CN103897992A - 棉花的内生真菌cef-193及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF-193及其应用。本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著诱导免疫作用的菌株CEF-193(Acremonium alternatum)，保藏编号为CGMCC No.8302，CEF-193能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，以利于工厂化生产和推广应用。室内抑菌试验表明，对黄萎病控制效果好，先接种CEF-193，4天后接种大丽轮枝菌，对棉花黄萎病的防治效果达到74.1％，对黄萎病有显著的控制作用，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高40％左右，对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。

Description

棉花的内生真菌CEF-193及其应用

技术领域

本发明涉及植物病理学，具体地涉及棉花的内生真菌CEF-193及其应用。 

背景技术

由大丽轮枝菌引起的黄萎病是世界性的棉花重要病害之一，由于缺乏真正有效的抗病品种或者是抗病品种的抗病性极易丧失，使得最经济有效的防治措施不能发挥其主导作用。90年代以来，该病在我国各大棉区爆发成灾，年发生面积为300万公顷左右，产量损失约1亿公斤皮棉，成为发展棉花生产的主要限制因子之一。由于轮作倒茬难，缺乏抗病品种，化学药剂防治效果差，缺乏具有较好防治效果的农药，致使目前生产上对黄萎病的防治几乎是空白。 

利用有益微生物控制植物病害的发生危害具有经济、环境友好的特点。目前利用拮抗微生物防治棉花黄萎病研究较多的是枯草芽孢杆菌，作用机理是产生杆菌肽等多种抗菌物质来抑制病原菌，对黄萎病的防治具有一定的效果，但是在生产应用中存在不少问题，其中最主要的问题是防治效果较低，国内登记的枯草芽孢杆菌剂型对棉花黄萎病的防治效果在50％左右，且在不同年份效果不稳定。例如2008年和2009年，由中国农业科学院棉花研究所承担国家农药登记试验中(任务来源于农业部农药鉴定所)，黑龙江强尔生化技术开发区有限公司生产的1000亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的防治效果为46.0-52.9％，但在2010年大面积试验中防治效果只有32.7％。 

植物内生真菌资源是个巨大的宝库，目前对内生真菌的研究还处于早期阶段，所研究的植物类群不过数百种，仅涉及到很小的一部分。近年来，由于内生真菌在病虫害的生物防治、医药工业上的用途和范围逐渐增大，因此有关内生真菌的研究逐渐受到重视。 

棉花黄萎病是一种土传维管束真菌病害，从棉花的内生真菌入手，分离筛选对黄萎病菌具有抑制活性的菌株，获得对该病控制效果好的生防菌株，是值得探讨的棉花黄萎病防治的新途径。本发明的发明人经多年的研究，从健康棉花的茎杆中获得一株内生真菌，经温室苗期试验对棉花黄萎病的防治效果达74.1％，对棉花黄萎病的防治具有巨大的潜能。 

发明内容

为解决现有的拮抗微生物防治棉花黄萎病效果较差的问题，提出并完成本发明。 

本发明的目的是提供棉花的内生真菌CEF-193。 

本发明的再一目的是提供上述棉花的内生真菌CEF-193在棉花黄萎病防治中的应用。 

本发明从棉花的内生真菌入手，通过分离、筛选、鉴定、抑菌测定及温室的生物测定，获得对棉花黄萎病具有显著控制作用的菌株CEF-193(Acremonium alternatum)，其保藏编号为：CGMCC No.8302，该菌株经鉴定是一株支顶孢属真菌。 

该菌株是一株棉花的内生真菌，在分离时，首先要选择健康的棉株，最重要的是，在分离过程中，一定要保证样品的表面消毒彻底，确保分离到的是棉花的内生真菌。以传统的形态学鉴定为基础，结合分子生物学的手段，对筛选到的菌株进行鉴定，最后获得目的菌株。 

生防菌通常可利用竞争、抗生、寄生和交叉保护等直接的拮抗机制抑制植物病害；同时某些生防菌还能促进植物生长,诱导植物对真菌、细菌和病毒引起的病害乃至对线虫和昆虫为害的抗性,称为诱导系统抗性(ISR)，又称获得性抗病性，是植物在一定的生物或非生物因子的刺激或作用下，产生对随后病原物侵染的抗性。诱导的系统抗病性(或免疫作用)优于化学防治和抗病育种，其优点如下:(l)免疫作用能有效地防治病毒、细菌和真菌病害。(2)免疫作用是稳定的，它决定几种不同的机制，而内吸杀菌剂往往具有单一的作用位点，容易产生新的抗药小种，因而是不稳定的。(3)免疫作用是系统的、持久的，瓜类中的免疫作用可通过嫁接，从砧木传导到接穗。(4)在感病植物中亦具有免疫能力，说明潜在的抗病基因存在于所有的植物中。(5)免疫物质，可从免疫植株的化学提取物中获得，可在田一间喷施或种子处理。 

本发明获得的生防菌株CEF-193来自棉株体内，通过用生防菌株的培养滤液来浸泡棉花种子，使棉花获得对黄萎病的免疫作用。使用方法简单，适宜生产上推广用用。 

利用棉花的内生真菌CEF-193来控制棉花黄萎病在以下三方面产生有益效果。 

1、CEF-193能够在人工培养基上培养，容易获得和培养，用于生物防治的菌株必须能够在人工培养基上培养，以利于工厂化生产和推广应用。CEF-193是一株棉花的内生真菌，在土壤中广泛存在，能侵染多种作物，也是美花石斛、高羊茅等植物的优势内生真菌。该菌株在PDA、查氏及玉米沙粒培养基上生长良好，有利于大量繁殖和推广应用。 

2、CEF-193对棉花黄萎病菌具有较好的抑制效果。在PDA培养基上，CEF-193和棉花黄萎病菌Verticillium dahliae对扣培养时，黄萎病菌的菌落直径为57mm，空白对照的菌落直径为9mm，表明CEF-193产生的挥发性代谢物对黄萎病菌抑菌效果达到84.2％；在同样条件下采用圆盘滤膜法培养时，黄萎病菌的菌落直径为62mm，空白对照的菌落直径为12mm，表明CEF-193产生的非挥发性代谢物对黄萎病菌抑菌效果为80.6％。 

3、CEF-193对棉花黄萎病具有较好的诱导免疫作用。将25％的CEF-193的查彼克培养发酵液浸泡感病棉花品种冀棉11的种子(光子)12小时，将棉花种子播种于蛭石沙土制作的无底纸钵中，于棉苗一片真叶平展时接种棉花黄萎病强致病力菌株Vd080，棉苗2-3片真叶期调查黄萎病的发病情况。用CEF-193发酵液处理再接种Vd080的棉花病情指数为14.6，未经CEF-193发酵液处理直接接种Vd080的棉花病情指数为56.4，CEF-193对棉花黄萎病的控制效果为74.1％，与生产上应用较多的枯草芽孢杆菌相比，防治效果提高40.1％。 

4、CEF-193为一株芳香顶孢霉真菌，本发明获得的CEF-193分离自棉花，土壤中广泛存在，为环境友好型菌株，解决了具有生防潜力的微生物可能转变为致病菌的问题，因此对人畜、昆虫和作物安全，环境友好。 

附图说明

图1为CEF-193在PDA上的菌落形态、分生孢子梗及孢子的形态；其中a为菌落正面，b为菌落反面，c为显微镜下观察到的分生孢子梗及孢子的形态； 

图2为对扣培养法测定CEF-193对棉花黄萎病菌的抑制作用。a，在直径90mm培养皿的皿盖和皿底分别倒入一定量的培养基，皿盖培养基稍少些，凝固后，在皿盖中心接入5μl的芳香顶孢霉CEF-193菌液(查彼液体培养7d)，在皿底中心接种5μl的黄萎病病原菌菌液(查彼液体培养7d)，25℃恒温培养箱内培养7d；b，对照，直接在PDA平板中央接种的棉花黄萎病菌Vd080菌液5μl(查彼克液体培养7d)，25℃恒温培养箱内培养7d。 

图3为CEF-193对棉花黄萎病的控制作用，a,清水浸种，播种后18天用灭菌蒸馏水蘸根；b，50％的CEF-193培养滤液浸种，播种后18天接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080；c，清水浸种，播种后18天接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080。 

内生真菌CEF-193，于2013年10月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.8302。 

具体实施方式

实施例1菌株的分离 

(一)样品采集 

于6-8月份，选择健康棉株，取主茎的中上部及果枝15cm。 

(二)菌株的分离 

先将采集到的样品(棉花茎杆)用清水洗净，去皮，置于直径为9cm的灭菌的培养皿中，用75％的酒精消毒1min。再用5.0％的次氯酸钠进行消毒60s，用灭菌水洗3次，每次时间不少于3min。然后用灭菌的吸水纸沾干表面的水分，用消毒的剪刀剪成0.4cm长的小段，置于9cm的培养皿中，25℃培养。用最后一遍清洗液为对照，检查消毒是否彻底。每天检查内生真菌的生长情况，发现有菌落长出，及时转移至直径为6cm的培养皿中培养，然后观察其菌落大小、颜色、表面特征、质地。 

(三)CEF-193的特征 

1、形态特征在PDA平板上，菌落呈毡状，表面絮状，最初为白色，后变为灰白色，菌落反面为褐色。显微镜下(400×)该菌株分生孢子梗紧密，扫帚状，长约30μm；分生孢子圆形，大约3.2μm(图1)。 

2、生理特征CEF-193在5-30℃条件下均能生长，最适生长温度是25℃。 

依据CEF-193形态特征、生理特征和分子鉴定结果，将CEF-193归属为芳香顶孢霉(Acremonium alternatum)。 

(四)培养基及培养条件 

1.PDA培养基马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15-20克，水1升，自然pH。称取削皮的200g马铃薯，切成小块置于锅中加水煮烂(煮沸20-30分钟)，用纱布过滤后，滤液中加入葡萄糖和琼脂继续加热搅匀，稍冷却后再补水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20分钟。25℃，黑暗培养7d。 

2.查彼(Czapek)液体培养基KNO₃，2.00g；K2HPO4，1.00g；KCI，0.50g；MgSO₄.7H₂O，0.50g；FeSO₄.7H₂O，0.01g；蔗糖，30.00g；加水至1L，分装到锥形瓶，加塞包扎后120℃灭菌20分钟。置摇床150rpm，25℃，黑暗条件震荡培养7d。 

3.玉米粉沙土培养基将2份玉米粉和1份沙土加适量水(将培养基捏在手中不滴水)混匀，闷半小时后，放入克氏瓶中，120℃灭菌30分钟。25℃，黑暗培养14d。 

实施例2CEF-193对棉花黄萎病菌的抑制作用 

1、试验方法 

对扣培养法。在直径90mm培养皿的皿盖和皿底分别倒入一定量的培养基，皿盖培养基稍少些。凝固后，在皿盖中心接入5μl的芳香顶孢霉CEF-193菌液(查彼液体培养7d)，在皿底中心接种5μl的黄萎病病原菌菌液(查彼液体培养7d)。放入25℃恒温培养箱中，倒置培养，以仅接种病原菌的培养皿为对照，每个处理重复4次。每天观察病原菌及芳香顶孢霉菌丝的生长状况，对扣培养7d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算芳香顶孢霉CEF-193挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率。 

圆盘滤膜法。在直径为9cm的PDA平板上，平铺上直径略大于9cm的双层玻璃纸(硝酸纤维素膜)，在平板中央接种5μl的芳香顶孢霉CEF-193菌液(查彼液体培养7d)，每个处理重复4次，25℃恒温培养箱内培养7d后去玻璃纸，再在平板中央接种接种5μl的黄萎病病原菌菌液(查彼液体培养7d)，25℃恒温培养箱内培养7d。以不含供试菌株代谢产物的PDA平板接种黄瓜枯萎菌为对照。用十字法测定菌落直径，计算抑制率。 

2、试验结果 

对扣培养结果表明，经CEF-193处理的棉花黄萎病菌菌落直径为0.9cm，未经CEF-193处理的菌落直径为5.7cm，CEF-193挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率为84.2％(表1)。 

圆盘滤膜法培养结果表明，经CEF-193处理的棉花黄萎病菌菌落直径为1.2cm，未经CEF-193处理的菌落直径为6.2cm，CEF-193分泌的代谢产物对病原菌生长的抑制率为80.6％(表1，图2)。 

表1CEF-193对棉花黄萎病菌的抑制作用 

实施例3CEF-193对棉花黄萎病的诱导免疫作用 

1、试验方法 

CEF-193经查彼克液体培养基25℃，黑暗条件震荡培养7d，经滤纸过滤后，获得培养滤液用以浸种。对照菌株Vd080(棉花黄萎病强致病力菌株)经查彼克液体培养基25℃，黑暗条件震荡培养7d，经3层纱布过滤后，获得孢子悬浮液用以接种。试验设置4个处理，分别为25％、50％和100％的CEF-193培养滤液及清水浸种，4 个处理均在棉苗一片真叶平展时接种棉花黄萎病菌Vd080分生孢子悬浮液。 

将灭菌后的蛭石和沙子按6：4混合，做直径6cm的无底纸钵，放置45cm×35cm的塑料盘内。以感病品种冀棉11为供试品种，将经脱绒棉籽在CEF-193的培养滤液中浸泡12h后，淋干备播。每钵播种棉花种子8粒，出苗后留苗5株，每处理15个钵，每5个钵为一个重复，3次重复，随机排列。棉花播种后，将塑料盘置温室中，待棉苗一片真叶时，接种Vd080孢子悬浮液10ml，孢子浓度为1×10⁷个孢子/ml。接种方法为，将10ml孢子悬浮液倒入直径10cm的培养皿中，将纸钵从塑料盘中取出放置在培养皿中40s，待孢子悬浮液被吸干后，将纸钵放回塑料盘中。棉苗置18℃-28℃的温室中，按5级分级标准进行病害的分级调查。计算病株率、病情指数和防治效果。 

2、试验结果 

2012年和2013的结果表明，用25％、50％和100％的CEF-193浸种处理的棉苗黄萎病的病情指数分别27.0和29.1，13.5和15.7及23.3和24.9，均显著低于清水对照处理(55.2和57.6)，其防治效果分别为51.1和49.5，75.5和72.7及57.8和56.8，以50％浸种处理的防治效果最好，显著高于25％和100％浸种处理(图3，表2)。 

表2CEF-193对棉花黄萎病的诱导免疫作用 

注：病情指数和防治效果后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(LSD，P＜0.05)v 。

Claims (4)

1.棉花的内生真菌CEF-193，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.8302。

2.权利要求1所述棉花的内生真菌CEF-193用于抑制棉花黄萎病菌的应用。

3.权利要求1所述棉花的内生真菌CEF-193用于免疫诱导棉花黄萎病抗性的应用

4.权利要求1所述内生真菌CEF-193的培养方法，其特征在于，在PDA培养基、查彼液体培养基或棉籽培养基28℃黑暗培养15天。

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