CN103898114A

CN103898114A - 使用人工微rna下调基因表达

Info

Publication number: CN103898114A
Application number: CN201410102903.0A
Authority: CN
Inventors: B.麦戈尼格尔
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2008-12-17
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2028-12-17
Also published as: US8536405B2; US20120115234A1; CA2709333C; US8115055B2; CA2895044A1; CA2894910A1; US8415526B2; CN103898114B; RU2492239C2; US20120329159A1; US20120107939A1; CA2895049C; EP2222858B1; EP2573180A2; RU2013126413A; EP2573180B1; EP2573181B1; EP2573182A2; CA2709333A1; CA2895049A1

Abstract

本发明涉及使用人工微RNA下调基因表达。具体地，本发明描述了包含前体miRNA分离的核酸片段、人工miRNA以及它们在下调基因表达中的用途。

Description

使用人工微RNA下调基因表达

本申请是申请日为2008年12月17日的中国专利申请200880121660.8“使用人工微RNA下调基因表达”的分案申请。

本申请要求于2007年12月18日提交的第61/014,510号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容全文引入本文以供参考。

技术领域

本发明的领域一般涉及植物分子生物学。具体地讲，它涉及下调靶序列表达的构建体和方法。

背景技术

微RNA(miRNA)仅仅在几年前被首次鉴定出来，但是已清楚的是，它们在调节基因活性中起重要作用。这些20-22核苷酸非编码RNA能够经由碱基配对与特异性靶mRNA杂交，并且通过介导RNA裂解或翻译阻抑来下调这些转录物的表达。

最近的研究已经表明，miRNA在发育期间具有重要功能。在植物中，已经表明他们控制多个发育过程，包括开花时间、叶子形态学、器官极性、花形态学以及根发育(综述于Mallory和Vaucheret(2006)NatGenet38：S31-36中)。由于miRNA的确定的调节作用，他们有可能还参与某些主要作物特征例如抗旱性和抗病性。

miRNA被RNA聚合酶II转录成聚腺苷酸化的和加帽的信使，称为pri-miRNA。将这些pri-miRNA加工成更小的转录物，称为pre-miRNA，这些前体具有形成稳定的发夹结构的能力(参见Bartel(2004)Cell116：281-297；Jones-Rhoades MW，Bartel DP，Bartel B.MicroRNAS and theirregulatory roles in plants.Annu Rev Plant Bio1.2006；57：19-53。)虽然在后生动物中，pri-miRNA在细胞核中通过Drosha被加工成pre-miRNA，并且在细胞质中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟与动物中的途径不同，因为植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在发夹加工中的已知功能以外，与Dicer同源的RNase III酶DICER-LIKE1(DCL1)还可具有Drosha功能(Kurihara和Watanabe(2004)Proc NatlAcad Sci101：12753-12758)。

最近已经在拟南芥靶向病毒mRNA序列(Niu等人(2006)NatureBiotechnology24：1420-1428)或内源基因(Schwab等人(2006)Plant Cell18：1121-1133)中描述了人工微RNA(amiRNA)。为了改变沉默的空间模式，可在不同启动子下表达amiRNA构建体(Schwab等人(2006)Plant Cell18：1121-1133)。人工miRNA置换微RNA及其在前体miRNA中的互补星状序列并替代靶向将被沉默的mRNA的序列。内源miRNA导致的沉默可见于多种空间上的、时间上的、和发育表达上的模式中(Parizotto等人(2007)Genes Dev18：2237-2242；Alvarez等人(2006)Plant Cell18：1134-51)。可构建人工miRNA以收集和扩展沉默模式的多样性和特异性。迄今仍无在作物植物中使用amiRNA的报道。

公布于2004年1月29日的WO2004/009779描述了用于在植物中调节基因表达的组合物和方法。

申请人的受让人的美国专利申请公布2005/0138689公布于2005年6月23日，描述了miRNa以及它们沉默靶序列的作用。

序列表简述

根据以下的详细描述以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和序列表形成本申请的一部分。

序列描述概要说明了后附的序列列表。此序列列表中以单个字母表示核苷酸，以单独的3字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal219(2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB标准中所规定的。

SEQ ID NO：1-10对应于用于扩增玉米基因组微RNA(miRNA)前体的引物。

SEQ ID NO：11-15分别对应于159c、164h、168a、169r、和396h的玉米miRNA前体序列。

SEQ ID NO：16对应于人工miRNA(amiRNA)序列，该序列用于沉默玉米八氢番茄红素去饱和酶(PDS)转录。

SEQ ID NO：17-21分别对应于159c-PDS、164h-PDS、168a-PDS、169r-PDS、和396h-PDS的amiRNA前体包含的“星状序列”。星状序列主要是miRNA前体中的互补序列，miRNA前体与miRNA形成双链。

SEO ID NO：22-26分别对应于159c-PDS、164h-PDS、168a-PDS、169r-PDS、和396h-PDS的amiRNA前体。这些前体当在玉米中表达时导致内源PDS转录的沉默。

SEQ ID NO：27-30分别对应于截短的amiRNA前体169r-PDS-sht、169r-PDS-med、396h-PDS-sht、和396-PDS-med。与169r-PDS相比，将169r-PDS前体(SEQ ID NO：25)截短了其长度的11％(169r-PDS-sht，SEQ ID NO：27)和其长度的35％(169r-PDS-med，SEQ ID NO：28)。与396h-PDS相比，将396h-PDS前体(SEQ ID NO：26)截短了其长度的18％(396h-PDS-sht，SEQ ID NO：29)和其长度的46％(396h-PDS-med，SEQID NO：30)。所有截短的前体包含miRNA和星状序列。

SEQ ID NO：31-34分别对应于159c-FAD、168a-FAD、169r-FAD、和396h-FAD的amiRNA前体。这些前体当在玉米中表达时导致内源fad2-1(负责将油酸转化成亚油酸的脂肪酸去饱和酶)转录的沉默。

SEQ ID NO：35-38对应于致死叶斑病的miRNA靶和星状序列。

SEQ ID NO：39-41对应于多药耐药性蛋白的miRNA靶和星状序列，该蛋白是一种转运蛋白。

SEQ ID NO：42-43分别对应于168a-MRP和396h-MRP的amiRNA前体序列。这些前体当在玉米中表达时导致MRP沉默，MRP导致植酸含量减少。

发明内容

本发明涉及包含前体miRNA的分离的核酸片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：11所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQID NO：11的核苷酸430至450被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：11的核苷酸244至264被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交。

受关注的其它分离的核酸片段也包括以下片段：

a)包含前体miRNA的分离的核酸片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：12所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQ IDNO：12的核苷酸94至114被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：12的核苷酸163至183被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交；

b)包含前体miRNA的分离的核酸片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：13所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQ IDNO：13的核苷酸53至73被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：13的核苷酸97至117被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交；

c)包含前体miRNA的分离的核酸片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：14所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQ IDNO：14的核苷酸110至130被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：14的核苷酸184至203被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交；以及

d)包含前体miRNA的分离的核酸片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：15所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQ IDNO：15的核苷酸83至103被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：15的核苷酸172至192被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交。

可将这些分离的核酸片段中的任何一种用于制备重组构建体，所示重组构建体包含这些可操作地连接至至少一个调控序列的分离核酸片段。

可将这些构建体转化到植物细胞中以便转化的植物细胞在其基因组中包含重组构建体。

在另一方面，本发明涉及减少靶基因在植物细胞中表达的方法，所述方法包括：

(a)用包含任何一种本文所述分离的核酸片段的核酸构建体转化至少一种植物细胞；以及

(b)选择那些转化的植物细胞，其靶序列的表达水平在与野生型植物细胞中的靶基因的表达水平进行比较时减少。

具体实施方式

与本申请有关的信息可参见于2004年10月12日提交的美国专利申请10/963,238和10/963，394。上述专利申请全文引入本文以供参考。

可用于理解本发明的其他参考文献包括于2004年7月1日提交的美国专利申请10/883，374；于2004年8月6日提交的美国专利申请10/913，288；和于2006年1月6日提交的美国专利申请11/334,776。

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。

如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一种细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

在此公开的上下文中使用了许多术语和缩写。给出了如下定义。

“微RNA或miRNA”指寡核糖核酸，它调控包含靶序列的多核苷酸的表达。微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8582001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-7392002；Lau等人，Science294：858-8622001；Lee和Ambros，Science294：862-8642001；Llave等人，Plant Cell14：1605-16192002；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-7282002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-16262002)，它调控包含靶序列的多核苷酸的表达。它们由更长的前体转录物加工得到，前体转录物的大小在大约70至2000nt的范围内或者更长，并且这些前体转录物具有形成稳定的发夹结构的能力。在动物中，涉及miRNA前体加工的酶称为Dicer，这是一种RNAse III-样蛋白(Grishok等人，Cell106：23-342001；Hutvagner等人，Science293：834-8382001；Ketting等人，Genes.偏差(Dev.)15：2654-26592001)。植物也具有Dicer-样酶，DCL1(以前称为CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近的证据表明，其象Dicer一样也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-16262002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可以存在几个不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8582001；Lee等人，EMBO J21：4663-46702002)。最近的研究还测定了从dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell115：199-208)。似乎所加工的dsRNA的两个末端的稳定性(即G：Cvs.A：U含量，和/或错配)影响链选择，低稳定性末端更易于通过解旋酶解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。

“pri-miRNA”或“初级miRNA”是由RNA聚合酶II转录得到的长的、聚腺苷酸化的RNA，它编码miRNA。“pre-miRNA”是已经进行了加工以形成较短序列的初级miRNA，该较短序列的RNA具有形成稳定的发夹结构的能力，并且可被进一步加工以释放miRNA。在植物中由dicerlike进行两个加工步骤，因此在功能上区别“pri-miRNA”和“pre-miRNA”是困难的。因此，本文将前体miRNA或初级miRNA在功能上定义为能够产生miRNA的核苷酸序列。根据该功能定义，以及根据本文实施例和讨论，这一点将是清楚的：前体miRNA、初级miRNA和/或本发明的miRNA能以“基本上对应于”前体miRNA、初级miRNA和/或miRNA的核糖核酸或脱氧核糖核酸的形式表示。应当理解，以其双链形式存在的DNA将包含一个能够被转录成所述miRNA前体的链。描述了具有miRNA的表达构建体、重组DNA构建体、和转基因生物，该miRNA编码导致所述miRNA前体表达的DNA。

“可变核苷酸亚序列”是指置换一部分pre-miRNA序列的一部分核苷酸序列，前提条件是该亚序列不同于被置换的序列，即，它不能是相同的序列。

“靶基因”指编码靶RNA的基因，即，从其中转录靶RNA的基因。该基因可编码mRNA、tRNA、小RNA等。

“靶基因”指其表达将被调节(例如下调)的RNA。靶序列可以是一部分开放阅读框、5’或3’非翻译区域、外显子、内含子、侧接区域等。

“星状序列”是miRNA前体中的互补序列，miRNA前体与miRNA形成双链。星状序列的互补序列不需要是完全互补序列。有时存在非螺旋的中断取代(即G：T碱基配对等)以及1-3个错配。

术语“基因组”是指：(1)存在于生物体的每一个细胞或者病毒或细胞器中的全套遗传物质(基因和非编码序列)；(2)作为(单倍体)单位从一个亲本遗传的全套染色体。

“子代”包括植物的任何后续世代。后代将从其亲本植物遗传并且稳定地分离基因和转基因。

单位、前缀和符号可以以其SI接受的形式表示。除非另外说明，核酸是以5′到3′方向从左往右写；氨基酸序列分别是以氨基到羧基方向从左往右写。本说明书中提及的数值范围包括限定该范围的数字，并且包括在该限定范围内的每一个整数。在本文中氨基酸可用通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可以用其通常接受的单字母代码表示。除非另有说明，在本文中使用的软件、电和电子术语是如在The New IEEEStandard Dictionary of Electrical and Electronics Terms(第5版，1993)中所定义的。把说明书作为一个整体时，下面定义的术语就定义得更全面。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如嵌合构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本发明任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传元件。技术人员也将认识到不同的独立转化事件将导致不同水平和不同模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics218：78-86(1989))，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。这样的筛选可以通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的免疫印迹分析或表型分析等完成。

该构建体可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修饰核苷酸的任何组合。构建体可以转录以形成RNA，其中RNA可以能够形成双链RNA和/或发夹结构。构建体可以在细胞中表达，或者分离，或者合成制得。构建体还可以包含启动子或帮助构建体操作或表达的其他序列。

本文所用″阻抑“或”沉默″或“抑制”可互换使用，是指相对于野生型生物体中其正常表达水平，靶序列的产物表达的下调。抑制包括，相对于野生型表达水平，表达降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

本文所用术语“编码”是指可被加工以产生RNA和/或多肽的DNA序列。

本文所用术语“表达”是指产生功能产物，例如由导入的构建体、内源DNA序列或稳定导入的异源DNA序列产生RNA转录物。该术语还可以指由产生自任何上述DNA前体的mRNA产生多肽。因此，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(例如生成mRNA或其他功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白(多肽)。

本文在序列方面所用的“异源”是指，源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，通过人为介入而从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面显著修饰的序列。例如，对于核酸，其可以是源自外来物种的核酸，或者是合成设计的核酸，或者，如果源自相同物种，通过人为介入而从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面显著修饰的核酸。异源蛋白可以源自外来物种，或者，如果源自相同物种，通过人为介入而从其起源形式显著修饰。

术语“宿主细胞”是指含有或者其中导入核酸构建体，并且支持该构建体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞例如真菌、酵母、昆虫、两栖动物、线虫或哺乳动物细胞。或者，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞。单子叶植物宿主细胞的一个实例是玉米宿主细胞。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

术语“植物部分”包括分化和未分化的组织，包括但不限于下列部分：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的细胞和培养物(例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可存在于植株或植物器官、组织或细胞培养物中。

术语“植物器官”是指构成植株的形态和功能不同部分的植物组织或组织群。

术语“导入”是指将核酸(例如表达构建体)或蛋白提供至细胞中。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可以整合进细胞的基因组内，以及包括指将核酸或蛋白暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或暂时性的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。

在应用于植物细胞时，术语“基因组”不仅包括在细胞核内发现的染色体DNA，而且还包括在细胞的亚细胞成分(例如线粒体、质体)内发现的细胞器DNA。

术语“分离的”是指材料例如核酸或蛋白，其：(1)基本上或本质上不含通常伴随在其天然存在环境中发现的材料或者与在其天然存在环境中发现的材料相互作用的成分，或者(2)如果材料在其天然环境中，则已经通过人为介入改变了材料的组成和/或在细胞基因座上放置了不是该材料的天然基因座的基因座。

本文所用的“结构域”或“功能结构域”是指能够引起植物中的生物反应的核酸序列。本发明涉及由单独起作用或者与其他miRNA序列协同起作用的至少21核苷酸序列组成的miRNA。由此，结构域可以指个体miRNA或miRNA群。而且，与其骨架序列有关的miRNA序列可以被认为是用于将miRNA加工成其活性形式的结构域。本文所用的“亚结构域”或“亚功能结构域”是指能够引起植物中的生物反应的结构域的亚序列。miRNA可以被认为是骨架序列的亚结构域。“邻接”序列或结构域是指顺序连接的，在结构域之间没有加入的核苷酸插入的序列。邻接结构域串的一个实例存在于SEQ ID NO：7957中，其代表作为连续串的SEQ ID NO：1-2652，据信该连续串可以是以顺序串联而连接在一起的2652miRNA序列。

RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守的细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共享(Fire等人,Trends Genet.15：3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。

细胞中长dsRNA的存在刺激称为“dicer”的核糖核酸酶III酶的活性。Dicer参与dsRNA加工成称为短干扰性RNA(siRNA)的dsRNA的短片段(Berstein等人.，Nature409：3632001)和/或pre miRNA加工成miRNA。源自dicer活性的短干扰性RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对双链体(Elbashir等人,Genes Dev.15：1882001)。还有人提出Dicer参与从保守结构的前体RNA上切下21-和22-核苷酸小的时序RNA(stRNA)，所述小的时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science293：834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人，Genes Dev.15：1882001)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(例如微RNA或miRNA)介导的基因沉默，假定是经由调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见，例如，Allshire，Science297：1818-18192002；Volpe等人，Science297：1833-18372002；Jenuwein，Science297：2215-22182002；和Hall等人，Science297：2232-22372002)。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。

已经在多种系统中研究了RNAi。(Nature391：8061998)首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature CellBiol.2：701999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature404：2932000)描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人，(Nature411：4942001)描述了通过在包括人胚胎肾和HeLa细胞的培养的哺乳动物细胞中导入合成21-核苷酸RNA的双链体而诱导的RNAi。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8582001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-7392002；Lau等人，Science294：858-8622001；Lee和Ambros，Science294：862-8642001；Llave等人，Plant Cell14：1605-16192002；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-7282002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-16262002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及miRNA前体加工的酶称为Dicer，这是一种RNAse III-样蛋白(Grishok等人，Cell106：23-342001；Hutvagner等人，Science293：834-8382001；Ketting等人，Genes.偏差(Dev.)15：2654-26592001)。植物也具有Dicer-样酶，DCL1(以前称为CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近的证据表明，其象Dicer一样也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-16262002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可以存在几个不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8582001；Lee等人，EMBO J21：4663-46702002)。最近的研究还测定了从dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell115：199-208)。似乎所加工的dsRNA的两个末端的稳定性(即G：Cvs.A：U含量，和/或错配)影响链选择，低稳定性末端更易于通过解旋酶解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。

在动物中，有直接的证据表明特异性miRNA在发育中的作用。基于当产生lin-4和let-7miRNA的基因突变时所产生的表型，已经发现，秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的lin-4和let-7miRNA控制时序发育(Lee等人，Cell75：843-8541993；Reinhart等人，Nature403-901-9062000)。此外，这两种miRNA都表现出与其在发育定时中的作用一致的时序表达模式。其他动物miRNA表现出发育调节的表达模式，是时序和组织特异性的(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8532001，Lagos-Quintana等人，Curr.Bio1.12：735-7392002；Lau等人，Science294：858-8622001；Lee和Ambros，Science294：862-8642001)，导致这样的假设，在很多情况下，miRNA可能涉及重要发育过程的调节。同样，在植物中，很多miRNA的差异表达模式意味着其在发育中的作用(Llave等人，Plant Cell14：1605-16192002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-16262002)。然而，miRNA的发育作用尚未在植物中直接证实，因为迄今为止没有关于特异性植物miRNA相关发育表型的报道。

微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。对于lin-4和let-7，靶位点位于靶mRNA的3′UTR中(Lee等人，Cell75：843-8541993；Wightman等人，Cell75：855-8621993；Reinhart等人，Nature403：901-9062000；Slack等人，Mo1.Cell5：659-6692000)，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。结合lin-4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA编码的蛋白的稳态水平的下调，而不影响自身的转录物(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-6801999)。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解(Hutvagner和Zamore，Science297：2056-20602002；Llave等人，Plant Cell14：1605-16192002)。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：蛋白下调和RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA掺入了RNA诱导沉默复合物(RISC)，该复合物与RNAi相似或相同。

该分离的核酸片段包含前体miRNA，也可称为“miRNA主链”。本领域的技术人员熟知区分转录物是全长pri-miRNA或是pre-miRNA是困难的。因此，将前体miRNA功能定义为能够生产miRNA的核苷酸序列。

受关注的其它分离的核酸片段包括以下片段；

a)从包含前体miRNA的分离的核酸片段转录得到的片段，所述前体miRNA基本上对应于如SEQ ID NO：12所示的脱氧核糖核苷酸序列(i)其中SEQ ID NO：12的核苷酸94至114被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，该第一可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，以及(ii)进一步地，其中SEQ ID NO：12的核苷酸163至183被第二可变核苷酸亚序列置换，该第二可变核苷酸亚序列的大小在约19至约30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与前体miRNA的第一个可变亚序列杂交；

可将这些构建体转化到植物细胞中以便转化的植物细胞在其基因组中包含重组构建体。优选地植物细胞可以是单子叶植物植物细胞。单子叶植物细胞的实例包括但不限于玉米、高梁、小麦、大米、燕麦、裸麦、大麦、甘蔗、小米、竹子、香蕉和兰花

最优选的单子叶植物细胞是玉米。

在另一方面，本发明涉及减少靶序列在植物细胞中表达的方法，所述方法包括：

(b)选择那些转化的植物细胞，其靶序列的表达水平在与野生型植物细胞中的靶序列表达水平进行比较时减少。

生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，Plant Cell14：1605-16192002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-14952002；Rhoades等人，Cell110：513-5202002)，因此，似乎植物miRNA与其推定靶的整个互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。

所关注序列的一般种类包括例如涉及调节或信息的基因，例如锌指、转录因子、同源异型基因，或细胞周期和细胞死亡调节剂例如激酶，以及涉及持家的基因，例如热激蛋白。

靶序列可包括编码区和非编码区如启动子、增强子、终止子、内含子等。

靶序列可以是内源性序列，或者可以是导入的异源序列或转基因。本发明方法可用于改变转基因的调节或表达，或用于除去转基因或其他导入的序列例如导入的位点特异性重组位点。靶序列还可以是来自病原体的序列，例如，靶序列可以来自植物病原体例如病毒、霉菌或真菌，昆虫或线虫。miRNA可以在植物中表达，这样在感染或侵染之后，植物将靶向病原体并且给植物赋予一定程度的抗性。

在植物中，靶序列的其他种类包括影响农学特征、抗昆虫性、抗病性、抗除草剂性、不育、谷粒特征和商品的基因。所关注基因应当还包括涉及油、淀粉、糖类或营养物代谢的那些，以及影响例如种仁大小、蔗糖载量等的那些。谷粒质量在特征中反应，例如油的水平和类型，饱和与不饱和，必需氨基酸的质量和量，以及纤维素水平。例如，可抑制植酸生物合成途径的基因以产生高可利用磷表型。参见例如在WO02/059324中公开的植酸生物合成酶，包括肌醇多磷酸激酶-2多核苷酸，在WO03/027243中公开的肌醇1，3，4-三磷酸5/6-激酶多核苷酸，以及在WO99/05298中公开的肌醇1-磷酸合成酶和其他植酸生物合成多核苷酸，所有这些专利都引入本文以供参考。可抑制木质化途径中的基因来提高消化性或能量利用率。可抑制影响细胞周期或细胞死亡的基因来抑制生长或应激反应。可抑制影响DNA复制和/或重组的基因以提高遗传变异性。可抑制影响开花时间的基因以及影响能育性的基因。可抑制任何靶序列以评估或证实其在特定特征或表型中的作用，或切开分子、调节、生化或蛋白组学(proteomic)途径或网络。

可使用多种启动子。能基于所需结果选择这些启动子。应当认识到，通过在植物表达盒中使用不同启动子来提高不同应用，以调节miRNA表达的时间、位置和/或水平。如果需要的话，这样的植物表达盒可以含有启动子调节区(例如赋予诱导型、组成型、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性/选择性表达的调节区)，转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。

可以采用组成型、组织优先型或诱导型启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，源自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′-启动子，遍在蛋白1启动子，Smas启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)，Nos启动子，pEmu启动子，rubiSco启动子，GRP1-8启动子，以及来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。如果需要低水平的表达，可以使用弱启动子。弱组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子(WO99/43838和美国专利6,072,050)，核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括例如美国专利5,608，149；5,608，144；5,604，121；5,569,597；5,466,785；5，399,680；5,268,463；和5,608，142。还参见美国专利6，177,611，其引入本文以供参考。

诱导型启动子的是可以通过低氧或寒冷胁迫诱导的Adhl启动子，可通过热胁迫诱导的Hsp70启动子，PPDK启动子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)启动子，二者都是可通过光诱导的。还有用的启动子有，是可化学诱导的启动子，例如是安全剂诱导的In2-2启动子(美国专利5，364,780)，是雌激素诱导的ERE启动子，以及是植物生长素诱导的，并且是绒毡层(tapetum)特异性的，但是在愈伤组织中也有活性的Axigl启动子(PCT US01/22169)。

处于发育控制下的启动子的实例包括优先在一些组织例如叶、根、果实、种子或花中启动转录的启动子。示例性启动子是花药特异性启动子5126(美国专利5，689,049和5，689,051)。种子优先的启动子的实例包括但不限于27kD g玉米醇溶蛋白启动子和蜡状启动子，Boronat，A.等人(1986)Plant Sci.47：95-102；Reina，M.等人Nucl.Acids Res.18(21)：6426；和Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet.203：237-244。在胚芽、果皮和胚乳中表达的启动子公开在US专利6,225,529和PCT出版WO00/12733中。这些专利的公开内容全文引入本文以供参考。

在某些实施方案中，由诱导型启动子，特别是由病原体诱导型启动子表达基因是有益的。这样的启动子包括源自发病机理相关蛋白(PR蛋白)的那些，其是在被病原体感染后诱导的，所述蛋白是例如PR蛋白、SAR蛋白、b-1，3-葡聚糖酶，壳多糖酶等。参见例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。还参见WO99/43819，其引入本文以供参考。

所关注的启动子是在病原体感染部位或接近病原体感染部位局部表达的启动子。参见例如Marineau等人(1987)Plant Mol.Bio1.9：335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions2：325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：14972-14977。还参见Chen等人(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell1：961-968；美国专利5,750,386(线虫诱导型)；以及其中所引用的参考文献。特别关注的是有关玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)诱导的(参见例如Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。

此外，在病原体发现经由伤口或昆虫损害而找到进入植物的入口时，伤口诱导型启动子可用于多核苷酸的构建。这样的伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等人(1996)Nature Biotech.14：494-498)；wun1和wun2，美国专利5,428，148；win1和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；系统素(McGurl等人(1992)Science225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Lett.323：73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等，其引入本文以供参考。

化学调节的启动子可用于通过施用外来化学调节剂来调节基因在植物中的表达。根据这一目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质来诱导基因表达，或化学抑制型启动子，其中施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子，其是通过苯磺酰胺除草剂安全剂来激活的，玉米GST启动子，其是通过用作芽前除草剂的疏水亲电性化合物而激活的，以及烟草PR-1a启动子，其是通过水杨酸激活的。所关注的其他化学调节的启动子包括甾类化合物反应性启动子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)：247-257)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如Gatz等人(1991)Mo1.Gen.Genet.227：229-237，和美国专利5，814,618和5,789，156)，其引入本文以供参考。

组织优先的启动子可用于定向提高特定植物组织内的序列的表达。组织优先的启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)PlantCell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。如果需要的话，可修饰这样的启动子以进行弱表达。

叶优先的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。此外，可以使用cab和rubisco的启动子。参见例如Simpson等人(1958)EMBO J4：2723-2729和Timko等人(1988)Nature318：57-58。

根优先的启动子是已知的，并且可以选自文献中记载的很多启动子或者从不同相容物种中重新分离的启动子。参见例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP1.8基因的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人(1991)Plant Cell3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表达)。还参见Bogusz等人(1990)PlantCell2(7)：633-641，其中描述了两种根特异性启动子，它们是从得自固氮非豆科(nonlegume)Parasponia andersonii以及相关非固氮非豆科(nonlegume)山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的。将这些基因的启动子与β-葡糖醛酸酶报道基因连接，并且导入非豆科(nonlegume)烟草(Nicotiana tabacum)和豆科百脉根(Lotuscorniculatus)内，在这两种情况下，都保持了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的启动子的分析(参见PlantScience(Limerick)79(1)：69-76)。他们推断，增强子和组织特异性DNA决定子在这些启动子中解离。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以表明编码章鱼碱合酶的农杆菌属(Agrobacterium)菌T-DNA基因在根尖的表皮中具有特别活性，以及TR2′基因在完整植物中是根特异性的，并且通过叶组织中的伤害来刺激，这是用来与杀虫或杀幼虫基因一起使用的特别期望的特征组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因表现出类似特征。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mo1.Bio1.29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等人(1994)Plant Mo1.Bio1.25(4)：681-691。还参见美国专利5，837，876；5,750,386；5,633，363；5,459,252；5,401，836；5，110,732；和5,023，179。云扁豆蛋白(Murai等人(1983)Science23：476-482和Sengopta-Gopalen等人(1988)PNAS82：3320-3324。

转化方案以及用于将核苷酸序列导入植物内的方案可以根据被定向转化的植物或植物细胞的类型，例如单子叶植物或双子叶植物而改变。导入DNA构建体的合适的方法包括微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4：320-334；和美国专利6，300，543)，性杂交，电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-5606)，农杆菌属菌介导的转化(Townsend等人，美国专利5，563，055；和美国专利5，981，840)，直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722)，和弹道离子加速(参见例如Sanford等人，美国专利4，945，050；Tomes等人，美国专利5，879，918；Tomes等人，美国专利5，886，244；Bidney等人，美国专利5，932，782；Tomes等人(1995)“Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells via Microproj ectile Bombardment,”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等人(1988)Biotechnology6：923-926)。还参见Weissinget等人(1988)Ann.Rev.Genet.22：42l-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)P1ant Physio1.87：671-674(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；Tomes，美国专利5，240，855；Buising等人，美国专利5，322，783和5，324，646；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；Bowen等人，美国专利5，736，369(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)，The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9：415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports12：250-255和Christou和Ford(1995)Anbalsof Botany75：407-413(稻)；Osioda等人(1996)NatureBiotechnology14：745-750(经由根癌土壤杆菌的玉米)；和美国专利5,736,369(分生组织转化)，所有这些文献都引入本文以供参考。

可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来将核苷酸构建体导入植物内。通常，这样的方法包括将本发明的核苷酸构建体整合进入病毒DNA或RNA分子内。此外，应当认识到，有用的启动子包括用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将核苷酸构建体导入植物内并且表达其中编码的蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利公开5，889，191、5，889，190、5，866,785、5，589,367和5，316,931；这些专利引入本文以供参考。

在某些实施方案中，瞬时表达可能是期望的。在这些情况下，可使用标准瞬时转化技术。这样的方法包括但不限于病毒转化方法，和DNA或RNA的微注射，以及本领域众所周知的其他方法。

可根据常规方法，将得自已经稳定掺入核苷酸序列的植物的细胞生长成植物。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5：81-84。然后可让这些植物生长，并且用相同的转化株或不同的株授粉，所得杂交体具有所希望的表型特征的组成型表达，所述表型特征是由包含在靶位点或转移盒内的所关注核苷酸序列盒/或遗传标记赋予的。可以生长两代或多代以保证所希望的表型特征的表达稳定地保持和遗传，然后收获种子以保证所希望的表型特征的表达已经实现。

实施例

实施例1

分离基因组微RNA前体基因

如Zhang B等人所述(2006)FEBS Lett.580：3753-62)，使用编码玉米微RNA基因的序列作为查询序列进行BLAST分析，使用表达序列标记的Pioneer Unicorn6.0集合。在Unicorn6.0集合中大约30％的查询序列具有完全匹配。设计以下引物(购自MWG-BIOTECH Inc.)扩增在这些序列中选择的五个序列(参见表1)。

表1：用于扩增基因组微RNA前体的引物

引物	引物序列	序列标识号
			159cs	5’-ccatggcttttcatagcacctctatacctc-3’	1
159ca	5’-ggatccacgggcgctcgctgcacccagatcc-3’	2
			164hs	5’-ggatcctgcgaagctgagtgcagacgtccg-3’	3
164ha	5’-ccatgggtacgagggacgatgggattaggc-3’	4
			168as	5’-ggatccggttcgcgcggagggaaggagggag-3’	5
168aa	5’-ccatgggccaatcggctacttgatctcttcccc-3’	6
			169rs	5’-ggatccctccacacagagaagcaaagaaacc-3’	7
169ra	5’-ccatgggtaacctatcgtctattcattttg-3’	8
			396hs	5’-ggatccgtcccccagatttgctaggacacc-3’	9
396ha	5’-ccatggtgggcctgctactatgatgtttag-3’	10

159个有义引物(159cs，SEQ ID NO：1)包括编码Nco I位点的核苷酸。159个反义引物(159ca，SEQ ID NO：2)包括编码Bam HI位点的核苷酸。剩余的四个有义引物(SEQ ID NO：3、5、7、和9)包括编码Bam HI位点的核苷酸。剩余的四个反义引物(SEQ ID NO：4、6、8、和10)包括编码Nco I位点的核苷酸。

使玉米cv.B73种子发芽，并且使用Qiagen DNeasy Plant Maxi试剂盒，依照制造商的说明书从幼苗组织中提取基因组DNA。使用基因组DNA作模板，并且使用上文引物对以及ExTaq聚合酶(TaKaRa BioInc.)，扩增DNA产物。将所得DNA产物克隆到pCR2.1(Invitrogen)中并进行全长测序。所表征的微RNA前体在表2中概述。

表2：微RNA前体序列

微RNA前体	序列标识号	长度(nucs)
			159c	11	875
164h	12	780
			168a	13	791
169r	14	859
			396h	15	633

实施例2

设计人工微RNA序列

人工微RNA(amiRNA)将具有沉默玉米基因八青番茄红素去饱和酶(NCBI number U37285)的能力，其设计很大程度上依照如Schwab R等人(2005)Dev Cell8：517-27所述的规则。概括地说，微RNA序列长度为21个核苷酸，起始于它们5’-末端的“U”，相对于它们的星状序列显示出5′不稳定性，星状序列通过在位点19包括C或G获得，并且它们的第10个核苷酸是“A”或“U”。用于人工微RNA设计的一个附加要求是当使用ZipFold算法进行计算时amiRNA具有高度自由的△-G(Markham，N.R.&Zuker，M.(2005)Nucleic Acids Res.33：W577-W581。)任选地，将一个碱基对改变加到amiRNA的5’部分以便该序列的一个核苷酸与靶序列不同。用于沉默八青番茄红素去饱和酶的amiRNA是5’-ucagcagcaauuucaccagga-3’(该DNA序列对应于用SEQ ID NO：16表示的amiRNA)。设计两个附加的amiRNA以沉默八青番茄红素去饱和酶。这些序列是PDS2，5’-ugcaauaaaaaccucaucgua-3’(该DNA序列对应于用SEQ ID NO：35表示的amiRNA)和PDS3，5’-uacucgcaaaacaucucugag-3’(该DNA序列对应于用SEQ ID NO：36表示的amiRNA)

实施例3

设计人工星状序列

“星状序列”是前体RNA中碱基对与amiRNA序列在一起以形成不完全的茎结构的那些序列。为了形成完全的茎结构，星状序列将是amiRNA的完全反向互补序列。玉米前体序列如Zhang等人在补充材料表S1中所述，使用mfold折叠(M.Zuker(2003)Nucleic Acids Res.31：3406-15；以及D.H.MatheWs，J.等人(1999)J.Mol.Biol.288.：911-940)。然后用amiRNA序列置换miRNA序列，并且用amiRNA的完全反向互补序列置换内源星状序列。将改变导入人工星状序列中以便茎结构将保持与内源结构相同。发生改变的序列然后用mfold折叠并目测比较初始结构和改变后的结构。如果必要的话，可将更多的改变导入到人工星状序列中以保持初始结构。对应于用于沉默八青番茄红素去饱和酶的人工星状序列的DNA序列是：

表3：人工微RNA星状序列

amiRNA前体	星状序列	序列标识号
			159c-PDS	tccaggtgaatttggtgctgt	17
164h-PDS	tctggtgaaaacgctgctga	18
			168a-PDS	ccctggcaaaattgctgctga	19
169r-PDS	gcctggtgaacattgctgctga	20
			396h-PDS	tcctggtgcaattgctgctga	21
396h-PDS2	tacgatgacgtttttattgca	37
			396h-PDS3	ctcagagacgttttgcgagta	38

实施例4

将基因组微RNA前体转化成人工微RNA前体

使用重叠PCR将基因组miRNA前体基因转化成amiRNA，并且将所得DNA全部测序。然后将这些DNA克隆到一个能够转化玉米的载体中的合适启动子的下游。然后将所得质粒与vir质粒PHP10523(PCT公开W02002/004,649，公布于2002年1月17日)一起共整合进农杆菌属菌株LBA4404中，所得菌株能用于转化玉米。

作为另外一种选择，可商业合成amiRNA，例如通过Codon Devices，(Cambridge，MA)。然后将合成的DNA克隆到一个能够转化玉米的载体中的合适启动子的下游。然后将所得质粒与质粒PHP10523一起共整合进农杆菌属菌株LBA4404中，所得菌株能用于转化玉米。

实施例5

将基因组微RNA前体转化成人工微RNA前体

使用如实施例4所述的重叠PCR将基因组miRNA前体基因转化成amiRNA前体，并且将所得DNA全部测序。制备以下五个amiRNA前体：

表4：靶向八青番茄红素去饱和酶的人工微RNA前体序列

微RNA前体	序列标识号	长度(nucs)
			159c-PDS	22	684
164h-PDS	23	739
			168a-PDS	24	791
169r-PDS	25	860
			396h-PDS	26	633

然后将这些DNA克隆进PHP23576的泛素启动子-内含子的下游。PHP23576包含Gateway(Invitrogen)L1和L2位点。然后所得质粒与质粒PHP20622结合(PCT公开W02006/107,931，公布于2006年10月12日)。然后将所得质粒与vir质粒PHP10523一起共整合进农杆菌属菌株LBA4404中，所得菌株用于转化玉米。

实施例6

转化玉米

A.玉米颗粒介导的DNA递送

可以将DNA构建体导入能够在合适的玉米培养基中生长的玉米细胞内。这样的感受态细胞玉米悬浮培养物，在固体培养基上的愈伤组织培养物，新分离的未成熟胚芽或分生组织细胞。可使用Hi-II基因型的未成熟胚芽作为靶细胞。在授粉后大约10天收获穗，并且从种仁分离出1.2-1.5mm未成熟胚芽，并且放置使得盾片侧朝下在玉米培养物上。

从穗上收获之后18-72小时，将未成熟胚芽轰击。在轰击之前6和18小时之间，将未成熟胚芽放置在具有另外渗透性(osmoticum)的培养基上(MS基础培养基，Musashige和Skoog，1962，Physiol.Plant15：473-497,含有0.25M山梨醇)。将在高渗透性培养基上的胚芽用作轰击靶，并且在轰击后，在该培养基上再放置18小时。

对于粒子轰击，使用标准CaC12-亚精胺化学(参见例如Klein等人，1987，Nature327：70-73)将质粒DNA(上述)在1.8mm钨粒子上沉淀。使用DuPont Helium Gun(Lowe等人，1995，Bio/Technol13：677-682)将每个平板以600PSI轰击一次。对于用于玉米未成熟胚芽分离、愈伤组织引发、愈伤组织增长以及植物再生的典型培养基制剂，参见Armstrong，C.，1994，In“The Maize Handbook”，M.Freeling和V.Walbot，eds.Springer Verlag，NY，pp663-671。

在粒子轰击之后1-7天内，将胚芽移动到含有3mg/l选择试剂双丙氨磷的N6-基培养基上。每2周将胚芽以及晚期愈伤组织转移到新选择平板上。对于所需表型，筛选从未成熟胚芽上发育的愈伤组织。6-8周后，回收转化的愈伤组织。

B.使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌转化玉米

农杆菌属细菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行：Zhao等人，in Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5，981，840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种，共培养，静息，选择和植物再生。

1.未成熟胚芽制备：

将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL胃管中。

2.未成熟胚芽的农杆菌属细菌感染和共培养：

2.1感染步骤：

用1mL微吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并且加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤：

用1mL微吸移管将农杆菌属细菌悬浮液从感染步骤中取出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件：

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并且用parafilm将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃培养。预计在6-8周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以2-3周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。

4.T0植株的再生：

将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28℃于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约10-18天。将具有明显盾片和胚芽鞘的单独成熟体细胞胚转移至PHI-F胚萌发培养基中，并在28℃下在光照中(约80μE，来自冷白光灯或等同的荧光灯)培养。在7-10天，将约10cm高的再生的植株置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行耐寒锻炼(hardened-off)。

用于植物转化的培养基：

1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L2,4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100μM的乙酰丁香酮，过滤灭菌。

2.PHI-B：PHI-A，不含有葡萄糖，将2,4-D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并且补充0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3.0g/L

100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)，pH5.8。

3.PHI-C：PHI-B，不含

和乙酰丁香酮，将2,4-D降低至1.5mg/L，并且补充8.0g/L琼脂，0.5g/L2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)。

4.PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)。

5.PHI-E：4.3g/L Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺，0.5mg/L盐酸吡哆醇，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma，Cat.No.Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/Lbialaphos(过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)，8g/L琼脂，pH5.6。

6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L

替代琼脂；pH5.6。

可通过以下方法由愈伤组织再生出植物：首先将组织簇转移到N6培养基中，所述培养基补充了0.2mg2,4-D/升。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology8：833-839(1990))。

转基因T0植株可以再生，并且可以确定其表型。可收集T1种子。

此外，可通过直接转化或者从单独转化的品系基因渗入而将含有证实的拟南芥基因的重组DNA构建体导入玉米自交系内。

近交或杂交的转基因植物可通过更有力的大田试验来研究表达效果。

实施例7

检测分析PDS表型以及结果

在授粉九至十天后，用农杆菌属如上所述感染胚芽并用Basta选择。进行五个不同的感染，每个感染具有包含如实施例五所述的五个amiRNA中的其中一个的农杆菌属。再生体细胞胚芽并将其排列成3×3的网格。将包含排列好的幼苗的单层板暴露在～114mEinsteins m-2sec-1的光照下。将网格中间的幼苗的表型视觉评分为“绿色”、“白色”或“灰白色”。沉默百分比是白色植物百分比和灰白色植物百分比的总和。通常对每个构建体的50个个体事件进行评分。

表5：amiRNA的沉默功效

这些结果显示一些amiRNA前体能够生产在基因沉默中有效的amiRNA。将靶向八青番茄红素去饱和酶的两个附加miRNA克隆进396h主链以及它们的星状序列。两个构建体显示了类似于表5中显示的PHP30452的沉默功效。

实施例8

Northern印迹分析

依照制造商提供的规程，用Trizol(Invitrogen)从冷冻幼苗组织中制备RNA。总RNA在15％TBE-尿素PAGE凝胶上电泳，电泳在200V下，在0.5xTBE中进行大约60至90分钟，然后用半干转印槽(Trans-BlotSD cell)将RNA转移到BrightStar-Plus正电荷尼龙膜(Ambion)上。在转移后，用0.5XTBE洗涤印迹，并且在Stratalinker(Stratagene)中，用Auto-Energy运行一个循环将RNA交联到膜上。该Blot在42度下，在ULTRAhyb-oligo杂交缓冲液(Ambion)中预杂交30分钟，然后在42度下，在加入生物素标记探针的ULTRAhyb-oligo杂交缓冲液中杂交过夜。生物素标记探针是用4bp间隔分开的两拷贝amiRNA序列的反向互补序列的串联体，并且该探针用BrightStar Psoralen-Biotin Nonisotopic标记试剂盒(Ambion)标记。在杂交后，印迹用NorthernMax洗涤溶液(Ambion)洗涤，并且使用BrightStar BioDetect Nonisotopic检测试剂盒(Ambion)，依照制造商提供的规程进行检测。在所有情况下，存在的21bp的amiRNA序列与表型相关。此外，中等水平的信号与灰白色植物相关，然而较高水平的信号与白色植物相关。

实施例9

截短的人工微RNA前体能够沉默基因。

在测定是否包含比全长人工微RNA前体更短的构建体能够沉默基因的尝试中，使用PCR制备以下截短的amiRNA前体。

表6：靶向八青番茄红素去饱和酶的截短人工微RNA前体

微RNA前体	序列标识号	长度(nucs)
			169r-PDS-sht	27	96
169r-PDS-med	28	305
			396h-PDS-sht	29	117
396h-PDS-med	30	292

将这些截短的amiRNA构建体全部测序并如实施例5所述克隆进构建体中。将这些构建体转化进玉米胚芽中并对它们沉默PDS的能力评分。

表7：截短amiRNA的沉默功效

这些结果显示截短的构建体能够产生amiRNA。然而如果将该构建体截短过多，它不能再产生amiRNA。

实施例10

沉默fad2-1的人工微RNA

以上实施例显示玉米PDS基因的沉默，但是本领域的技术人员已知能构建amiRNA以沉默许多基因。例如另一个能被沉默的基因，如实施例2所述设计靶向fad2-1的amiRNA，如实施例3所述设计人工星状序列并且如实施例4所述制备amiRNA前体。这些构建体在表8中概述。

表8：靶向脂肪酸去饱和酶的人工微RNA前体

微RNA前体	序列标识号	长度(nucs)
			159c-FAD	31	684
168a-FAD	32	790
			169r-FAD	33	861
396h-FAD	34	633

然后将这些DNA克隆到玉米16KD油质蛋白基因启动子的下游，该启动子包含在质粒PHP20790中的5′UTR。PHP20790包含Gateway(Invitrogen)L1和L2位点。然后将所得质粒与质粒PHP20622重组。然后将所得质粒与质粒PHPl0523一起共整合进农杆菌属菌株LBA4404中，所得菌株用于转化用来自栽培变种HC69的花粉授粉的栽培变种GS3的玉米胚芽。允许植物再生并用转基因植物作为雌性植株、HC69作为雄性植株进行杂交。收集种子并用标准方法分析脂肪酸含量。

利用对FAME进行的GC分析，研究amiRNA的表达是否会改变玉米种子的脂肪酸谱。每个事件分析大约50个种子，每个构建体分析18-25个事件。在萃取盘中加入1.5mL己烷到碾碎的玉米中。己烷具有溶解的油，将其转移到1.8mL玻璃GC小瓶中。其中加入100μL三甲基锍氢氧化物用于酯交换。使用Agilent6890气相色谱仪分离并定量脂肪酸甲酯(从己烷层中注入1μL，分流比率80比1)，该色谱仪配备了15mZebron ZB-蜡毛细管柱，I.D.0.25mm，薄膜厚度0.25μm。(目录号#7EG-G007-11，Phenomenex)。柱温为等温220℃2.5分钟。载气是标准等级氦气。将保留时间与市售标准物的甲基酯的保留时间进行比较。通过下调脂肪酸去饱和酶途径改变和分析玉米中油的一般方法可见于美国专利公开申请10/223,646。结果总结于表9。

具有168a主链和396h主链的构建体提供高效的沉默。包含159c主链和169r主链的构建体不提供任何沉默(％沉默fad2-1；它是现实沉默的事件百分比)。

将转基因种子的连续世代种植在田地中，并且检测分析T2和T3种子的脂肪酸含量。这些构建体的效应显示是可遗传的和稳定的。

在与用靶向PDS(表9中的％沉默PDS)的amiRNA获得的沉默进行比较时，一些miRNA前体主链显示在多个组织类型中沉默(396h，以及潜在地164h)，然而其它的miRNA前体主链在其中它们有效应的组织中更具有特异性(159c和169r)。所有五个miRNA主链在至少一个组织类型中显示功效。

表9：人工miRNA前体表现出选择性的功效

主链	序列标识号	％沉默PDS	％沉默fad2-1
				159c	22，31	14	0
164h	23，无	8	无数据
				168a	24，32	无数据	85
169r	25，33	58	0
				396h	26，34	76	92

表9中给出结果的可能的解释包括但不限于miRNA前体在时间上、空间上或器官特异性途径中具有不同的稳定性；不同的miRNA前体加工(支持已经在动物体系中发现的miRNA的转录后加工步骤不同，Obernosterer等人(2007)RNA12：1161-1167)；或者对在多个miRNA中的dicer复合物的竞争能力不同。

实施例11

沉默致死叶斑病的人工微RNA

以上实施例显示玉米PDS基因和fad2基因的沉默，但是本领域的技术人员已知能构建amiRNA以沉默许多基因。例如另一个能被沉默的基因，如实施例2所述设计靶向致死叶斑病的amiRNA，该微RNA是5’-uuugaaaggacgguguaaggc-3’(对应于用SEQ ID NO：35表示的该amiRNA的DNA序列)。如实施例3所述设计人工星状序列，并且在表10中显示。如实施例4所述制备amiRNA前体。

表10：人工微RNA星状序列

amiRNA前体	星状序列	序列标识号
			168a-lls	accttaatccgtcctttcaaa	36
69r-lls	cccttacacctgtcctttcaac	37
			396h-l1s	gccttacagcgtcctttcaaa	38

其中已经沉默致死叶斑病的基因(NCBI号，U77345；Gray J等人(1997)A novel suppressor of cell death in plants encoded by the Lls l geneof maize.Cell.Apr4；89(1)：25-31。)的玉米植物在全部发育叶片中显示出致死损害的表型以及在一些情况下致死植物。将植物转移到温室中大约8周后通过目测植物测定％沉默。所有三个构建体提供有效的沉默(表11)。

表11：有效沉默致死叶斑病的人工miRNA构建体

PHP号	构建体	％沉默
			PHP36155	168a-lls	82
PHP33788	69r-lls	80
			PHP36154	396h-lls	85

实施例12

脂肪酸去饱和酶和多药耐药性蛋白的人工微RNA

有时希望沉默一种以上的基因以及给定构建体。能将单个amiRNA前体可操作地连接至相同或不同启动子上。作为另外一种选择，能将两个或更多个amiRNA前体彼此可操作地连接，然后连接到一个启动子上。从此类构建体制备两个或更多个amiRNA。

实施例10显示了包含用于沉默fad2-1的人工微RNA的构建体。例如另一个能被沉默的基因，如实施例2所述设计靶向多药耐药性蛋白(MRP)的amiRNA，微RNA是5’-uaauucacaaucucaccacuc-3’(对应于用SEQ ID NO：39表示的该amiRNA的DNA序列)。如实施例3所述设计人工星状序列并且在表12中显示。如实施例4所述制备两个MRPamiRNA前体，168a-MRP(SEQ ID No：42)和396h-MRP(SEQ ID No：43)。沉默MRP导致植酸的减少(Shi J.等人(2007)Embryo-specific silencingof a transporter reduces phytic acid content of maize and soybean seeds.NatBiotechnol.Aug；25(8)：930-7。)

表12：人工微RNA星状序列

amiRNA前体	星状序列	序列标识号
			168a-MRP	aagtggctagattgtgaatta	40
396h-MRP	gagtggtgacattgtgaatta	41

在fad2前体的上游或下游克隆这些前体(如实施例10所述)以制备盒，然后将它们克隆到构建体中并转移到农杆菌属中以制备上文所述的表13中所述的构建体。如实施例6所述转化玉米，并且检测分析转基因种子的肌醇六磷酸和脂肪酸含量。

表13：包含设计用于沉默fad2-1和MRP的 amiRNA的人工miRNA构建体

PHP号	构建体
		PHP38380	168aFAD2-1/168a-MRP
PHP38381	396h-Fad2-1/168a-MRP
		PHP38382	168a-MRP/396h-FAD2-1
PHP38383	396h-MRP/396h-FAD2-1

Claims

1.用于减少玉米细胞中靶序列表达的核酸片段，其中（i）SEQ ID NO:15的核苷酸83至103被第一可变核苷酸亚序列置换，取决于要减少表达的靶序列，所述第一可变核苷酸亚序列的大小在19至30个核苷酸的范围内，（ii）SEQ ID NO:15的核苷酸172至192被第二可变核苷酸亚序列置换，所述第二可变核苷酸亚序列的大小在19至30个核苷酸的范围内，所述第二可变核苷酸亚序列能够与第一可变亚序列杂交，并且(iii)由所述核酸片段产生的前体miRNA与由内源性SEQ ID NO:15产生的前体miRNA具有相同的茎结构，并且所述第一和第二可变核苷酸亚序列不同于被置换的序列。

2.包含权利要求1的核酸片段的重组构建体，所述核酸片段与至少一种调控序列可操作地连接。

3.减少玉米细胞中靶序列表达的方法，所述方法包括：

(a) 用权利要求2所述的核酸构建体转化至少一种玉米细胞；以及

(b) 选择那些转化的玉米细胞，所述转化的玉米细胞的靶序列的表达水平与野生型玉米细胞中的靶基因的表达水平相比被减少。