个数，分别取log10底，画图，并计算线性回归r值，得到所建立的共表达网络的网络性质；

其中，衡量一个模块与癌症的相关程度的步骤为：检测每个样本中每个模块基因表达的中位值，根据该中位值区分癌症和正常样本的准确程度画ROC曲线，对每一个曲线得到一个AUC值（曲线下面积），该面积范围是0～1；面积值越远离0.5，代表该模块表达值越能正确区分癌症和正常样本，就认定该模块与癌症的关系更紧密；AUC小于0.5代表该模块在癌症中下调，而AUC大于0.5代表该模块在癌症中上调（本发明对比了不同AUC的模块所富集的GO）；

本发明方法中，建立酶网络的步骤为：

从KEGG数据库（www.genome.jp/kegg/）中下载人类的KEGG Makeup Language（KGML）文件；所述KGML文件中包含代谢反应、对应的代谢物和酶、基因的信息；然后，根据人类代谢网络，建立一个酶网络；因为代谢网络中参与众多反应的一些代谢物，如H2O，ATP和NADP等，会破坏网络的结构，造成一些原本不存在的“近路”，因此需将该代谢物去掉；参照现有技术中使用的方法，用以下步骤去掉一部分代谢物：①统计代谢物所参与的反应数，发现大多数代谢物参与的反应数低于10个，一些代谢物参与10-18个反应，只有较少的代谢物参与大于18个反应，因此，首先去掉参与反应数大于18个的代谢物；②去掉只参与“Xenobiotics Biodegradation and Metabolism”中代谢反应的代谢物；

然后，用筛选的代谢物和反应构建酶网络；对于每一个酶A，若其参与反应的产物被另一个酶B用作反应底物，则A被连接到B，方向为A->B；酶网络的网络性质用R的bigraph包进行计算；

本发明方法的步骤（4）中，预测关键酶和代谢物的步骤为：

将所构建人类酶网络对应到酶编码基因和共表达网络模块中后，对于每一个数据集的每一个模块，计算每一个酶基因与模块内和模块外的酶基因在酶网络中的连接数；若一个酶基因与模块内其他酶基因在代谢网络中的连接数(Cin)大于基于总连接数(Call)的期待值，则该酶基因被认为是一个关键酶基因；本发明采用下述打分公式衡量酶基因的重要程度：

$S_{\mathrm{gene}}=|\mathrm{AR}-0.5|*{\log }_2\frac{C_{\mathrm{in}}/C_{\mathrm{all}}}{N_{\mathrm{in}}/N_{\mathrm{all}}}---\left(1\right)$

在上述公式中，AR为基因所在模块区分癌症样本和正常样本的ROC曲线下面积（AUC-ROC），Cin是酶基因与模块内其他酶基因的在酶网络中的连接度，Call为酶基因与酶网络中存在于该数据集所有模块中的其他酶基因的连接度；Nin和Nall分别为在该模块内的酶基因数和在该数据集中所有模块中的酶基因数；

本发明中，所述的Call*Nin/Nall为一个简化的、衡量一个酶基因在模块中的连接数期待值的方法；若观察到酶基因的连接数大于期待值，则该基因得到一个正分值，反之亦然；因此，Sgene整合了上述两种网络的信息，包含了模块与癌症的关系和酶基因对模块的重要性两方面信息；

本发明中，为了消除可能的噪声，并使结果更可靠，将同一种癌症的两个数据集所得到的酶的分值相加然后进行排序；对于每一种癌症选择分值较大的关键酶作为预测结果。

本发明所述的基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法的优点在于，

1，首次使用网络整合的方法作为一种预测方法寻找癌症关键酶，所使用的构建共表达网络和网络划分方法均较适用于生物学数据，能得到具有生物学意义的模块；网络整合后结合了表达模块特异性和网络拓扑结构信息对酶进行打分，能更好地利用来自两方面的信息；经比较，本方法比单独使用基因共表达网络或代谢网络更能找到有效的靶点；

（2）本发明所预测的新的潜在靶点中，对其中的5个进行了细胞实验，结果验证了通过所述的靶点可抑制非小细胞肺癌、乳腺癌细胞的增殖迁移，促进其凋亡坏死。

本发明的方法（Met-express），可预测对于癌症代谢的关建酶，作为癌症药物治疗的候选靶点；每一个预测的癌症关键酶基因可对应到所涉及反应的代谢物，作为每种癌症的关键代谢物预测结果，该代谢物也可作为候选的药物设计基础代谢物；本发明所述的方法还可用于筛选癌症及其他与代谢重调相关的复杂疾病的药物靶点。

附图说明

图1为本发明方法的流程图。

具体实施方式

实施例1

本发明中，将所述的方法用于非小细胞肺癌、乳腺癌、白血病中，每种疾病选取两个基因表达数据集，分别构建共表达网络；然后，按照癌症对每个数据集中产生的打分进行综合，即得到对每个癌症分别的高分预测酶；经与Drugbank等数据库及现有发表文献中的证据进行比较，结果显示，所预测的高分酶更倾向于是已知的治疗癌症的靶点及文献中报道与癌症机制相关的酶。

其中，已知药物靶点：

HPRT1在三种癌症预测结果中同时存在，是一种经典抗癌药物Mercaptopurine的靶点；所述HPRT1编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1，该酶对于核酸生物合成很重要，抗癌药物Mercaptopurine与次黄嘌呤和鸟嘌呤竞争抑制该酶，从而抑制癌细胞的生长和增殖。

所述CYP19A1在乳腺癌中被预测，其编码细胞色素P450芳香化酶，在乳腺癌治疗中被广泛研究和应用；该酶催化C18雌激素芳构化至C19雄激素的反应，上述过程可被Aminoglutethimide抑制从而治疗雌激素依赖型乳腺癌。

文献证明机制相关：

MTHFD2同时出现在肺癌和乳腺癌的预测结果中，其所编码的酶具有两种功能活性——亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性和亚甲基四氢叶酸环化水解酶活性，gauge酶在叶酸介导的代谢过程中起作用；所述MTHFD2已被报道可作为乳腺癌的一个新标记，其在乳腺癌细胞系中表达升高。

TKTL1是对乳腺癌预测的关键酶基因，其编码转羟乙醛酶类似酶1（transketolase-like 1），研究发现抑制转羟乙醛酶可抑制肿瘤生长，促进肿瘤凋亡，因而TKTL1成为了抗转羟乙醛酶治疗乳腺癌和其他癌症的候选靶点。

因此，本发明所述的方法能为单靶点及多靶点联合用药治疗癌症提供一系列高分值候选靶点，具有潜在的临床应用价值；本发明方法能明显缩小实验搜寻的范围并加快靶点寻找进程，节约大量时间及费用。

Claims (8)

1.一种基于基因芯片数据和代谢网络测定癌症关键代谢酶的方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）选择具有人类癌症、正常样本对照的基因表达芯片数据，建立共表达网络；

（2）将共表达网络划分为模块，并鉴定模块的癌症特异性；

（3）将共表达网络模块与人类代谢网络整合，对代谢网络中的每个酶进行打分；

（4）结合来自不同癌症、不同数据集的结果，给出高分酶作为预测结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，建立基因共表达网络的步骤为，

从GEO数据库www.ncbi.nlm.nih.gov/geo下载癌症的GDS数据，不纳入小于10个样本的数据集；所选取的数据集同时包括癌症样本和正常样本的组织的数据；实验所用的样本未经药物或其他刺激处理；

首先，对数据进行如下预处理法：

①在一个数据集中，对于每一个基因，若对应探针的表达中位值有不少于80％为空缺值，则该基因被删除，不用于后续分析；

②对于每一种癌症，选取两个数据集共有的基因进行后续分析；

③对于每一个数据集，上述步骤之后留下的每一个基因，表达值取其对应的所有探针表达值的中位值；

④对于每一个数据集，做Qauntile标准化，使用R中limma包的normalizeQuantiles函数；

⑤对于每一个数据集，用KNN的方法补缺失值，使用R中impute包的impute.knn函数；

⑥将每一个数据集上表达值做log2转化；

然后，依照基于表达相似度排序的构建基因共表达网络的方法，对每一个数据集建立一个共表达网络，其中，表达相似度使用皮尔森相关系数度量，对于每个基因，将其他所有基因与之的表达相关度进行排序，取前三个基因作为共表达的基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，划分共表达网络为模块的步骤为:

采用Qcut对每一个共表达网络进行模块划分，所得的亚网络结构具有最优化的模块度Modularity函数function(Q)，且模块内连接比随机期待高；每一个数据集所划分为模块后，只选取基因数不小于10个的模块进行之后的分析。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，共表达网络性质和模块的癌症特异性计算的步骤为：

对每一个数据集，计算其中连接度与对应点的个数，分别取log10底，画图，并计算线性回归r值，得到所建立的共表达网络的网络性质；

其中，衡量一个模块与癌症的相关程度的步骤为：检测每个样本中每个模块基因表达的中位值，根据该中位值区分癌症和正常样本的准确程度画ROC曲线，对每一个曲线得到一个AUC值，该面积范围是0～1；面积值越远离0.5，代表该模块表达值越能正确区分癌症和正常样本，则认定该模块与癌症的关系紧密；AUC小于0.5代表该模块在癌症中下调，AUC大于0.5代表该模块在癌症中上调。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，建立酶网络的步骤为：

从KEGG数据库www.genome.jp/kegg/中下载人类的KEGG Makeup Language文件；所述KGML文件中包含代谢反应、对应的代谢物和酶、基因的信息；

然后，根据人类代谢网络，建立一个酶网络；

采用以下步骤去掉一部分代谢物：①统计代谢物所参与的反应数，去掉参与反应数大于18个的代谢物；②去掉只参与“Xenobiotics Biodegradation and Metabolism”中代谢反应的代谢物；

用筛选的代谢物和反应构建酶网络；对于每一个酶A，若其参与反应的产物被另一个酶B用作反应底物，则A被连接到B，方向为A->B；酶网络的网络性质用R的bigraph包进行计算。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，预测关键酶和代谢物的步骤为：

将所述的人类酶网络对应到酶编码基因和共表达网络模块中后，对每一个数据集的每一个模块，计算每一个酶基因与模块内和模块外的酶基因在酶网络中的连接数；若一个酶基因与模块内其他酶基因在代谢网络中的连接数Cin大于基于总连接数Call的期待值，则该酶基因被认为是一个关键酶基因，采用下述打分公式衡量酶基因的重要程度：

$S_{\mathrm{gene}}=|\mathrm{AR}-0.5|*{\log }_2\frac{C_{\mathrm{in}}/C_{\mathrm{all}}}{N_{\mathrm{in}}/N_{\mathrm{all}}}---\left(1\right)$

在上述公式（1）中，AR为基因所在模块区分癌症样本和正常样本的ROC曲线下面积（AUC-ROC），Cin是酶基因与模块内其他酶基因的在酶网络中的连接度，Call为酶基因与酶网络中存在于该数据集所有模块中的其他酶基因的连接度；Nin和Nall分别为在该模块内的酶基因数和在该数据集中所有模块中的酶基因数；

若酶基因的连接数大于期待值，则该基因得到一个正分值，反之亦然；

将同一种癌症的两个数据集所得到的酶的分值相加后进行排序；对每一种癌症选择分值较大的关键酶作为预测结果。

7.权利要求1所述的方法在筛选癌症药物靶点中的用途。

8.权利要求1所述的方法在筛选与代谢重调相关的药物靶点中的用途。