CN103884792B - 基于液相色谱法对乳制品蛋白含量和种类的图形表征方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于液相色谱法对乳制品蛋白含量和种类的图形表征方法。该方法包括：建立乳制品的液相色谱全营养蛋白图谱，任何不同于该全营养蛋白图谱的样品均表明乳制品中蛋白种类或含量有变化；根据乳制品蛋白分离情况将其全营养蛋白图谱中的色谱峰分为几个区域；选定其中一个区域为基准，用化学计量学中多项式进行数字处理以绘制出能显示乳制品特征的、主要为蛋白相对含量的乳制品营养蛋白特征曲线图；与该特征曲线是否偏离成为定性判断乳制品中有无添加物的依据，而以该偏离程度的大小进行定量测定。

Description

基于液相色谱法对乳制品蛋白含量和种类的图形表征方法

技术领域

本发明属于分析化学及食品检验领域。具体而言，涉及一种基于液相色谱法对乳制品中蛋白定性和定量的表征方法。

背景技术

乳制品的质量和安全一直是人们关注的，是与人们生活和健康紧密相关的重大安全问题。乳制品包括了以固体形式存在的各种奶粉和以液体形式存在的各种奶。只要将前者溶在水中，则其和后者一样，变成了一种复杂的乳浊液体系。该专利通称其为液体乳制品，或简称为奶，如牛奶主成分为水，其含量约占87%，其它成分为蛋白质、脂肪、矿物质元素、碳水化合物等。其中，蛋白质为乳制品中的主营养成分，含量约为2%-6%。乳制品中蛋白种类繁多，以酪蛋白（CN）为主约占乳制品蛋白的80%，主要分为α_s1-CN、α_s2-CN、β-CN、κ-CN，以及各自的基因变种等，其中α_s1-CN和α_s2-CN统称为α-CN。剩下20%左右的是乳清蛋白质（Whey protein），主要包括β-Lg、α-La、BSA、IgG以及它们各自的基因变种等。

当今许多对乳制品质量的评价方法主要有测总氮量的凯氏定氮法[1]，测氨基酸总量法[2]和直接测定整体蛋白总含量[3]。凯氏定氮法是通过测总氮量后再换算成总蛋白的含量，故加入任何一种含氮物质都会被误判为蛋白；因测定氨基酸总量的方法不够完善同样又会被误判。测定整体蛋白含量较前二者前进了一大步。然而检测整体蛋白（如红外光谱技法）不能排除还会出现将其它的廉价的或对人类健康有害的物质加入乳制品中的可能。

为了进一步鉴定乳制品中蛋白质的组成和含量，目前还报道毛细管电泳，凝胶电泳和等电聚焦[4-6]可以同时分离酪蛋白和乳清蛋白的每个分量，这可以参见最近陈兴国先生对高效毛细管电泳测定乳制品的进展所做的评述[7]。虽然，这些方法具有快速，自动化的以及在线检测的优点，但是重现性较差。

以上几种检测乳制品的方法所存在的缺陷，必须建立一种较完善、便利、可靠的乳制品质量控制的分析方法，来判断乳制品或其中的掺加物是否符合质量检测标准。然而实际上，这样的要求难以达到。

有报道液相色谱（LC）的一些方法可以定量检测乳制品中的每个主要的营养蛋白以及各自的基因变种。这些LC方法可以在一个色谱梯度洗脱中同时分离和检测，可靠性高。指纹图谱技术是从整体上对某一组化合物进行表征和评价的有效方法。如某蛋白降解后的肽谱，中草药中有效成分的指纹图等。它具有系统性、选择性、重现性和稳定性高的特点。该法是通过对比标准品和待测样品指纹图谱中的部分特征色谱峰的相似度来对复杂组分样品进行品质评价。

为此，本申请提供了一种新型的基于LC的定量、定性分析方法，其建立在发明人的这样一种发现，多数情况下定量分析只对其中的一种成分进行测定，鉴于乳制品蛋白质组成繁多，包括各种蛋白的基因变种和不同程度化学修饰的变异体，是一个复杂的多组分体系。然而，对于某一种乳制品而言，尽管成分繁杂，其成分（例如，尤其是蛋白质）的绝对含量和相对含量却具有相当程度的稳定性。这种稳定性使得有可能对乳制品进行图谱（profile）分析，从而获得某类乳制品所特有的各种蛋白的整体概况，即也可获得其独有的特征曲线。当这种独特曲线改变时，就指示着其中蛋白成分或其状态的改变。基于这种变化，乳制品领域的技术人员可以快速、简便地判断乳制品是否掺加了其它添加物或乳制品的质量是否发生了改变等。这为乳制品主要蛋白进行分析提供了很大的应用潜力。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了一种乳制品蛋白的图形表征方法，其包括步骤：

a提供乳制品样本；

b对乳制品样本进行液相色谱分析；

c获得乳制品样本中蛋白的液相色谱图，即全营养蛋白图谱；

d对全营养蛋白图谱进行区域划分；

e相对于内标物峰面积S_M，对所划分的各区域的峰面积S_X进行归一化处理，获得各区域的相对峰面积

f对各区域的相对峰面积进行排序；

g对排列顺序i和相对峰面积所构成数据对进行曲线拟合，获得多项式：

R=a₁i^n-1+a₂i^n-2+a₃i^n-3…+a_n，

其中R为a₁、a₂、a₃…a_n为多项式系数；n为区域个数；

h以i为横坐标，以为纵坐标，将步骤g获得的多项式绘制成曲线，即乳制品的营养蛋白特征曲线（characterization curve of nutrition proteins,CCNP）。

在一些实施方式中，乳制品为固体乳制品或液体乳制品。在一些具体实施方式中，为了便于液相色谱操作，乳制品是液体乳制品。然而，本领域技术人员理解，固体乳制品可以制备成液体形式，而用于本发明的方法。

在一些实施方式中，乳制品源自哺乳动物或植物。在一些具体实施方式中，乳制品选自牛乳制品、羊乳制品、配方乳制品、豆类乳制品中的一种或多种、或者它们的混合物。在一些具体实施方式中，所述乳制品是牛奶、羊奶、豆浆、掺加羊奶的牛奶、掺加牛奶的羊奶、掺加豆浆的牛奶、掺加豆浆的羊奶中的一种或多种。

在一些实施方式中，可以按照适于后续色谱操作的任何方式提供乳制品样本。在一些具体实施方式中，对乳制品样本进行预处理之后再进行色谱操作。在一些具体实施方式中，对乳制品的预处理包括蛋白质的变性。在一些具体实施方式中，对乳制品的预处理还包括除去脂肪，以免堵塞色谱柱等。

在一些实施方式中，液相色谱选自反相液相色谱、离子交换色谱和疏水液相色谱中。在一些具体实施方式中，液相色谱为反相液相色谱。应当理解，只要能够有效地分开乳制品中的不同蛋白组分，可以采用本领域公知的任何方式、利用本领域公知的任何适当的装置来进行液相色谱。

在一些具体实施方式中，可以采用色谱柱、或液相色谱仪进行液相色谱。色谱柱通常为填充柱和整体住。装填的色谱介质平均粒径为100nm至10μm之间，平均孔径为8nm至100nm之间。色谱柱可以是自行制备的，也可以是市售的。色谱柱的尺寸、型号可以根据待测样本类型、实验室条件等因素由技术人员确定，例如但不限于色谱柱内径为1mm至5mm、长度为20mm至250mm；甚至还可以使用内径为30μm至1000μm的毛细管色谱柱。在另一些实施方式中，可以采用色谱饼（即饼形色谱柱，或直径大于厚度的色谱柱）。在另一些实施方式中，色谱饼的长度是3-10mm，优选5-7mm；色谱饼的直径5-15mm；优选8-12mm；在一个具体实施例中，色谱饼长5mm，直径10mm。

应当理解，所用液相色谱的流动相是本领域技术人员已知的流动相。本领域技术人员可以根据色谱原理、或者根据色谱装置制造商的推荐，确定梯度洗脱模式、流速、温度、时间、检测器等参数。

在一个具体实施方式中，液相色谱按照如下条件或参数进行：

色谱柱：将填料（粒径为3μm；孔径为30nm）装填于色谱柱（150mm×4.6mmI.D）中；

流动相为：A液：水+0.1%TFA(v/v)；B液：乙腈+0.1%TFA(v/v)；

线性洗脱梯度：32-37%B；梯度时间为50min；流速1.0mL/min；

温度为室温；检测波长为280nm。

在一些具体实施方式中，根据谱图中蛋白的分离情况，对全营养蛋白图谱进行区域划分。将相邻的不能达到基线分离的色谱峰划分到一个区域，然后在此基础上再根据整个图谱被划分情况进行协调，尽量避免区域之间峰面积差别特别大的情况。

在一些具体实施方式中，步骤d中将全营养蛋白图谱划分为3-8个区域；优选5-6个区域。可以理解，随着待测样本的类型不同，区域划分的个数可以不同，因为这与样本中蛋白质种类有关。其中，每个区域可以包括若干（例如1-5个）色谱峰，因此各区域的峰面积为S_X表示区域X的峰面积值；Si表示区域X中第i个色谱峰的面积，m表示区域X由m个色谱峰组成。

例如，在一些具体实施方式中，将牛奶的全营养蛋白图谱划分为5个区域（A、B、C、D和E），其中区域A为四种κ-CN（峰1至4）的峰；区域B是两种αs2-CN峰（峰5至6）；区域C是两种αs1-CN的峰（峰7至8）；区域D是两种β-CN的色谱峰（峰9至10）；和区域E是乳清蛋白，包括总共5种蛋白的峰（峰11至15）。而在另一些具体实施方式中，将羊奶的全营养蛋白图谱划分为6个区域。

在一些具体实施方式中，步骤e中相对于内标物峰面积S_M，对所划分的各区域的峰面积S_X进行归一化处理，获得各区域的相对峰面积其中乳制品中天然存在的任何蛋白可以作为内标，换言之图谱上任意区域的蛋白作为内标均是可以的。在一些具体实施方式中，内标物为乳清蛋白。乳清蛋白质主要包括β-Lg、α-La、BSA、IgG以及它们各自的基因变种等。

应当理解的是，步骤f中对各区域的相对峰面积进行排序的目的在于将全营养蛋白图谱上划分的不同区域沿着横坐标轴排横向排开，以便于随后的曲线拟合计算。鉴于此，在一些具体实施方式中，排序可以从小到大、或从大到小、或按照任意固定顺序。在一些具体实施方式中，排序从小到大进行。在一些具体实施方式中，横坐标的间隔为等距、或者不等距；优选等距。在一些具体实施方式中，为便于计算，横坐标的间隔是等距的，例如，但不限于，按照1、2、3、……n的顺序。

在一些具体实施方式中，将排列顺序i和相对峰面积组成数据对 。之后，采用本领域公知的数学算法，对该数据对进行曲线拟合。曲线拟合是指选择适当的曲线类型来拟合所观测的数据，并用拟合的曲线方程分析两变量间的关系。可以采用本领域中已知的数学算法或采用这种算法的市售软件进行拟合，例如但不限于Excel、OriginPro、Matlab、SAS、SPSS、DataFit、GraphPad、TableCurve2D、TableCurve3D等。

根据本发明的另一方面，提供了一种确定乳制品总蛋白含量的方法，其包括步骤：

1）对于待测乳制品样本，进行如前所述表征方法的步骤a至e，然后计算总相对峰面积R_total：

$R_{\mathrm{total}}=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{R}_{(S_X/S_M)},$ 其中n为区域个数；

2）提供一系列已知含量的内标物，在相同色谱条件下进行如前所述表征方法的步骤a至c，以含量相对于峰面积绘制标准曲线；

3）将待测乳制品样本的S_M带入步骤2）的标准曲线中，换算得出待测乳制品样本中内标物的含量c；

4）计算c×R_total，获得乳制品总蛋白含量。

根据本发明的另一方面，提供一种判断乳制品中蛋白组分含量变化的方法，其包括步骤：

1）对于参考乳制品样本，进行如前所述表征方法的步骤a至h，获得参考乳制品样本的CCNP；

2）对于待测乳制品样本，在相同液相色谱条件下，进行如前所述表征方法的步骤a至h，其中使得相对峰面积的排列顺序与参考乳制品样本中相对峰面积的排列顺序保持相同，获得待测乳制品样本的CCNP；

3）定性比较两者的CCNP，当存在正误差时，表明待测乳制品样本中有添加物；当存在负误差时，表明待测乳制品样本中对应的某种蛋白含量降低了。

在一些实施方式中，可以将参考乳制品的CCNP与待测乳制品样本的CCNP放在同一个坐标体系中进行“曲线-曲线”轮廓比较，通过这种比较，允许技术人员迅速作出判断，确定有无外加添加物的定性鉴别。

除了定性判断，需要时还包括步骤：

4）定量比较参考和待测乳制品样本的CCNP，当存在正误差时，计算添加物的含量；当存在负误差时，计算待测乳制品样本中对应的某种蛋白含量的降低。

根据本发明的另一方面，提供一种判断乳制品品质改变方法，其包括步骤：

1）对于新鲜乳制品样本，进行如前所述表征方法的步骤a至h，获得新鲜乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

2）对于待测乳制品样本，在相同液相色谱条件下，进行如前所述表征方法的步骤a至h，其中使得相对峰面积的排列顺序与新鲜乳制品样本中相对峰面积的排列顺序保持相同，获得待测乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

3）比较两者的营养蛋白特征曲线，当存在误差时，表明待测乳制品样本发生了品质改变；误差程度的大小指示着品质改变程度的大小。

在一些实施方式中，所述品质改变可以是由于过保质期、保存条件不当、污染等因素造成的。在一些具体的实施方式中，待测乳制品样本是包装开启不同时间后的乳制品。

在一些实施方式中，可以将新鲜乳制品的CCNP与待测乳制品样本的CCNP放在同一个坐标体系中进行“曲线-曲线”轮廓比较，通过这种比较，允许技术人员迅速作出判断，确定乳制品是否发生了品质的改变。

本发明的优点：

①本发明用全营养蛋白图谱和乳制品营养蛋白特征曲线来检测乳制品中未知的添加物,与传统的检测总氮总氨基酸或者总蛋白方法相比，乳制品营养蛋白特征曲线选择性更高。

②本发明是基于多个独立的变量而建立的，这样要比传统的基于传统的基于一个变量的方法更可靠。

③本发明既可以对乳制品中有无添加物作定性检测，也可进行乳制品蛋白成分定量测定。

④本发明允许对乳制品的品质是否发生改变以及改变的程度进行判断，从而对乳制品品质得出了建议性的评价。

⑤图像或图谱是一种快速、简单、明了的测定结果直观表示法，可将通常只能以表列出的多参数变化，变得一目了然，适合复杂组分变化的表征。

附图说明

图1牛奶的全营养蛋白图谱及其区域划分。

图2乳制品的“营养蛋白特征曲线”示意图。

图3羊奶全营养蛋白图谱及其区域划分。

图4羊奶的CCNP。

图5掺有不同比例牛奶的羊奶全营养蛋白图谱。

图6掺有不同比例牛奶的羊奶CCNP；

◆纯羊奶，■掺有5%牛奶的羊奶，▲掺有10%牛奶的羊奶，●掺有15%牛奶的羊奶，掺有20%牛奶的羊奶。

图7牛奶的全营养蛋白图谱及其区域划分。

图8牛奶的CCNP。

图9掺有不同比例豆浆的牛奶全营养蛋白图谱。

图10掺有不同体积豆浆的牛奶的CCNP；

◆纯牛奶，■掺有5%豆浆的牛奶，▲掺有10%豆浆的牛奶，×掺有20%豆浆的牛奶，掺有50%豆浆的牛奶。

图11A和11B分别表示品牌A和品牌B乳制品变质过程中的全营养蛋白图谱变化。

图12A至12B：品牌A乳制品变质过程中的CCNP；

品牌A乳制品变质过程中的CCNP，其中◆新鲜牛奶，■开封后8小时，▲开封后16小时，●开封后24小时，开封后40小时。

图12C至12D：品牌B乳制品变质过程中的CCNP；

品牌B乳制品变质过程中的CCNP，其中◆新鲜牛奶，■开封后8小时，▲开封后16小时，●开封后24小时，开封后40小时。

图13反相色谱饼对牛奶主要蛋白快速分离的色谱图。

图14反相色谱饼27分钟内对牛奶样品的连续10次分离检测。

具体实施方式

下面实施结合实施例对本发明进行详细说明。

仪器设备与试剂

高效液相色谱仪（日本岛津公司）包括2个LC-20AT输液泵、7752i手动进样阀、SCL-10Avp系统控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、CLASS-VP6.14色谱工作站等；离心机（美国SORVALL公司）；超纯水系统（美国PALL公司）。

盐酸胍和二硫苏糖醇、柠檬酸钠、三羟甲基甲烷（Bis-Tris）；蛋白质标准品（α-CN，β-CN，κ-CN，美国Sigma-Aldrich公司）；三氟乙酸（TFA）和乙腈（美国Fisher公司）

实施例

实施例1提供乳制品样品

a、变性液的配制

变性液为0.1mol/L三羟甲基甲烷、6.0mol/L盐酸胍、19.0mol/L二硫苏糖醇和5.0mmol/L柠檬酸钠的pH=7.0的混合溶液。

b、液态乳制品的预处理方法

准确移取1mL乳制品于50mL离心管中，加入1mL变性液。缓慢震荡，避免产生气泡，室温下变性30分钟，在4℃、20,000r/min的转速离心10分钟，去掉上层脂肪，取下层清液，以滤膜过滤后，储存于4℃冰箱中，待测。

c、固态乳制品的预处理方法

称取一定量的固态乳制品（如奶粉），溶于一定的水中，再以b中所述方法进行预处理。

实施例2通过反相高效液相色谱（RPLC）建立乳制品样品的全营养蛋白图谱

按照如下实验条件，对实施例1提供的样本进行色谱分析，获得色谱图（即乳制品全营养蛋白图谱）。

色谱条件：

色谱柱为：将RP-C₁₈填料（粒径为3μm；孔径为30nm）在4,000PSI的压力下装填在不锈钢空柱管（150mm×4.6mm I.D）中。

流动相为：A液：H₂O+0.1%TFA(v/v)；B液：ACN+0.1%TFA(v/v)。

洗脱梯度为：32%-37%B；梯度时间为50min。

检测温度为室温；检测波长为280nm；流速1mL/min。

实施例3：对乳制品蛋白的全营养蛋白图谱进行分区

依据在RPLC中的流出顺序分为（例如，图1阴影所示的）n个区域，并分别以A、B、C、D、E…表示，并可求得各区域中的所有峰面积的积分和S_A、S_B、S_C、S_D…，某个区域X中所有峰面积和S_X可表示为：

$S_X=\underset{i=1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{S}_i---\left(1\right)$

上式（1）中S_X表示区域X的峰面积值；Si表示区域X中第i个色谱峰的面积，m表示区域X由m个色谱峰组成。

如图1所示的牛奶全营养蛋白图谱可分为A、B、C、D和E5个区，其中A、B、C、D、和E（图中的5个虚线隔离区）并可求得各区域中的所有峰面积的积分和，则区域A为是四种κ-CN（峰1至4）的峰面积和；区域B是两种αs2-CN峰（峰5至6）的面积的积分和；区域C是两种αs1-CN（峰7至8）的面积的积分和；区域D是β-CN的两种色谱峰（峰9至10）的面积积分和；区域E是乳清蛋白，是包括4种乳清蛋白在内的共5种蛋白组分（峰11至15）的面积的积分和。

反相色谱的出峰是按不同蛋白的疏水性（极性）大小顺序依次流出色谱柱的，结合文献中的已有研究，本申请用对应的蛋白质标准品对每个蛋白进行定位，且蛋白质的出峰顺序和情况也与文献报道一致，由此可以获知不同区域的峰分别代表着什么具体蛋白质。当然，技术人员理解，即便不知道各区域代表着何种成分，仍然不妨碍本发明的实施、和技术效果的体现。

实施例4绘制乳制品CCNP

当选取某区域M为内标时，M区的峰面积就作为“1”，总的相对峰面积Rtotal就等于其余区域的相对峰面积值之和，即：

$R_{\mathrm{total}}=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{R}_{(S_X/S_M)}---\left(2\right)$

式(2)中S_M表示内标区域M的峰面积值；S_M表示其它n-1个区域的峰面积的值；表示其它区域的与内标区域M的峰面积的比值。

将A/X、B/X、C/X、D/X…优选以从小到大的顺序排序，排列顺序i为等距离的1、2、3、4…。对于数据对进行多项式进行拟合，所拟合的多项式与最初所分的区域的个数有关。区域个数为n时，优选的多项式为n-1项式。如下：

R=a₁i^n-1+a₂i^n-2+a₃i^n-3…+a_n  （3）

式(3)中，R即为i表示横坐标，取值为1,2,3…n，a₁、a₂、a₃…a_n为多项式的系数。

以为纵坐标，以i为横坐标作图，得到一条自下单调向上的平滑曲线，这样的曲线可以用来表征乳制品中主要蛋白含量的特征，称其为乳制品“营养蛋白特征曲线”（Chracterization Curve of nutrition protein，CCNP）（图2）。

实施例5乳制品中总蛋白含量的测定方法

配制一系列区域M的蛋白的标准品溶液，并在与实施例2同样的色谱条件分别测试其色谱峰面积，以绘制一条标准曲线。

再将奶制品中区域M的色谱峰面积代入标准曲线方程中得到M区蛋白的浓度，换算得出M区蛋白在对应乳制品中的含量c。

最后将这个含量c乘以R_total，从而得出以M区蛋白表示的乳制品中总蛋白的含量。

实施例6判断乳制品中蛋白组分含量变化的方法

向乳制品中加入一系列浓度的添加物时，所加添加物的浓度与掺有添加物的乳制品的CCNP所拟合的多项式系数之间存在着线性关系，如下：

式中a₁’、a₂’、a_n’和a₁”、a₂”、a_n”分别代表线性系数，以来说，a₁与添加物的浓度之间呈线性关系（一次函数），其中a₁’为此一次函数的斜率，a₁”为此一次函数的截距；表示乳制品中添加物的浓度。那么乳制品中添加物的浓度就可以表示为：

取的平均值便可得知乳制品中添加物的浓度，再换算为乳制品中增加或者减少的蛋白含量。

测试例1羊奶中掺有牛奶的定性测定

1.样品处理方法

如实施例1。

2.纯羊奶的前处理

如实施例2。

3.掺有牛奶的羊奶的前处理

将一定体积的牛奶X mL，加入到(1-X)mL的纯羊奶中，然后再与9mL的处理液混合后在室温培养30分钟，之后的处理步骤同纯羊奶的前处理步骤。

4.羊奶“营养蛋白特征曲线”的建立

纯羊奶的全营养蛋白图谱见图3，将其全营养蛋白图谱中的13个峰分为A、B、C、D、E和F六个分区。优选D区为内标，将它的色谱峰面积和定为1，并与其它五个区域A、B、C、E、F与D比，得到相对峰面积。将相对峰面积比值按其大小顺序排列，得：B＜C＜A＜F＜E＜D。排列顺序为1，2，3，4、5、6。

对数据对（排列顺序，相对峰面积）进行五项式拟合。最后得到一条自下单调向上的平滑曲线就称为羊奶的CCNP，见图4。

5.对掺有牛奶的羊奶进行定性测定

图5为给羊奶中加入不同的体积百分比（5%、10%、15%和20%，V/V）的牛奶后所对应的色谱图。图6为掺有不同比例牛奶的羊奶样品的CCNP。通过比较可以得出：当加入牛奶的加入量低到5%（V/V）时，通过图6仍能明显地判断出有加入物的结论。从而对掺有其它物质的羊奶做出定性判断。

测试例2羊奶中掺有牛奶的定量测定

表1列出了各个加入牛奶浓度下羊奶的CCNP所拟合的五项式方程。

表1.掺有不同体积牛奶的羊奶的CCNP所拟合的多项式方程

根据表1，每个羊奶的体积分数拟合的方程中具体的a,b,c,d,e,f的值，可以得到表2中的六个线性方程。

表2.CCNP拟合五项式方程的个项系数与所掺牛奶的体积分数的线性方程

由表2中的线性关系反推羊奶中掺有牛奶体积比的值，就可验证对羊奶中加入牛奶进行定量检测的可行性。从表3可以看出实际加入的牛奶体积分数的实际值与所计算的理论值的相对标准偏差从±1.96%到±11.26%，平均偏差为±6.89%。结果表明只要羊奶中掺有的体积浓度(V/V)≥6.89%的牛奶，此方法就可以检测出。

表3.由各系数方程计算的羊奶中加入牛奶的体积分数实际值与理论值的偏差

测试例3牛奶中掺有豆浆的定性测定

1.样品处理方法

按实施例1。

2.纯牛奶的前处理

按实施例2。

3.掺有豆浆的牛奶的前处理

将一定体积的豆浆X mL，加入到(1-X)mL的纯牛奶中，然后再与9mL的处理液混合后在室温培养30分钟，之后的处理步骤同纯牛奶的前处理步骤。

4.牛奶CCNP的建立

纯牛奶的全营养蛋白图谱见图7，将其全营养蛋白图谱中的15个峰分为A、B、C、D和E五个分区。优选E区为内标，将它的色谱峰面积和定为1，并与其它四个区域A、B、C、D与E比，到相对峰面积。将相对峰面积按其大小顺序排列，得：B＜A＜D＜E＜C。排列顺序为1、2、3、4、5。

对数据对（排列顺序，）进行五项式进行拟合。最后得到一条自下单调向上的平滑曲线就称为牛奶的CCNP，见图8。

5.对掺有豆浆的牛奶进行定性测定

图9为给牛奶中加入不同的体积百分比（5%、10%、20%和50%，V/V）的豆浆后所对应的色谱图。图10为牛奶中掺有不同比例豆浆的样品的CCNP。

通过比较可以得出：当加入豆浆的加入量低到5%（V/V）时，通过图10仍能明显地判断出有加入物的结论。从而对掺有其它物质的牛奶做出定性判断。

测试例4乳制品变质过程的测定

购买两种品牌（A和B）的纯乳制品，对它们在开封后30℃条件下的变质过程对进行了测定。我们选取了五个时间点，分别为开封后0h、8h、16h、24h和40h，对其全营养蛋白图谱与CCNP曲线进行了比较。

图11A和图11B为同一次实验的品牌A和B在这五个时间点的色谱图，图12A至D为分别进行三次重复实验后根据各色谱图对应区域的三次平均值所绘制的CCNP。对此乳制品变质实验进行的三次重复实验，结果相互吻合。

从图12A和12C可以发现，在24h时乳制品的CCNP发生了突变，结合图11A和11B可以发现，这种突变是由于乳制品蛋白变质或降解而导致蛋白含量降低所引起的。从图12B和12D可以得出乳制品在30℃下在、16小时以内相对24小时变化不大，但16h时已有明显的变化，8h变化较小。

测试例5反相色谱饼对牛奶样品的快速检测

按照如下实验条件，对实施例1提供的样本进行色谱分析，获得色谱图（即乳制品的全营养蛋白图谱）。

色谱条件：

色谱柱为：将RP-C18填料（粒径为3μm；孔径为30nm）在4,000PSI的压力下装填在不锈钢空短柱管（5mm×10mm I.D）中。此类色谱柱较短而横截面积较大，外观呈饼状，故称为色谱饼。

流动相为：A液：H₂O+0.1%TFA(v/v)；B液：ACN+0.1%TFA(v/v)。

洗脱梯度为：30%-43%B；梯度时间为2min。

检测温度为室温；检测波长为280nm；流速10mL/min。

图13为反相色谱饼对牛奶主要蛋白的快速分离的色谱图，与图1相比色谱饼对牛奶的分离效果远不如色谱柱。不过对于定性分析而言，它并不要求对复杂样品的每个成分都达到完全分离。图13的分离效果虽然不佳，但其速度相当快，对牛奶样品的分离只花费了2分钟。将其分为四个区（见图13）。只要有任何新的色谱峰出现，或在该9个色谱峰之间的空隙，或与该9个色谱峰完全或部分重叠，即便可能不知道这些新的色谱峰各代表是何种物质，但仍然可做出牛奶样品中有添加物存在的结论。

图14是用反相色谱饼对牛奶样品进行连续10次分离检测，所用时间只有27分钟。充分说明了用此方法检测乳制品的速度之快。

测试例6建立CCNP数据库

乳制品CCNP随着所用乳制品的来源、产地、季节、生产工艺等因素而不同，可以绘制能反映这种不同点的乳制品CCNP，并建立数据库，以供随时调用。

参考文献

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Claims (20)

1.一种乳制品蛋白的图形表征方法，其包括步骤：

a)提供乳制品样本；

b)对乳制品样本进行液相色谱分析；

c)获得乳制品样本中蛋白的液相色谱图，即全营养蛋白图谱；

d)对全营养蛋白图谱进行区域划分，其中所述区域是根据谱图中蛋白的分离情况来划分的；

e)相对于内标物峰面积S_M，对所划分的各区域的峰面积S_X进行归一化处理，获得各区域的相对峰面积R_(SX/SM)；

f)对各区域的相对峰面积R_(SX/SM)进行排序；

g)对排列顺序i和相对峰面积R_(SX/SM)所构成数据对(i，R_(SX/SM))，进行曲线拟合，获得多项式：

R＝a₁i^n-1+a₂i^n-2+a₃i^n-3···+a_n，

其中R为R_(SX/SM)；a₁、a₂、a₃…a_n为多项式系数；n为区域个数；

h)以i为横坐标，以R_(SX/SM)为纵坐标，将步骤g)获得的多项式绘制成曲线，即乳制品的营养蛋白特征曲线。

2.一种确定乳制品总蛋白含量的方法，其包括步骤：

1)对于待测乳制品样本，进行如权利要求1所述的步骤a)至e)，然后计算总相对峰面积R_total：

$R_{\mathrm{total}}=\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{R}_{(S_X/S_M)},$ 其中n为区域个数；

2)提供一系列已知含量的内标物，在相同色谱条件下进行如权利要求1所述的步骤a)至c)，以含量相对于峰面积绘制标准曲线；

3)将待测乳制品样本的S_M带入步骤2)的标准曲线中，换算得出待测乳制品样本中内标物的含量c；

4)计算c×R_total，获得乳制品总蛋白含量。

3.一种判断乳制品中蛋白组分含量变化的方法，其包括步骤：

1)对于参考乳制品样本，进行如权利要求1所述的步骤a)至h)，获得参考乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

2)对于待测乳制品样本，在相同液相色谱条件下，进行如权利要求1所述的步骤a)至h)，其中使得相对峰面积R_(SX/SM)的排列顺序与参考乳制品样本中相对峰面积R_(SX/SM)的排列顺序保持相同，获得待测乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

3)定性比较两者的营养蛋白特征曲线，当存在正误差时，表明待测乳制品样本中有添加物；

当存在负误差时，表明待测乳制品样本中对应的某种蛋白含量降低了。

4.根据权利要求3所述的判断乳制品中蛋白组分含量变化的方法，其还包括步骤：

4)定量比较两者的营养蛋白特征曲线，当存在正误差时，计算添加物的含量；

当存在负误差时，计算待测乳制品样本中对应的某种蛋白含量降低的量。

5.一种判断乳制品品质改变方法，其包括步骤：

1)对于新鲜乳制品样本，进行如权利要求1所述的步骤a)至h)，获得新鲜乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

2)对于待测乳制品样本，在相同液相色谱条件下，进行如权利要求1所述的步骤a)至h)，其中使得相对峰面积R_(SX/SM)的排列顺序与新鲜乳制品样本中相对峰面积R_(SX/SM)的排列顺序保持相同，获得待测乳制品样本的营养蛋白特征曲线；

3)比较两者的营养蛋白特征曲线，当存在误差时，表明待测乳制品样本发生了品质改变；误差程度的大小指示着品质改变程度的大小。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述乳制品为固体乳制品、或液体乳制品。

7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中

所述乳制品源自哺乳动物或植物；所述乳制品选自牛乳制品、羊乳制品、配方乳制品、豆类乳制品中的一种或多种、或者它们的混合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述乳制品选自牛奶、羊奶、豆浆的一种或多种、或者它们的混合物。

9.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述液相色谱选自反相液相色谱、离子交换色谱和疏水液相色谱中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述液相色谱为反相液相色谱。

11.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中将全营养蛋白图谱划分为3-8个区域。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将全营养蛋白图谱划分为5-6个区域。

13.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中

所述排序可以从小到大、或从大到小、或按照任意固定顺序。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述排序为从小到大的顺序。

15.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述横坐标的间隔为等距、或者不等距。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述横坐标的间隔为等距。

17.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中

所述内标物为乳制品中天然存在的蛋白。

18.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中

所述液相色谱所采用的色谱柱是填充柱或整体柱；

色谱柱的填充介质的平均粒径在100nm至10μm之间，平均孔径在8nm至100nm之间；

色谱柱内径1mm至5mm且长度为20mm至250mm，或

色谱柱是内径为30μm至1000μm的毛细管色谱柱。

19.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中

所述液相色谱所采用的色谱柱是色谱饼；

色谱饼的长度是3-10mm；

色谱饼的直径5-15mm。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述色谱饼的长度是5-7mm，所述色谱饼的直径8-12mm。