CN103898167B

CN103898167B - 一种生产乙醇的方法

Info

Publication number: CN103898167B
Application number: CN201210572857.1A
Authority: CN
Inventors: 林海龙; 武国庆; 李凡; 林鑫; 沈乃东; 许克家; 邓立康; 张丹; 刘文信; 刘劲松; 李春玲; 袁敬伟; 岳国君
Original assignee: COFCO BIOCHEMICAL ENERGY (ZHAODONG) Co Ltd; Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: COFCO BIOCHEMICAL ENERGY (ZHAODONG) Co Ltd; Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103898167A

Abstract

本发明首先提供了一种生物质发酵制备乙醇的方法，包括：（1）预处理：原料破碎、原料输送、酸液混合、蒸煮、减压的步骤，其中以喷淋形式将原料与酸或酸酐接触；（2）酶解；（3）发酵：采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至酶解液中发酵24-72h；（4）分离发酵液获得乙醇。

Description

一种生产乙醇的方法

技术领域

本发明涉及一种从发酵生物质生产乙醇的方法，特别涉及一种发酵木质纤维素生物质生产乙醇的方法。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭，温室效应的逐步显现，清洁能源已成为全球的研究热点，以木质纤维素为原料发酵生产燃料乙醇受到了广泛关注。

木质纤维素生物质包含有半纤维素和纤维素形式的糖聚合物，为了生产化学品，糖聚合物必须先分解成糖单体，分解聚合物的常用方法是利用酶水解，然而为了提高生物质对酶的可用性，木质纤维素生物质通常需要预处理。同时，木质纤维素类生物质水解产物中除葡萄糖外，还含有大量以木糖为主的五碳糖，因此发酵戊糖生产乙醇是提高乙醇总收率、降低生产成本的重要措施之一。可见，生物质发酵生产乙醇尚待突破和优化的三个个技术难题是原料预处理工艺、低成本纤维素酶的生产技术、戊糖发酵生产乙醇菌种及共发酵发酵工艺。

CN101736646A公开了纤维素原料在蒸汽爆破之前先用稀酸或稀碱水解之后汽爆处理得到纤维素浆粕的方法。

CN1896254A公开了混合菌群降解发酵木质纤维素类物质生产酒精的方法，包括将木质纤维素类物质粉碎后用H₂SO₄浸泡，然后采用蒸汽爆破的方式。

CN101220379A公开了将甜高粱茎秆汁渣分离，经过稀H₂SO₄浸泡后然后对甜高粱渣进行稀酸爆破预处理,酶解发酵得到乙醇。

WO2011/028554A1公开了由纤维素生物质制备乙醇时生产各种副产物的方法，将净化生物质原料进行酸浸渍和改进的蒸汽处理或“蒸汽爆破”处理。

专利CN1966694A公开了一种利用重组酿酒酵母NAN127发酵葡萄糖和木糖生产酒精的方法，包括种子培养、扩大培养和种子发酵的步骤，其中种子培养和扩大培养采用YERD培养基，发酵培养为葡萄糖、木糖、蛋白胨的混合物。

专利CN101165166A中报道了利用热带假丝酵母CandidaTropicalis及其驯化菌株对木质纤维素水解产物进行发酵，能够代谢葡萄糖产乙醇并转化木糖成木糖醇，培养基选择酵母浸膏、麦芽提取物、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、胰蛋白胨。

专利WO200851348A、WO200958927A、WO200958938A中公开了使用经过改造的Zymomonasmobilis生产乙醇的方法，种子培养物在SM培养基中扩大培养，并且最终培养物包含一定pH条件下的葡萄糖和木糖的混合配制物。

专利WO9742307A中报道了用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母，其中采用YEPD培养基扩大培养，扩大培养后的重组酵母投入葡萄糖和木糖的混合物中。

上述专利所公开的生产方法均无法实现工业化生产，并且经过长时间酸浸泡的原料在蒸汽爆破的高压高温下对蒸汽爆破设备的进料装置产生巨大的酸腐蚀作用，需要随时更换，生产成本较高，并且处理后的纤维素原料产生了大量抑制物，对后续步骤影响较大，整个流程蒸汽用量大，处理压力高，容易造成安全隐患；而且上述工艺中发酵微生物发酵原料均使用实验配制物，在其披露的扩大培养以及发酵条件下菌体生长慢，发酵时间长，转化率低，无法实现大规模的乙醇发酵生产，不能满足利用现有菌株从木质纤维素产生乙醇的工业化生产。

因此，本发明克服了现有技术中的缺陷，公开了一种能够在酸性条件下连续对生物质进行处理，发酵处理后产物中五碳糖和六碳糖物质从而获得乙醇的方法。

发明内容

本发明目的是提供了一种生物质发酵生产乙醇的方法，解决了处理后的物料纤维结构打开程度不高，半纤维素回收率较低的缺陷，同时克服了C5/C6共发酵微生物菌体生长慢，发酵时间长，乙醇转化率低的缺陷，提高乙醇的产率，有利于生物质乙醇的工业化生产。

另一方面，本发明还提供了一种生物质发酵制备乙醇的方法，包括：（1）预处理：原料破碎、原料输送、酸液混合、蒸煮、减压的步骤，其中以喷淋形式将原料与酸或酸酐接触，所述的酸液混合步骤在原料输送步骤之后，将与酸以喷淋形式接触后的原料进一步混合均匀，混合后的原料继续蒸煮；（2）酶解，将预处理后的产物酶解；（3）发酵：采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至酶解液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇。

本发明中所指的“生物质”为农林业生产过程中除粮食、果实以外的秸秆、树木等木质纤维素、农产品加工业下脚料、农林废弃物及畜牧业生产过程中的禽畜粪便和废弃物等物质，包括玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、报纸、柳枝、燕麦壳等。从结构上看，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。在优选实施方案中，生物质材料含木素纤维素材料包含至少30wt.%，优选至少50wt.%，更优选至少70wt.%，甚至更优选至少90wt.%的木质纤维素。应理解的是，生物质还可以包含其它组分，如蛋白质材料、淀粉、糖，如可发酵的糖和/或不可发酵的糖。

（1）预处理

本发明所述的原料破碎的步骤为将生物质原料（纤维素）破碎成适宜的颗粒长度，可以理解的是，不同的生物质适宜的破碎程度是不同的，但优选的破碎为平均长度为15cm以下的颗粒，更优选为10cm以下的颗粒，特别优选为10-100mm的颗粒。上述破碎方式可以通过粉碎机、研磨机、锤磨机或本领域中已知的其它合适的粉碎装置进行处理。

另一方面，本发明所述的原料在破碎后还可以存在除杂的步骤。由于原料绝大部分都是

经过多次倒运，过程中可能会混入砂土、铁器等杂物，如不对物料进行前期处理，可能造成后面处理设备的磨损甚至损坏。处理方法包括采用水洗、筛分、风选等方式。可例举的方式，包括：对物料破碎后，输送过程经过筛板进行除砂土；经过手动永磁除铁器进行除铁处理；在输送过程中进行水洗的步骤；或者将上述步骤组合使用。

本发明所述的原料的输送可通过主动和/或被动输送装置来进行。所述的被动输送装置包括利用重力的方式来进行，将破碎后的原料经过倾斜成一定角度来提供输送。更为有利的输送方式是通过主动输送装置来进行，例如通过传送带和/或传送螺杆来实现。传送螺杆可由变速发动机提供动力，并且传送螺杆通过沿其轴线的旋转运动而提供原料向出口的输送，在此过程中同时完成了对物料脱水和压缩，并由于产生了密封的环境，有利于压力的封闭和增加。在优选的实施例中，原料输送的设备采用螺旋喂料器或螺杆挤出机完成，在输送过程中对原料脱水至干物的10-60wt.%，以重量百分比计，优选20-50wt.%，更为优选为25-45wt.%。在本发明的另一个优选的实施例中，原料的输送通过传送带床送到螺旋喂料器或螺杆挤出机，在经过任选的酸液混合、蒸煮、减压的步骤。

进一步，本发明所公开的生物质的处理方法，还包括了以喷淋形式将原料与酸或酸酐接

触。所述的酸可以为无机酸或有机酸，无机酸包括硫酸、盐酸、磷酸、硝酸、有机酸包括醋酸。酸酐可以为乙酸酐、丁酸酐、丁二酸酐、乙二酸酐等，优选为硫酸或盐酸。本发明中与原料接触的酸或酸酐的浓度可以为0.1%-15wt.%，优选为0.5-10wt.%，更优选为0.5-5wt.%，在本发明的一个实施方式中使用的是0.1-10wt.%的稀硫酸溶液。喷淋的方式可以采用喷淋机或喷淋头，喷淋头可以使用一个或两个以上。本发明喷淋的酸与原料的比例是1：10-100，优选1:10-50，最优选1:10-30。

在本发明的一个具体实施方式中所述的酸喷淋步骤是在原料输送步骤完成，破碎后的生物原料在输送的过程中可以喷淋酸或酸酐，所述的喷淋发生在传送带和/或传送螺杆输送原料的过程中。在一个实施方式中，所述的酸喷淋的过程在螺旋喂料器或螺杆挤出机的前端，优选是在原料进入螺旋喂料器或螺杆挤出机之前进行。在更有选的实施例中，所述的酸喷淋的过程在螺旋喂料器或螺杆挤出机的末端，优选是在原料经螺旋喂料器或螺杆挤出机处理后进行。通常认为，由于螺旋喂料器或螺杆挤出机需要对原料进行挤压，当在前端进行喷酸时，由于酸没有与原料混合均匀，挤压过程不容易精准控制，最终与原料接触的酸液无法控制，并且挤压过程是在高压高温下进行，产生巨大的酸腐蚀作用，因而所述的酸喷淋的过程在螺旋喂料器或螺杆挤出机的末端。另一方面，本发明所述的酸喷淋步骤还可以在蒸煮步骤完成，通过输送步骤进入蒸煮器的原料可以通过喷淋酸液，同样的可以避免挤压过程是在高压高温下进行，产生巨大的酸腐蚀作用。

当酸液与原料接触后，为了使酸能够和原料混合均匀，可以任选的在原料输送和蒸煮

之间添加入酸混合步骤，所述的混合步骤可以通过装有螺旋推进叶片的筒体或绞龙来实现，并且混合的装置应该与蒸煮器连通保持一致的压力。所述的混合时间可以为1-30min，优选为2-20min，更优选为2-10min。

本发明所述的蒸煮步骤可以通过蒸煮器实现，所述的蒸煮器为搅拌釜反应器或非搅拌釜反应器(例如是立式或者卧式反应器)，优选采用具有推进叶片的蒸煮器来完成，所述的蒸煮器可以是一个或多个。蒸煮过程的压力是可以是恒定的或非恒定的，所述的压力为0.5-2MPaG，优选为0.5-1MPa，更优选为0.5-0.8MPa，特别是采用本发明公开的生物质的处理方法，保证了处理压力为0.5-0.8MPa，低于常见的高温高压处理方式所采用的1.2-1.6MPa，操作上安全性更高。当增加酸浸渍的原料在用于蒸汽处理的容器中的停留时间时，可以观察到纤维素和/或半纤维素降解为诸如羟甲基糠醛之类的降解产物。因而，通常选择在反应器内的停留时间以在不导致产物继续降解的情况下提高纤维素的生物利用度和/或溶解半纤维素。一般来说，蒸煮的时间可以为1-30min，优选为2-20min，更优选为2-10min。蒸煮过程内对于温度的要求使促进整个区域当中的温度相对均匀和原料温度的相对均匀。因此，通常通过将蒸汽分布到整个原料当中使原料在接触区内达到目标温度，使得相当一部分原料的平均温度不会与目标温度有任何显著程度的差异。例如，在各种优选的实施方案中，生物质原料区域的平均温度与目标温度相差不大于5℃。

本发明所述的减压的目的是通过瞬间泄压过程实现纤维素、半纤维素与木质素的组分分离和各自结构变化，该过程可以通过喷放阀来实现，通过压力恢复到常压连续或间歇泄压排放的方式排出。所述减压间隔时间可以为1-20s，优选2-10s。

在一个具体实施方面，本发明所述的步骤（1）预处理中包括：原料破碎、通过螺旋

喂料器输送原料，将原料与酸性溶液或酸酐混合，通入蒸汽蒸煮，然后通过减压排放的方式排除，其中以喷淋的方式喷入0.5%-10wt%的酸性溶液或酸酣。在一个实施例中，其中所述的喷淋酸性溶液或酸酣步骤在进入螺旋喂料器前进行，更优选的实施方式是其中所述的喷淋步骤在原料经螺旋喂料器或螺杆挤出机处理后进行。原料通过螺旋喂料器，对原料脱水至干物的10-60wt.%，优选20-50wt.%，更为优选为25-45wt.%，以重量百分比计。所述的蒸汽为低压蒸汽，优选为0.5-1MPaG，更优选为0.5-0.8MPaG。

（2）酶解

本发明所述的酶解步骤中使用的酶包括：纤维素酶、半纤维素酶，淀粉酶、蛋白酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶等，其中纤维素酶包括但不限于纤维二糖水解酶（纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II）以及内切葡聚糖和β-葡糖苷酶。

（3）发酵

本发明所述的发酵方法包括采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，例如培养至菌种数为（0.1-0.5）×10⁹/ml，接种扩大培养至（0.1-1）×10⁹/ml，将扩大培养后的微生物移至酶解液中发酵24-72h，分离发酵液获得乙醇。

本发明所述发酵步骤酶解液中还加入蛋白质、游离氨基酸、维生素、微量元素中的一种或几种。其中，蛋白质在发酵液中的含量为3-4g/L；所述游离氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸中的一种或几种；所述的微量元素包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙中的一种或几种；所述的维生素包括B族维生素，例如生物素、叶酸。在本发明的一个实施方案中，发酵过程中加入黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt.%）、鱼粉和/或酵母膏，提供蛋白质、游离氨基酸、维生素和/或微量元素，其含量为5-10g/L,优选为6-8g/L。优选的，发酵过程中还加入有无机盐和/或抑制剂。所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L，优选1-2.5g/L，在本发明的一个优选实施方式中发酵液中含有0.5g/L磷酸二氢钾和2g/L磷酸氢二铵。当发酵培养过程没有进入杂菌时，在发酵液中不需要添加抑菌剂，所述的抑制剂是用来抑制培养基中的杂菌，选自青霉素、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、土霉素、四环素中的一种或几种，优选青霉素或/链霉素，发酵液中抑制剂的工作浓度为10-50单位/mL，优选为15-25单位/mL，更优选为20单位/mL。

本发明所述的发酵步骤中，首先将C5/C6共发酵微生物发酵进行种子培养，优选采用YEPD培养基培养发酵微生物，该步骤中优选培养时间为12-20h，特别特优的培养时间为12-16小时培养至（0.1-0.5）×10⁹/ml，优选培养至（0.2-0.3）×10⁹/ml。本发明中所指的YEPD培养基是指培养基成分为酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，经分装灭菌制备得到。

本发明中所述发酵步骤中扩大培养的培养基即扩培液是微生物获得生存的营养来源，对微生物生长繁殖、酶的活性与产量都有直接的影响。所述的扩大培养的培养基可以为玉米糖化醪、糖蜜、葡萄糖、甜高粱茎秆汁或木质纤维素原料酶解液中的一种或几种，并且培养基中葡萄糖的含量以重量百分比计在2-10%，优选含量为4-6%。优选的，扩大培养的培养基含有4%葡萄糖（重量百分比）的培养基或以葡萄糖含量为4%（重量百分比）的玉米糖化醪。在本发明的另一优选实施方式中，所述的培养基可以为木质纤维素原料酶解液，其中按重量百分比含有葡萄糖1-25%、木糖1-10%，优选的葡萄糖含量为5-20%，更优选为6-12%，木糖含量优选为3-8%，更优选为3-6%，作为培养基时，其稀释浓度为10-75%（重量百分比），优选的培养基为20-30%稀释后的木质纤维素原料酶解液。所述培养基中还发酵液中还含有蛋白胨、黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆（其中干物质含量为40-60wt.%）、鱼粉和/或酵母膏中的一种或几种，其含量为5-10g/L,优选为6-8g/L，其作用的一方面用于提供微生物生长所需要的氮源、包括丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、苏氨酸、胱氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸的游离氨基酸、包括铜、钙、铁、锌、铅、银、铬、菸酸、吡哆酸、硫胺和/或泛酸钙中的微量元素以及包括B族维生素在内的维生素。培养基中任选的还可以含有尿素、无机盐和/或抑制剂，所述的尿素的含量为2-5g/L，优选为3-4g/L，所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾和/或磷酸氢二铵，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L，优选1-3g/L，在本发明的一个优选实施方式中发酵液中含有1.5g/L磷酸二氢钾和1.5g/L磷酸氢二铵。

发酵步骤扩大培养中种子罐的级数对发酵同样产生影响，级数少可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒、值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成发酵的波动。本发明所述的扩大培养可以采用二级扩培、三级扩培或四级扩培。在本发明的一个优选的实施方式中，采用三级扩大培养方式，摇瓶种子培养后的发酵微生物接至50L扩培发酵罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml，移至5立方扩培罐中，12-24h扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml；在本发明的另一个实施方式中，采用四级扩培的方式，摇瓶种子培养后的发酵微生物接种至50L扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml，移至5立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml，移至30立方扩培罐，12-24h扩培至（0.1-0.5）×10⁹/ml。接种到扩大培养的微生物接种量可以为种子培养的5-20%，优选为5-10%。

微生物扩大培养和发酵条件中控制通气条件时，应考虑到既能满足菌种生长与合成酶的不同要求，又要节省电耗，以提高经济效益。通气可以供给大量的氧，而搅拌则能使通气的效果更好，并且搅拌有利于热交换，使培养液的温度较一致，有利于营养物质和代谢物的分散。此外，选用挡板可使搅拌效果更好。在培养阶段的各个时期的通气量，可以根据菌种的特性、罐的结构、培养基的性质通过试验确定。在本发明的一个实施方式中扩培通气量应该控制在0.1-0.5vvm，每小时10-20min，优选的通气量控制在0.1vvm，每小时20min，扩培搅拌转速可以控制在50－100r/min，特别优选的搅拌速度为70r/min，发酵2-4h搅拌一次，每次5-20min，特别优选4h搅拌一次，每次10min。

同时，本发明所述的微生物发酵步骤中温度可以选择微生物生长的适宜温度，例如在25-38℃范围内，在此温度范围内，微生物生长、繁殖最快。在本发明的优选实施方式中，所述的发酵过程温度控制在28-35℃范围内，优选在28-32℃。如果所培养的微生物能承受稍高一些的温度进行生长、繁殖，可减少污染杂菌的机会，减少夏季培养所需降温的辅助设备，对工业生产有很大的好处，例如在低于45℃条件下。处于缓慢期的细菌对于温度的影响十分敏感，将其置于最适生长温度附近，可以缩短其生长的缓慢期；将其置于较低的温度，则会延长其缓慢期；而且孢子萌发的时间在一定温度范围内也随温度的上升而缩短。处于对数生长期的细菌，如果在略低于最适温度的条件下培养，即使在发酵过程中升温，其升温的破坏作用也显得较弱。

培养基的氢离子浓度对微生物的生命活动有显著影响。各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值。同一菌种合成酶的类型与酶系组成可随pH值的改变而产生不同程度的变化。本发明所述的微生物扩大培养和发酵条件中，pH值应该保持在pH5.0-7.0的范围内，在一个优选的实施方式中，pH值应该保持在pH4-6.5的范围内。本发明所述调节pH值的方法有三种，使用酸碱溶液、缓冲液以及各种生理缓冲剂（如生理酸性与生理碱性的盐类），优选使用碱溶液进行调节，包括氨水、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠。

本发明中所指C5/C6共发酵微生物指自然界分离得到的微生物以及经过遗传工程改造后的C5/C6共发酵微生物，包括细菌、真菌和酵母酿酒。酵母包括酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、嗜鞣管囊酵母Pachysolentannophilus、树干毕赤酵母Pichiastipitis、休哈塔假丝酵母Candidashehatae、酒香酵母Brettanomycesnaardenensis、纤细假丝酵母Candidatenuis、热带假丝酵母Candidatropicalis和赛沟毕赤酵母Pichiasegobiensis；真菌包括多动拟杆菌Bacteroidespolypragmatus、菊欧文氏杆菌Erwiniachrysanthem、植物克雷伯杆菌Klebsiellaplanticola、嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus、球状螺旋体Spirochaetacoccoidessp.、植物发酵梭菌Clostridiumphytofermentassp.；真菌包括尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、粗糙脉孢菌Neurosporacrassa和燕麦镰刀菌Fusariumavenaceum。

经过遗传工程改造的微生物包括重组酿酒酵母S.cerevisiae、重组运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis，以及重组大肠杆菌Escherichiacoli。重组酿酒酵母S.cerevisiae是通过真菌的木糖转运酶在酿酒酵母中进行表达，选择木糖异构酶（XI）途径或木糖还原-木糖醇氧化途径（XR-XDH）进行木酮糖转化，并将磷酸戊糖下游代谢路径进行修饰以强化木糖代谢转化乙醇的能力，可利用的酿酒酵母菌记载在专利WO9742307A、WO9513362A、US20110027847、CN1966694A、CN101205525A所公开的菌株；对运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis改造可将E.coli的xylA(木糖异构酶基因)、xylB(木酮糖激酶基因)、talB(转酮醇酶基因)、tktA(转醛醇酶基因)导入到Z.mobilis中，例如专利US5843760、US5514583、WO200851348A、WO200958927A、WO200944868A或WO200958938A；将含有PET操纵子（携带运动发酵单胞菌丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因）的质粒转化到E.coli菌株可以使重组E.coli的已糖和戊糖代谢形成的中心代谢物—丙酮酸转向乙醇生产，例如专利CN101875912A中所报道的菌株。在本发明的优选实施例中，优选的C5/C6共发酵微生物选自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis和/或大肠杆菌E.coli，特别优选为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae、运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis。

（4）分离发酵液获得乙醇

在本申请的一个实施方式中，从发酵液中分离乙醇可以采用本领域已知的常规方法，例如采用蒸馏，可采用本领域中所描述的常规蒸馏设备，例如具有双流塔板和横流塔板的蒸馏塔。然而，因为发酵含酒精产物的高悬浮固体含量，一般来说，双流筛塔板或横流阀塔板是优选的。在各种优选的实施方案中，包括横流阀塔板的塔是优选的，因为通过横流阀塔板往往提供更高的极限负荷比和更高的效率。

本发明所述的从生物质发酵生产乙醇的方法解决了预处理后的物料纤维结构打开程度不高，半纤维素回收率较低的缺陷，同时减少了高温处理后的物料产生的较多抑制物，能够使木糖的利用率和总糖的转化率达到70%以上，发酵后发酵液中含有乙醇的浓度在50g/l左右，有利于实现大规模的纤维素乙醇发酵生产。

附图说明

图1描述了在原料输送步骤喷淋酸的生物质的预处理方法；

图2描述了含有酸混合步骤生物质的预处理方法；

图3描述了利用生物质制备获得生物乙醇的方法。

具体实施方式

实施例1生物质的预处理方法1

步骤（1）将纤维素原料破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

步骤（2）在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量0.5%的稀释硫酸溶液，进入酸混合容器混合后得到酸性纤维素原料；

步骤（3）步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPaG的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在5±0.2min，然后通过连续泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面。

实施例2生物质的预处理方法2

步骤（1）将纤维素原料破碎为粒度为10-100mm的颗粒，进行水或酸的混合湿润后，将原料进入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

步骤（2）在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中喷淋混入其质量5%的稀释硫酸溶液，进入酸混合容器混合后得到酸性纤维素原料；

步骤（3）步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与1MPa的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在2±0.2min，然后通过连续泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面，这样得到的就是纤维素原料预处理物料，其通过此方法处理后能便于后序的降解处理。

实施例3生物质的预处理方法3

步骤（1）将纤维素原料破碎为粒度为10-100mm的颗粒，向纤维素原料中喷淋混入其质量2%的稀释硫酸溶液，将原料进入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞；

步骤（2）进入酸混合容器混合后得到酸性纤维素原料；

步骤（3）步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.5-0.8MPaG的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在10±0.2min，然后通过间隔时间2-20s的间歇泄压排放的方式排出容器。

实施例4生物质的预处理方法（对照）

步骤（1）将纤维素原料破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将纤维素原料中浸泡在浓度2%的稀H2SO4溶液中，搅拌40min，进行间歇式蒸汽爆破，所述间歇式蒸汽爆破的条件为在195℃下以1.6兆帕的压力维持5min，然后泄压，生成产物。

实施例5生物质预处理后的实验结果

	纤维素转化率	纤维素收率	半纤维素收率
				实施例1	90.6%	91.3%	83.5%
实施例2	88.5%	92.4%	84.5%
				实施例3	91.8%	90.2%	80.5%
实施例4	89.0%	84.9%	66.4%

实施例6酿酒酵母扩培发酵乙醇实验

菌种：重组酿酒酵母S.cerevisiae424A(LNH-ST)，（如CellulosicethanolproductionfromAFEX-treatedcornstoverusingSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST),M.W.Lau,B.E.Dale,ProcNatlAcadSciUSA,106(2009),pp.1368-1373；Two-stepSSCFtoconvertAFEX-treatedswitchgrasstoethanolusingcommercialenzymesandSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST),M.Jin,M.W.Lau,V.Balan,B.E.Dale,BioresourTechnol,101(2010),pp.8171–8178等报道）

扩培培养基：

（1）采用木质纤维素原料酶解液扩培培养基：其中含有用水稀释至30wt%木质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40%）15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素；

（2）采用4%葡萄糖扩培培养基：其中含葡萄糖4wt%，玉米浆（干物质含量40%）15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素；

（3）采用玉米糖化醪扩培培养基：含玉米糖化醪4wt%，灭菌后加入3g/L尿素；

发酵培养基均采用均采用木质纤维素原料酶解液进行发酵，含有用水稀释至30wt%木质纤维素原料酶解液、玉米浆（干物质含量40wt%）7.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L，(NH₄)₂HPO₄2g/L，发酵开始前调节pH为6.0；

发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养14h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的摇瓶中，扩培温度30°C，转速200rpm，培养时间12-14h，以10%的接种量接入发酵摇瓶中，发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。

实施例7运动发酵单胞菌二级发酵试验

菌种：运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis，在Z.mobilis中同时表达E.coli的木糖异构酶基因(xylA)、木酮糖激酶基因(xylB)、转醛酶基因(tal)、转酮酶基因(tktA)，将上述基因分为2组，即xylA和xylB,tal和tktA，组成2个操纵子,分别置于Z.mobilis自身的3-P-甘油醛脱氢酶启动子和烯醇酶启动子下,并将这2个操纵子构建成1个质粒。

扩培培养基：4%葡萄糖扩培培养基，含有葡萄糖含量4%（质量百分比）、玉米浆（40%干固含量）15g/L、KH₂PO₄1.5g/L、(NH₄)₂HPO₄1.5g/L；去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合，加入3g/L尿素。

发酵培养基：葡萄糖10wt%、木糖10wt%、玉米浆7.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L、(NH₄)₂HPO₄2g/L，去离子水或软化水配置溶液，分装灭菌，冷却后混合。

发酵方法：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种至YEPD培养基，培养20h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，按接种量5%接种到含有扩培培养基的发酵罐中，扩培温度37°C，转速200rpm，培养时间16h，第一级菌体5%接种至二级扩培培养基培养，扩培温度37°C，转速200rpm，扩培结束接种至含有发酵培养基的发酵摇瓶中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度以及残留葡萄糖和木糖含量。

实施例6-7扩培发酵的实验结果

实施例8酿酒酵母发酵玉米秸秆制备乙醇实验

预处理：

步骤（1）：将玉米秸秆破碎为粒度为10-100mm的颗粒，将原料投入螺旋喂料器，对其进行挤压脱水至干物20%-50%，形成致密的料塞，在保证纤维素原料不断进入处理容器的同时还能抵御容器内的蒸汽外泄；

步骤（2）：在步骤1中形成的料塞从螺旋喂料器处理后，向纤维素原料中混入其质量2%的稀释硫酸溶液，进入酸混合罐混合后得到酸性纤维素原料；

步骤（3）：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPa(G)的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面。

酶解：

步骤（4）：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合搅拌72h，得到酶解液。

发酵：

步骤（5）：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种YEPD培养基，培养14h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，按接种量5%，将菌体接至50L扩培发酵罐中，14h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至500L发酵罐中扩培16h，扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，之后移至5立方扩培发酵罐中，16h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至30立方发酵罐中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度。一级和二级发酵采用实施6（1）中培养基，三级发酵采用实施例6（3）中培养基，发酵培养基采用实施例6中培养基。

分离：

分离发酵液，精馏获得乙醇。

实施例9酿酒酵母发酵玉米秸秆制备乙醇实验（四级扩培）

预处理：

步骤（3）：步骤2中的酸性纤维素原料在蒸煮处理容器中，与0.6MPaG的低压蒸汽接触进行处理，处理时间在15-25min之间，然后按照一定频率间歇泄压排放的方式排出容器，此过程可以打开纤维素原料的结构，使半纤维素部分降解，部分纤维素裸露在表面。

酶解：

步骤（4）：将生物质处理产物水洗，调节pH值为5.0，加热至50℃后，以每克产物的干重计，加入20-50滤纸酶活力单位的纤维素酶计算，挤入纤维素酶(诺维信有限公司提供)，并在50℃下保温混合72h，得到酶解液。

发酵：

步骤（5）：配制YEPD培养基，将酵母菌体接种YEPD培养基，培养20h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，按接种量5%，接种至50L扩培罐，14h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至500L扩培罐中扩培14h，扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至5立方扩培罐，16h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至30立方扩培罐，16h扩培至（0.2-0.3）×10⁹/ml，移至100立方发酵罐中发酵72h，获得发酵产物，检测乙醇浓度。一级和二级发酵采用实施6（1）中培养基，三级和四级发酵采用实施例6（3）中培养基，发酵培养基采用实施例6中培养基。

分离：分离发酵液，精馏获得乙醇。

Claims

1.一种发酵生物质制备乙醇的方法，该方法的步骤为：(1)预处理：原料破碎、原料输送、酸液混合、蒸煮、减压的步骤，其中以喷淋形式将原料与酸或酸酐接触，原料破碎步骤中将生物质破碎为长度为15cm以下的颗粒，原料输送过程中对原料脱水至干物的10-60wt％，以重量百分比计；酸或酸酐的浓度为0.1％-15wt％，蒸煮步骤中通入0.5-2MpaG的水蒸汽，蒸煮的时间为1-30min；(2)酶解：将预处理后的产物酶解；(3)发酵：采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h/ml，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至酶解液中发酵24-72h；(4)分离发酵液获得乙醇，其中，C5/C6共发酵微生物为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae或运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis，生物质为玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、报纸、柳枝、燕麦壳中的一种或两种以上组合，酶解步骤中使用的酶为纤维素酶，原料输送步骤采用螺旋喂料器或螺杆挤出机，喷淋酸性溶液或酸酣步骤在原料经螺旋喂料器或螺杆挤出机处理后进行；所述的扩大培养的培养基为按重量百分比含有葡萄糖1-25％和木糖1-10％的木质纤维素原料酶解液。

2.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的原料破碎步骤中将生物质破碎为10-100mm的颗粒。

3.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的原料输送过程中对原料脱水至干物的20-50wt％，以重量百分比计。

4.权利要求3所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的原料输送过程中对原料脱水至干物的25-45wt％，以重量百分比计。

5.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的酸或酸酐为硫酸、盐酸或乙酸酐的一种或两种以上。

6.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的酸或酸酐的浓度为0.5-10wt％。

7.权利要求6所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的酸或酸酐的浓度为0.5-5wt％。

8.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的蒸煮步骤中通入0.5-1MpaG的水蒸汽。

9.权利要求8所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的蒸煮步骤中通入0.6-0.8MpaG的水蒸汽。

10.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的蒸煮步骤中蒸煮的时间为2-20min。

11.权利要求10所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的蒸煮步骤中蒸煮的时间为2-10min。

12.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的减压步骤采用连续或间歇泄压排放的方式排出。

13.权利要求12所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述间歇泄压排放间隔时间为1-20s。

14.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于喷淋的酸或酸酐与生物质原料的比例是1:10-100。

15.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于发酵步骤酶解液中还加入黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉或酵母膏一种或几种，含量为5-10g/L。

16.权利要求15所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于发酵步骤酶解液中还加入玉米浆。

17.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于发酵步骤酶解液中还加入无机盐，所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种，无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。

18.权利要求17所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的无机盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二铵。

19.权利要求1-18任意项所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于步骤(4)发酵中扩大培养采用二级扩大培养、三级扩大培养或四级扩大培养。

20.权利要求19所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于采用三级扩大培养：种子培养基培养后，接种5-20％的微生物至50L扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml，移至5立方扩培罐中，12-24h扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml。

21.权利要求20所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于采用四级扩培，种子培养基培养后，接种5-20％的微生物至50L扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml，之后移至500L扩培罐中扩培12-24h，扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml，移至5立方扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml，移至30立方扩培罐，12-24h扩培至(0.1-0.5)×10⁹/ml。

22.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的步骤(4)发酵中扩大培养的培养基中还含有黄豆饼粉、玉米饼粉、玉米浆、鱼粉、蛋白胨和/或酵母膏中的一种或几种，其含量为5-10g/L。

23.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的步骤(4)发酵中扩大培养的培养基中还含有尿素和/或无机盐，所述的尿素的含量为2-5g/L，所述的无机盐在发酵液中的含量为0.5-4g/L。

24.权利要求23所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的无机盐选自磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵中的一种或几种。

25.权利要求24所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在所述的无机盐为1.5g/L磷酸二氢钾和1.5g/L磷酸氢二铵。

26.权利要求1所述的发酵生物质制备乙醇的方法，其特征在于所述的步骤(4)发酵中扩大培养pH值为pH4-6.5。

27.一种发酵生物质制备乙醇的方法，该方法的步骤为：(1)预处理：原料破碎、通过螺旋喂料器输送原料，原料通过螺旋喂料器，对原料脱水至干物的10-60wt％，以重量百分比计，喷淋入浓度为0.5％-10wt％的酸性溶液或酸酣，将原料与酸性溶液或酸酐混合，通入蒸汽蒸煮，然后通过减压排放的方式排除；(2)酶解：将预处理后的产物酶解；(3)发酵：采用种子培养基将C5/C6共发酵微生物培养12-24h，接种扩大培养，将扩大培养后的微生物移至酶解液中发酵24-72h；(4)分离发酵液获得乙醇，其中，C5/C6共发酵微生物为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae或运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis，生物质为玉米秸秆、玉米芯、硬木、软木、坚果壳、草、纸、大麦秆、小麦杆、树叶、棉籽絮、报纸、柳枝、燕麦壳中的一种或两种以上组合，酶解步骤中使用的酶为纤维素酶，原料输送步骤采用螺旋喂料器或螺杆挤出机，喷淋酸性溶液或酸酣步骤在原料经螺旋喂料器或螺杆挤出机处理后进行。