CN103884716A - 一种林麝粪便寄生虫卵检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种林麝粪便寄生虫卵检测方法。本发明公开了一种检测林麝粪便中寄生虫虫卵的方法，包括如下步骤：（1）采集排出体外时间小于24小时的林麝粪球；（2）将粪球研磨，得到研碎的粪便；（3）将研碎的粪便与漂浮液混匀，得到混匀的溶液；（4）将步骤（3）得到的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤，得到滤液。本发明公开的方法对于圈养林麝寄生虫防治，提高圈养林麝种群质量和生产性能方面有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种林麝粪便寄生虫卵检测方法。
背景技术
林麝（Moschus berezovskii），俗称香獐，是我国重要的野生动物资源，国家一级保护动物。成年雄麝的麝香腺分泌物-麝香，是名贵中药和高级香水的重要原料之一。由于其巨大的经济价值，近年来对于野生林麝的偷猎日益猖獗，加上持续不断的人为干扰和栖息地破坏，野生林麝的分布范围急剧缩小，种群数量急剧下降，有些地区野生林麝已经濒于灭绝，人工圈养林麝成为保护林麝免于灭绝和满足麝香市场需求的有效途径。由于自然环境、圈舍通风设计、圈舍卫生和圈养密度等因素，圈养林麝也和其他圈养动物一样无法逃避寄生虫滋生的问题。圈养林麝，尤其是幼麝和仔麝较低的成活率，使圈养种群难以扩大，一直是制约我国养麝业发展的主要因素之一，其中寄生虫感染致死是其中一大原因。
我国开展人工圈养林麝50多年来，对圈养林麝的饲养管理、营养、繁育和疾病防治进行了广泛而深入的研究探索。但对于疾病防治的研究则主要集中于一些常见疾病的研究，而缺乏对于寄生虫的系统而连续的研究。究其原因，缺乏一种适用于林麝的粪便寄生虫卵检测方法是一关键因素。不同种类的寄生虫比重不同，寄生虫卵漂浮法所采用的溶剂的比重也各不相同，漂浮不同种类的寄生虫卵的最优溶剂也随着寄生虫比重的变化而变化。
从粪便中检测寄生虫有利于实时监测种群的健康状况，便于及时开展针对性的防控措施。一种方便有效的林麝粪便寄生虫卵计数方法的获得，便于麝场实时快速的检测种群中寄生虫感染情况。不同种类寄生虫卵的漂浮法最优溶剂的获得，便于麝场根据实际情况选择性的检测寄生虫。
发明内容
本发明的目的是提供一种林麝粪便寄生虫卵检测方法。
本发明提供的一种检测林麝粪便中寄生虫虫卵的方法，包括如下步骤：
（1）采集排出体外时间小于24小时的林麝粪球；
（2）将粪球研磨，得到研碎的粪便；
（3）将研碎的粪便与漂浮液混匀，得到混匀的溶液；
（4）将步骤（3）得到的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤，得到滤液；
（5）对滤液中的寄生虫虫卵进行计数，得到单位体积滤液中寄生虫虫卵的含量N；
（6）按照如下公式计算单位质量的粪便中寄生虫虫卵的数量EPG：
EPG=N×V÷m
V为步骤（4）得到的滤液的总体积，m为步骤（3）所用粪便的质量；
所述漂浮液为比重大于所述寄生虫虫卵并不破坏寄生虫虫卵完整性的溶液。
上述方法中，所述步骤（1）中粪球质量不少于10g；
采集粪球后如果不能立即进行所述步骤（2），所述步骤（1）还包括将所述粪球保存于福尔马林溶液中的步骤；
所述粪球与所述福尔马林溶液的比例具体为1g：4ml；
所述保存的方法为将所述粪球捏破并保证粪球完整再将其保存于福尔马林溶液中。
上述任一所述的方法中，所述步骤（3）中所述研碎的粪便的质量为2g；
所述漂浮液的体积为58ml，所述公式中V为60ml，m为2g；
所述寄生虫虫卵计数时采用麦克马斯特计数板。
上述任一所述的方法中，所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵、线虫虫卵、蛔虫虫卵、球虫虫卵或吸虫虫卵。
上述任一所述的方法中，所述漂浮液为饱和硝酸钠水溶液、饱和氯化钠水溶液或饱和蔗糖食盐水溶液；
所述饱和蔗糖食盐水溶液为蔗糖和氯化钠的饱和水溶液。
所述饱和氯化钠水溶液为氯化钠的饱和水溶液。
所述饱和硝酸钠水溶液为硝酸钠的饱和水溶液。
上述任一所述的方法中，所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵时，所述漂浮液为饱和硝酸钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为线虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为蛔虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为球虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液。
上述任一所述的方法在检测林麝粪便中寄生虫虫卵中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵、线虫虫卵、蛔虫虫卵、球虫虫卵或吸虫虫卵。
本发明提供的方法对于圈养林麝寄生虫防治，提高圈养林麝种群质量和生产性能方面有重要的意义。
附图说明
图1为林麝粪便中鞭虫虫卵形态。
图2为林麝粪便中线虫虫卵形态。
图3为林麝粪便中蛔虫虫卵形态。
图4为林麝粪便中球虫虫卵形态。
图5为林麝粪便中吸虫虫卵形态。
图6为三种漂浮溶剂检测林麝粪便中5种寄生虫的EPG比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的氯化钠、蔗糖、硝酸钠和去离子水，均可从商业途径获得。
饱和氯化钠水溶液按照如下方法制备：先在去离子水中加入过量的氯化钠，然后给加入过量氯化钠的溶液加热，并煮沸5分钟，若发现氯化钠溶解完，则继续加入氯化钠，直至不再溶解为止，纱布滤去残渣，冷却至室温备用。
饱和蔗糖食盐水溶液按照如下方法制备：称取500g蔗糖，加入320ml去离子水，加热并搅拌至蔗糖完全溶解，然后向蔗糖溶液中加入氯化钠，并煮沸溶液5分钟，直至氯化钠不再溶解为止，纱布滤去残渣，冷却至室温备用。
饱和硝酸钠水溶液按照如下方法制备：先在去离子水中加入过量的硝酸钠，然后给加入过量硝酸钠的溶液加热，并煮沸5分钟，若发现硝酸钠溶解完，则继续加入硝酸钠，直至不再溶解为止，纱布滤去残渣，冷却至室温备用。
实施例1、林麝粪便中寄生虫卵检测方法
一、鞭虫虫卵检测
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比在1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
4.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml漂浮液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
5.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
6.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
7.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有鞭虫虫卵计数。鞭虫虫卵形态如图1所示。
8.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
二、线虫虫卵检测
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
4.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml漂浮液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
5.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
6.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
7.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有线虫虫卵计数，线虫虫卵形态如图2所示。
8.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
三、蛔虫虫卵检测
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
4.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml漂浮液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
5.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
6.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
7.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有蛔虫虫卵计数，蛔虫虫卵形态如图3所示。
8.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
四、球虫虫卵检测
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
4.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml漂浮液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
5.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
6.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
7.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有球虫虫卵计数，球虫虫卵形态如图4所示。
8.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
五、吸虫虫卵检测
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
4.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml漂浮液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
5.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
6.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
7.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有吸虫虫卵计数，吸虫虫卵形态如图5所示。
8.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
以上寄生虫检测中漂浮液的最优溶剂的选择如实施例2所示。
实施例2、林麝不同种类寄生虫漂浮法检测的最优溶剂选择
一、鞭虫漂浮法检测的最优溶剂选择
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.溶剂配制：本发明选择的三种虫卵漂浮法溶剂为饱和氯化钠水溶液、饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液。
4.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
5.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml饱和氯化钠水溶液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
6.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
7.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
8.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有虫卵计数。
9.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
10.重复：分别将溶剂换成饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，重复上述1-9步骤，得出不同溶剂检测到虫卵的EPG（eggs per gram）。
11.数据分析：实验取得的数据通过Excel2010进行数据分析，使用Excel2010数据绘图。数据结果以"Mean士1.5SD"的形式表示（见表1）。组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），显著水平设置α=0.05。
表1三种漂浮溶剂检测林麝粪便中寄生虫卵的数量
12.结果：得到结果如图6所示，三种溶剂检测鞭虫，饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液检测结果均极显著的优于饱和氯化钠水溶液检测结果，P值分别为0.004，0.002。饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液检测结果之间并无显著差异，饱和硝酸钠的水溶液检测结果略优。
二、线虫漂浮法检测的最优溶剂选择
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.溶剂配制：本发明选择的三种虫卵漂浮法溶剂为饱和氯化钠水溶液、饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液。
4.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
5.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml饱和氯化钠水溶液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
6.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
7.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
8.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有虫卵计数。
9.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
10.重复：分别将溶剂换成饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，重复上述1-9步骤，得出不同溶剂检测到虫卵的EPG（eggs per gram）。
11.数据分析：实验取得的数据通过Excel2010进行数据分析，使用Excel2010数据绘图。数据结果以"Mean士1.5SD"的形式表示（见表1）。组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），显著水平设置α=0.05。
12.结果：得到结果如图6所示，三种溶剂检测线虫，饱和氯化钠水溶液检测结果显著的优于饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，P值分别为0.05，0.045。
三、蛔虫漂浮法检测的最优溶剂选择
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.溶剂配制：本发明选择的三种虫卵漂浮法溶剂为饱和氯化钠水溶液、饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液。
4.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
5.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml饱和氯化钠水溶液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
6.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
7.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
8.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有虫卵计数。
9.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
10.重复：分别将溶剂换成饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，重复上述1-9步骤，得出不同溶剂检测到虫卵的EPG（eggs per gram）。
11.数据分析：实验取得的数据通过Excel2010进行数据分析，使用Excel2010数据绘图。数据结果以"Mean士1.5SD"的形式表示（见表1）。组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），显著水平设置α=0.05。
12.结果：得到结果如图6所示，三种溶剂检测蛔虫，饱和氯化钠的水溶液检测结果极显著（P=0.008）的优于饱和蔗糖食盐水溶液，饱和硝酸钠水溶液检测结果显著（P=0.05）优于饱和蔗糖食盐水溶液，饱和氯化钠水溶液与饱和硝酸钠水溶液检测结果无显著差异，饱和氯化钠水溶液略优于饱和硝酸钠水溶液。
四、球虫漂浮法检测的最优溶剂选择
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.溶剂配制：本发明选择的三种虫卵漂浮法溶剂为饱和氯化钠水溶液、饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液。
4.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
5.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml饱和氯化钠水溶液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
6.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
7.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
8.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有虫卵计数。
9.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
10.重复：分别将溶剂换成饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，重复上述1-9步骤，得出不同溶剂检测到虫卵的EPG（eggs per gram）。
11.数据分析：实验取得的数据通过Excel2010进行数据分析，使用Excel2010数据绘图。数据结果以"Mean士1.5SD"的形式表示（见表1）。组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），显著水平设置α=0.05。
12.结果：得到结果如图6所示，三种溶剂检测球虫，饱和氯化钠水溶液检测结果显著（P=0.05）优于饱和硝酸钠水溶液，饱和氯化钠水溶液与饱和蔗糖食盐水溶液检测结果无显著差异，饱和氯化钠水溶液略优于饱和蔗糖食盐水溶液。
五、吸虫漂浮法检测的最优溶剂选择
1.粪样采集：用一次性手套、镊子采集有耳标的林麝新鲜粪便，粪便采集重量不少于10g。由于林麝多在夜间活动和排便，为保证采集到新鲜粪便，所以采样时间定在早上7点至9点。且采样的前一天下午需要打扫圈舍，防止采样时采集到超过24小时的陈旧粪样。
2.粪样保存：称取采集的林麝新鲜粪便6g，保存于福尔马林溶液中，粪液比为1g：4ml最佳。称取的粪便保存于福尔马林溶液前，应先轻轻将粪球捏破，以便于溶液进入粪球，起到较好的保存效果，但也不可将粪球捏碎，以免寄生虫卵沉淀。
3.溶剂配制：本发明选择的三种虫卵漂浮法溶剂为饱和氯化钠水溶液、饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液。
4.研磨：称取福尔马林溶液保存的林麝粪样2g置于研钵中，研磨粪便至看不到较大颗粒为止。
5.漂浮：将研碎的粪便转移至烧杯中，用量筒量取58ml饱和氯化钠水溶液加入上述烧杯中。用玻璃棒快速搅拌上述溶液20min，至溶液被充分搅拌均匀。
6.过滤：将搅拌均匀的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤入新的烧杯中。
7.转移：过滤完后，迅速用1000ml移液器吸取溶液注入麦克马斯特计数板的两个计数室内，将注满溶液的计数板静置5min。
8.镜检：在显微镜下观察，并对计数板两计数室方格内的所有虫卵计数。
9.计数：按照以下公式计算EPG（eggs per gram）值（每克粪便中虫卵的数量）。
EPG=[n÷(2×0.15)]×V÷m
其中，n为两个计数室内所有的虫卵数，2为计数室的个数，0.15为每个计数室的有效体积为0.15ml，V为粪液的总体积，此处为60ml，m为所用粪便的质量，此处为2g。
10.重复：分别将溶剂换成饱和蔗糖食盐水溶液和饱和硝酸钠水溶液，重复上述1-9步骤，得出不同溶剂检测到虫卵的EPG（eggs per gram）。
11.数据分析：实验取得的数据通过Excel2010进行数据分析，使用Excel2010数据绘图。数据结果以"Mean士1.5SD"的形式表示（见表1）。组间比较采用独立样本T检验（Independent-samples T test），显著水平设置α=0.05。
12.结果：得到结果如图6所示，三种溶剂检测吸虫，均无显著性差异。
Claims (8)
1.一种检测林麝粪便中寄生虫虫卵的方法，包括如下步骤：
（1）采集排出体外时间小于24小时的林麝粪球；
（2）将粪球研磨，得到研碎的粪便；
（3）将研碎的粪便与漂浮液混匀，得到混匀的溶液；
（4）将步骤（3）得到的溶液先后经过15目和60目的标准筛过滤，得到滤液；
（5）对滤液中的寄生虫虫卵进行计数，得到单位体积滤液中寄生虫虫卵的含量N；
（6）按照如下公式计算单位质量的粪便中寄生虫虫卵的数量EPG：
EPG=N×V÷m
V为步骤（4）得到的滤液的总体积，m为步骤（3）所用粪便的质量；
所述漂浮液为比重大于所述寄生虫虫卵并不破坏寄生虫虫卵完整性的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中粪球质量不少于10g；
所述步骤（1）还包括将所述粪球保存于福尔马林溶液中的步骤；
所述粪球与所述福尔马林溶液的比例具体为1g：4ml；
所述保存的方法为将所述粪球捏破并保证粪球完整再将其保存于福尔马林溶液中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中所述研碎的粪便的质量为2g；
所述漂浮液的体积为58ml，所述公式中V为60ml，m为2g。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵、线虫虫卵、蛔虫虫卵、球虫虫卵或吸虫虫卵。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述漂浮液为饱和硝酸钠水溶液、饱和氯化钠水溶液或饱和蔗糖食盐水溶液。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵时，所述漂浮液为饱和硝酸钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为线虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为蛔虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液；
所述寄生虫虫卵为球虫虫卵时，所述漂浮液为饱和氯化钠水溶液。
7.权利要求1-6任一所述的方法在检测林麝粪便中寄生虫虫卵中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述寄生虫虫卵为鞭虫虫卵、线虫虫卵、蛔虫虫卵、球虫虫卵或吸虫虫卵。
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