CN103898031A - 一株高产电的拜氏梭菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013424，保藏日期为2013年9月14日。本发明还公开了上述高产电的拜氏梭菌在产电中的应用。本发明的拜氏梭菌在1g/L葡萄糖种子液中，0.15g/L甲基紫精（MV）为电子介体时，最大输出电压高达230mV，最大输出功率密度为79.2mW/m2。本发明的工艺简单、操作方便、无污染、成本低，其燃料利用普较广，电子回收率较高，缓解了能源危机，是一株适合于微生物燃料电池研究及应用的优良菌株。
Description
技术领域
本发明属于环境与新能源技术领域，具体涉及一种拜氏梭菌及其在利用葡萄糖等碳源在微生物燃料电池发电上的应用。
背景技术
能源枯竭与有机废弃物的处理是当前世界面临的两大难题，然而随着人类进步与发展，对能源的需求及全球变暖问题却日益严峻。为了解决这些问题，科学家们把目光投向了微生物，利用微生物产电，解决能量短缺问题；同时，利用微生物降解周围有机物以供能量维持生长的能力，来处理日益庞大的有机废弃物的问题。由此，微生物燃料电池（Microbial Fuel Cell，MFC）的重要性日益显现。
MFC是利用产电微生物作为阳极催化剂将有机物中的化学能转化为电能的装置。在此系统中，产电微生物是核心要素。但是由于绝大多数微生物的细胞外包裹的一层油脂性膜是非导电性材料，尤其是革兰氏阳性菌，细胞膜中富含肽聚糖等一些绝缘性物质，从而严重阻碍了微生物与电极之间的电子交换，减小了MFC的效率。所以，当使用微生物作为催化剂时，要使用适当的电子传递介质以促进微生物与电极之间的电子交换。理论上，电子传递介质的氧化态和还原态均有很强的亲脂性，自由的透过细胞膜。
微生物产电能力相差很大，产电微生物决定着MFC的功能及应用，目前已发现的产电微生物主要集中在希瓦氏菌属（Shewanella）和地杆菌属（Geobacter）（Energy Environ.Sci.,2011,4,4366–4379）等一些革兰氏阴性菌，随着对产电微生物的研究，近来韩国HyungSoo Park等分离出一株丁酸梭菌（Clostridium butyricum EG3）（Anaerobe(2001)7,297–306）在缺乏电子介体时利用10mM葡萄糖产电220mV。Sophie Peguin等人（Biotechnology and Bioengineering,Vol.51,Pp.342-348(1996)）利用三电极系统报道了丙酮丁醇梭菌在有甲基紫精参与的情况下的MFC。Juliane Niessen等人（ElectrochemistryCommunications6(2004)955–958）对丁酸梭菌进行MFC产电，利用10g/L葡萄糖作为燃料得到最大输出电压473mV，然而关于拜氏梭菌进行详细MFC产电的报道甚少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株经过ARTP等离子体诱变得到的具有高活性产电能力的拜氏梭菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述拜氏梭菌在微生物燃料电池产电方面的应用。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013424，保藏日期为2013年9月14日。
本发明的拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiM13的筛选方法，将拜氏梭菌出发菌株NCIMB8052（购于美国菌种保藏中心（ATCC））经等离子体诱变后，利用WO3显色技术筛选得到能够产电的菌株，再经过双室MFC进行筛选高产电能的菌株。
其具体步骤如下：
（1）等离子体诱变：将拜氏梭菌原始菌株8052活化培养，培养温度33～37℃，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～18h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD600=0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80～120W作为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变。
（2）三明治式培养技术初筛选：将诱变后的菌株分别在固体培养基中培养16～24h，37℃培养，长出菌落后，再涂布25mL无菌的WO3琼脂悬浮液，37℃培养，培养时间24～36h，观察颜色变化，挑取蓝色部分菌落，种子培养，保存。
（3）96孔平板显色技术复筛选：将上述收集的菌株接种于种子培养基中，37℃恒温箱培养12h后，达到对数期菌液，在4000rpm下离心5min收集菌体，用无菌乳酸钠最小盐溶液悬浮，调细胞OD600=1.0备用。取100ul含有乳酸钠最小盐溶液的备用菌液加入96孔平板中，再分别加入80ul无菌含WO3簇状物（5g/L）的乳酸钠最小盐溶液和0.10g/L甲基紫精，立即加入80ul凡士林确保无氧状态，放入30℃厌氧箱，0.5、1、3、5h观察颜色变化。
（4）双室MFC技术筛选：将步骤（3）筛选出来的菌株接入种子液，培养温度37℃，厌氧培养时间12h。然后进行双室MFC技术，接种量10%（v/v），培养温度30℃，产电检测时间48h；考察步骤（3）筛选出的菌株的产电量，同时选出产电量最高的菌株。
（5）在上述筛选方法中：步骤(1)中所述的等离子体诱变方法中，优选100W作为射频功率，10SLM作为气体流量，180s作为辐照时间。
在上述筛选方法中：步骤(2)所述的固体培养基，碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种，甲基紫精，琼脂；无菌的WO3琼脂悬浮液包含WO3簇状物、钠盐、琼脂、甲基紫精。
在上述筛选方法中：步骤(3)所述的种子液不加琼脂其他成分同上所述；乳酸钠最小盐溶液包含乳酸钠、钠盐、钾盐、磷酸盐、羟乙基哌嗪乙磺酸及微量无机盐化合物，分别为NTA、镁盐、锰盐。钠盐、亚铁盐、钙盐、钴盐、锌盐、铜盐、铝盐、镍盐、钨化物、硼酸的一种或多种，WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液，为乳酸钠最小盐溶液中添加WO3簇状物。
在上述筛选方法中：步骤(4)所述双室MFC装置中，阳极液为种子培养基及甲基紫精作为电子介体，碳源为葡萄糖，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。阴极液为钾盐、磷酸盐、铁氰化合物。
其中，所述的双室MFC技术产电方法包含如下步骤：
（1）菌株活化：将拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiM13接种到种子培养基中，培养温度33～37℃，培养时间12～18h；
（2）装置搭建：安置阳极室的阳极，安置阴极室的阴极，安置介于阳极隔室和阴极隔室之间用于分隔阳极室和阴极室的质子交换膜，进行灭菌处理；
（3）MFC技术：向阳极室中加入阳极液及甲基紫精，通入N23min以上，接入拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M13，接种量10v/v%，再通入N23min以上，迅速密封阳极室，向阴极室加入阴极液，迅速密封阴极室，至于30℃恒温箱，进行电压数据采集器采集数据，采集时间48h。
所述的种子培养基包含碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。
所述的阳极和阴极均为PAN基石墨软毡（5×5cm），以钛丝作为外接电路，外接电阻为1000Ω，质子交换膜为杜邦NafionN117。
所述的阳极液为种子培养基，包含碳源为淀粉或者葡萄糖中的一种或者多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉中的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种。阴极液为磷酸盐、钾盐及铁氰化物。
对突变株Clostridium beijerinckii M13进行30g/L葡萄糖发酵培养基ABE发酵，得到结果如表1所示：
表1
由以上发酵结果及突变株M13与出发菌株8052在固体培养基上的菌落形态、色泽几乎相同可知，经诱变的突变株M13仍旧属于拜氏梭菌，并且突变株M13的ABE发酵产量有所提高。
上述拜氏梭菌在产电中的应用。
上述拜氏梭菌作为微生物燃料电池在产电中的应用。
拜氏梭菌作为微生物燃料电池进行产电的方法，包括如下步骤：
（1）构建微生物燃料电池：将含有燃料的阳极液及甲基紫精加入到阳极室中，以高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体作为阳极室接种物，再向阳极室通入氮气除去溶解氧；将阴极液加入到阴极室中；
（2）利用微生物燃料电池产电：将微生物燃料电池放入28～30℃的温室中静置培养，进行产电。
步骤（1）中，所述的含有燃料的阳极液为以葡萄糖和/或淀粉为碳源的种子培养基。所述的种子培养基优选配方如下：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖和/或淀粉1～10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，pH=6。
步骤（1）中，甲基紫精占阳极液的浓度为0.13～0.15g/L。
步骤（1）中，所述的高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体预先经过如下方式活化：由28～30v/v%甘油水溶液冷冻保藏的菌种接种于淀粉种子培养基中，充氮气3min，于33～37℃恒温箱活化菌体12～18h，达到指数生长期，停止活化。
步骤（1）中，高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体作为阳极室接种物，接种量为10v/v%。
步骤（1）中，所述的阴极液为38～40mM铁氰化钾水溶液。所述的阴极液优选配方：二水合磷酸二氢钠2.772g/L，十二水合磷酸氢二钠11.5g/L，氯化钾0.13g/L，铁氰化钾40mM，pH=7。
步骤（1）中，高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体接种前阳极室通入氮气3min以上，接种后阳极室通入氮气3min以上，迅速封闭阳极室。
有益效果：本发明方法与现有技术相比，本发明的具有如下优势：
（1）本发明采用等离子体诱变拜氏梭菌，先利用“三明治式”固体培养基筛选出能够可能具有产电能力的菌落，再利用96孔平板WO3显色技术筛出能够产电的单菌落菌株，最后利用双室MFC技术筛选出高产电量的菌株。
（2）本发明的拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiM13燃料利用普较为广泛，能利用葡糖糖、淀粉、木糖、纤维二糖等多种有机物，并且抗逆性强，能在具有高毒素培养基下生长并产电；有机物氧化较为彻底，电子回收利用率高。
（3）本发明为拜氏梭菌开拓了新的应用技术领域，为产电菌提供了新的研究方向，同时为MFC提供一种新的有电子介体参与的高产电的菌属。
（4）本发明的拜氏梭菌在1g/L葡萄糖种子液中，0.15g/L甲基紫精（MV）为电子介体时，最大输出电压高达230mV，比初始菌株8052提高了2.28倍，最大输出功率密度为79.2mW/m2，比初始菌株8052提高了2.06倍。
附图说明
本发明的微生物分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii M13，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M2013424，保藏日期为2013年9月14日。
图1为拜氏梭菌的等离子体诱变存活率曲线。
图2为以拜氏梭菌为阳极催化剂的微生物燃料电池结构原理图。
图3a为本发明拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiM13在1g/L葡萄糖中的产电活性图。
图3b为初始菌株NCIMB8052在1g/L葡萄糖中的产电活性图。
图4为本发明与初始菌株8052利用1g/L葡萄糖为燃料的产电情况。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
本实施例说明将拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。
拜氏梭菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
将拜氏梭菌NCIMB8052原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，50ml肖特厌氧瓶装液量为15～20ml，充氮气3min，培养时间12～18h，得到生长旺盛的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600=1～1.5，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为射频功率，以10SLM作为气体流量，以10～1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示；由图1可知，180s是最佳的诱变辐照时间。
实施例2：
本实施例说明筛选出高产电的拜氏梭菌的方法。
其中，所使用的培养基配方如下所示：
（1）种子培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，pH=6。
（2）三明治式培养基如下：
a)、固体培养基：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，可溶性淀粉10g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，甲基紫精0.10g/L，pH=6琼脂15～20g/L。
b)、WO3琼脂悬浮液：WO3簇状物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，甲基紫精0.10g/L。
（3）乳酸钠最小盐溶液：乳酸钠2.02g/L，氯化钠5.85g/l，羟乙基哌嗪乙磺酸11.91g/L，氢氧化钠0.3g/L，氯化铵1.498g/L，氯化钾0.097g/L，二水合磷酸二氢钠0.67g/l。
附加微量元素溶液（比例1:1000）：NTA(C6H9NO6)1.5g/L，七水合硫酸镁30g/L，一水合硫酸锰5g/L，氯化钠10g/L，七水合硫酸亚铁1g/L，二水合氯化钙1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌1.3g/L，五水合硫酸铜0.1g/L，十二水合硫酸钾铝0.1g/L，硼酸0.1g/L，二水合钼酸钠0.25g/L，六水合氯化镍0.25g/L，二水合钨酸钠0.25g/L。
附加氨基酸溶液（比例1:1000）：L-谷氨酸2g/L，L-精氨酸2g/L，DL-丝氨酸2g/L。
附加维生素溶液（比例1:1000）：生物素2g/L，叶酸2g/L，盐酸吡哆醇10g/L，核黄素5g/L，烟碱酸5g/L，维生素B55g/L，维生素B120.1g/L，p-对氨基苯甲酸5g/L，硫辛酸5g/L。
含WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液：加WO3簇状物的乳酸钠最小盐溶液。
（4）双室MFC中阳极液：酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖1g/L，乙酸铵2g/L，氯化钠3g/L，七水合硫酸镁3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，甲基紫精0.10g/L，pH=6。
双室MFC中阴极液：二水合磷酸二氢钠2.772g/L，十二水合磷酸氢二钠11.5g/L，氯化钾0.13g//l，铁氰化钾40mM，pH=7。
筛选步骤：
（1）三明治式培养技术初筛选
将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于固体培养基平板上，培养16～24h，培养温度37℃，再在固体平板培养基上涂布25mL含有甲基紫精的无菌WO3琼脂悬浮液，33～37℃厌氧培养24～36h，挑选出具有颜色变化区的菌落，种子培养基培养，保存。
（2）96孔平板显色技术复筛选
将上述收集的菌株和出发菌株8052接种于种子培养基中，37℃恒温箱培养12h后，达到对数期菌液，在4000rpm下离心5min收集菌体，用无菌乳酸钠最小盐溶液悬浮，调细胞OD600=1.0备用。取100ul含有乳酸钠最小盐溶液的备用菌液加入96孔平板中，再分别加入80ulg/L无菌含WO3（5g/L）簇状物的乳酸钠最小盐溶液和0.10g/L甲基紫精，立即加入80ul凡士林确保无氧状态，放入30℃厌氧箱，0.5、1、3、5h观察颜色变化，挑选出5株快速变蓝及颜色深的菌株。
（3）双室MFC技术筛选
将上述挑选得到的菌株和出发菌株8052接种于种子培养基中，37℃恒温箱培养12h后，达到对数期菌液，向阳极室接入阳极液和0.10g/L甲基紫精，通入N23分钟，接种量10%（v/v），通入N23分钟，排出溶液中氧气，迅速密封阳极室，向阴极室接入阴极液，密封阴极室，外接电阻1000Ω，培养温度30℃，数据采集时间48h。当产生的电压降低时，立即利用万用表及电阻箱测定每隔5秒测定电压，进行测定筛选菌株和出发菌株8052的最大功率功率密度及最大输出电压如表2所示：
表2
经过两次筛选获得的5株突变株在进行双室MFC技术上的最大输出电压和功率密度均明显高于出发菌株，最终筛选出最大输出电压和最大功率密度的菌株M13。
实施例3：
本实施例说明拜氏梭菌作为阳极催化剂利用1g/L葡糖糖的产电实验。
（1）构建微生物燃料电池
本实施例按照现有的技术和方法建立了利用拜氏梭菌为阳极催化剂发电的微生物燃料电池，如附图2所示，包括阳极室、阴极室、质子交换膜和外电路四个部分。阳极电极和阴极电极均为PAN基石墨软毡（5×5cm），以钛丝作为外接电路，外接电阻为1000Ω，质子交换膜为杜邦NafionN117，采用数据采集器为Keithley系列。
（2）在种子液中活化筛选得到的高产电菌株M13和初始菌株8052，培养温度37℃，厌氧培养时间12h。然后进行250mL双室MFC技术，向阳极室中接入阳极液225mL，0.15g/L甲基紫精（MV），通入N23分钟，再接入25mL的拜氏梭菌（（接种量10%（v/v）），通入N23分钟，排出溶液中的氧，迅速密封阳极室，向阴极室加入阴极液，迅速密封阴极室，培养温度30℃，产电检测时间48h，最终得到结果如表3所示。
表3
根据输出电压数据，计算电子回收率与获得产电的极化曲线图具体结果如图3a、3b、4所示。其中，本发明Clostridium beijerinckiiM13最大输出电压高达230mV，比初始菌株8052提高了2.28倍，最大输出功率密度为79.2mW/m2，比初始菌株8052提高了2.06倍。
Claims (10)
1.一株高产电的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），菌株号M13，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2013424，保藏日期为2013年9月14日。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌在产电中的应用。
3.权利要求1所述的拜氏梭菌作为微生物燃料电池在产电中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，拜氏梭菌作为微生物燃料电池进行产电的方法，包括如下步骤：
（1）构建微生物燃料电池：将含有燃料的阳极液及甲基紫精加入到阳极室中，以高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体作为阳极室接种物，再向阳极室通入氮气除去溶解氧；将阴极液加入到阴极室中；
（2）利用微生物燃料电池产电：将微生物燃料电池放入28～30℃的温室中静置培养，进行产电。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的含有燃料的阳极液为以葡萄糖和/或淀粉为碳源的种子培养基。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，甲基紫精占阳极液的浓度为0.13～0.15g/L。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的高产电拜氏梭菌CCTCC NO：M2013424菌体预先经过如下方式活化：由28～30v/v%甘油水溶液冷冻保藏的菌种接种于淀粉种子培养基中，充氮气3min，于33～37℃恒温箱活化菌体12～18h，达到指数生长期，停止活化。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，高产电拜氏梭菌CCTCCNO：M2013424菌体作为阳极室接种物，接种量为10v/v%。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的阴极液为38～40mM铁氰化钾的水溶液。
10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤（1）中，高产电拜氏梭菌CCTCCNO：M2013424菌体接种前阳极室通入氮气3min以上，接种后阳极室通入氮气3min以上，迅速封闭阳极室。
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