CN103884707B - 一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法,以鲁米诺和联吡啶钌为发光探针,在检测时,以ITO电极作为发光检测的工作电极、银-氯化银电极作为参比电极以及铂电极作为对电极,由0.6V扫描至0.0V,检测来自鲁米诺的发光信号;向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺,由0.0V扫描至-1.0V,检测来自联吡啶钌的发光信号。本发明还提出一种简单、有效、可同时检测两种细胞表面癌症标志物的检测方法。通过双标记和电位分辨的方法可以实现对细胞表面两种抗原的一步分析检测,且排除了不同电位下信号的相互干扰,成功实现了细胞表面癌胚抗原和甲胎蛋白抗原的同时检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体地说涉及一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用。
背景技术
电致化学发光(ECL)是另外一种应用于免疫分析的方法,其利用电致化学发光探针代替荧光团。电致化学发光方法不需要光源的激发,因此具有背景低和设备简单的优点。最常用的电致化学发光探针为鲁米诺和联吡啶钌。一般情况下,在施加正电位时,鲁米诺阴离子会经历单电子氧化过程,变为二氮杂醌,进一步被氧化为激发态的3-氨基邻苯二甲酸,从而回到基态发光。对于联吡啶钌探针来说,S2O8 2-离子作为共反应剂,首先会在负电位下被还原成为SO4·-,该物质可与联吡啶钌反应从而发光。虽然联吡啶钌/过硫酸根离子体系和鲁米诺/双氧水体系会在不同的电压范围下发光,两种电致化学发光物质和其相应的共反应剂同时存在于一个体系当中造成了复杂的电化学发光现象,进而分辨来自鲁米诺和联吡啶钌复合物的发光变得十分困难。
癌症的早期诊断对其最终的控制和预防有着至关重要的作用。在癌症发展的过程中,一种有效的早期癌症诊断手段是对癌症标志物的检测。由于已知的癌症标志物的特异性较低,因此对多标志物的同时检测可以大大提高癌症检测的准确性。过去的几年中研究者致力于发展基于荧光免疫方法对多个癌症标志物的同时检测。经典的做法是在细胞表面标记上具有不同激发光/发射光性质的荧光团。在激光的照射下,不同荧光团的发射光被分光镜和滤光片区分开来,之后由光电倍增管(PMT)或者电荷耦合装置(CCD)检测出来。虽然荧光免疫分析法因荧光团覆盖光谱的广泛性,荧光标记的简便性和实时监测性而具有一定的优越性,但是激光器的部件、滤光片或者光学分束器的引入会使得实验设备复杂,提高了检测成本。将电致化学发光反应应用于细胞免疫分析当中时,抗体修饰的联吡啶钌和鲁米诺可以识别细胞表面的抗原。由于不同的电致化学发光探针可在不同的电位下发光,因此发展电位分辨的电致化学发光免疫试剂盒进行细胞表面抗原的同时分析是可行的。电压扫描过程中,不同电致化学发光探针会在不同时间点发光,因此不需要光学分束器或滤光片进行信号的分辨。由于不需要光源、光学分束器和滤光片的引入就很大程度上简化了光学设置并且降低了实验成本。
发明内容
发明目的:为解决现有技术中存在的技术问题,本发明提出一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法及其应用,以解决两种电致化学发光物质同时存在于一个体系中时分辨两者的发光出现困难的问题,同时将该方法应用于同时检测细胞表面两种抗原。
技术内容:为实现上述技术目的,本发明提出一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法,以鲁米诺和联吡啶钌为发光探针,在检测时包括如下步骤:
(1)电极准备:在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极;
(2)正电位下检测鲁米诺的发光信号:以-0.01~-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V,检测来自鲁米诺的发光信号,优选的扫速为-0.2V/s;
(3)负电位下检测联吡啶钌的发光信号:向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺,以-0.01~-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V,检测来自联吡啶钌的发光信号,选的扫速为-0.2V/s;
其中,所述鲁米诺的检测范围为20μM~200μM,所述联吡啶钌的检测范围为20μM~200μM;加入的过硫酸根与联吡啶钌的摩尔比为20:1~30:1,加入的过量的鲁米诺的量为15~20mM。
本发明还提出了上述方法在同时检测细胞表面两种抗原上的应用。
具体地,所述应用包括如下步骤:
(1)电极准备:在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极;
(2)将细胞表面待测的抗原A和抗原B分别用联吡啶钌和鲁米诺标记;
(3)对细胞表面的联吡啶钌和鲁米诺进行检测,其中,以-0.01~-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V,检测来自鲁米诺的发光信号,优选的扫速为-0.2V/s;向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺溶液,以-0.01~-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V,检测来自联吡啶钌的发光信号,优选的扫速为-0.2V/s。
其中,在上述步骤(1)中,标记联吡啶钌和鲁米诺的步骤如下:
(a)细胞培养:将细胞在步骤(1)所述的ITO电极的表面培养,并用2.5wt%的戊二醛进行固定;
(b)制备链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物:将链霉亲和素与联吡啶钌在3~5℃下反应2~3小时得到结合产物SA-Ru(链霉亲和素-联吡啶钌),结合产物用超滤管进行超滤纯化处理,然后在4℃下于pH7.4的PBS缓冲液中保存;
(c)制备抗体B修饰的鲁米诺复合物:将3-巯基丙酸加入到金纳米颗粒溶液中在35~38℃下反应10~12小时,在转速为14000rpm条件下离心25~40分钟收集金纳米粒子轭合物,向金纳米粒子轭合物中加入EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合溶液,在36~38℃下反应0.8~1.5小时,得到活化的金纳米粒子溶液;将活化的金纳米粒子溶液与抗体B溶液混合,在36~38℃下反应11~13小时得到金纳米粒子-抗体B复合物;将N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺加入到金纳米粒子-抗体B复合物中,在黑暗条件下反应11~13小时得到抗体B修饰的鲁米诺复合物;
(d)标记链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物:将固定有细胞的ITO电极与生物素化的抗体A溶液于37℃条件下反应25~40分钟,用pH7.4的PBS缓冲液清洗,加入步骤(b)中得到的SA-Ru溶液反应2~4分钟从而在抗原A上标记上链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物;
(e)标记抗体B修饰的鲁米诺复合物:将经过(d)步骤处理的ITO电极的O型圈表面加入0.02%(w/v)的吐温20溶液,然后与步骤(c)制备的抗体B修饰的鲁米诺复合物在37℃下反应2小时,从而在抗原B上标记上抗体B修饰的鲁米诺复合物。
优选地,上述ITO电极所粘贴的O型圈的直径为2cm。
其中,所述的细胞为MCF-7细胞,所述的抗原A为癌胚抗原,抗原B为甲胎蛋白。
所述的PBS缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液。
优选地,所述的金纳米颗粒的粒径为11~13nm。
有益效果:与现有技术相比,本发明提出了一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法,基于该方法,提出了一种简单、有效、可同时检测两种细胞表面癌症标志物的检测方法。通过双标记和电位分辨的方法可以实现对细胞表面两种抗原的一步分析检测,且排除了不同电位下信号的相互干扰,成功实现了细胞表面癌胚抗原和甲胎蛋白抗原的同时检测。进一步地,改变与鲁米诺或联吡啶钌复合物相连的抗体可以实现其他不同种类需检测抗原的分析。
附图说明
图1为负电位下联吡啶钌、鲁米诺以及两者的混合物的发光曲线;
图2为负电位下高浓度鲁米诺的发光自猝灭现象;
图3为正电位下联吡啶钌和鲁米诺的化学发光;
图4为双氧水对过硫酸根体系下的联吡啶钌和鲁米诺的化学发光的影响;
图5为抗体修饰的鲁米诺和抗体修饰的联吡啶钌与粒子的结合;
图6为负电位下鲁米诺复合物修饰的粒子对联吡啶钌复合物修饰的粒子的化学发光信号的影响;
图7为正电位下联吡啶钌复合物修饰的粒子和鲁米诺复合物修饰的粒子的化学发光;
图8为正电位下联吡啶钌复合物修饰粒子对鲁米诺复合物修饰的粒子的化学放光信号的影响;
图9为抗原与发光探针的发光强度的线性关系示意图;
图10为抗体修饰的鲁米诺和联吡啶钌与细胞表面抗原连接的示意图;
图11为MCF7细胞在电位由0.6V扫描至-1.0V的发光信号-电位图;
图12为MCF7细胞表面标记电致化学发光信号分子之前和之后的发光信号;
图13为PC3细胞表面标记鲁米诺复合物和联吡啶钌复合物后的发光信号。
具体实施例
试剂及来源:金纳米粒子(平均直径13纳米)从北京德科岛金科技有限公司购得;癌胚抗原抗体和癌胚抗原分别来自郑州博赛生物科技有限公司和北京博奥森生物科技有限公司;甲胎蛋白(AFP)抗原抗体购自成都双流正龙生化实验室;生物素化的癌胚抗原(CEA)抗体自北京科跃中楷生物科技有限公司;MCF-7细胞和PC-3细胞来自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所;外表包裹羧基的二氧化硅粒子(平均直径20微米)来自德国Micromod颗粒技术有限公司;其他试剂除特殊指明外均来自Sigma-Aldrich公司。实验过程使用电阻率为18.2MΩ/cm的超纯水。缓冲溶液经过灭菌处理。
实施例1溶液中鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光。
(1)负电位下溶液中联吡啶钌和鲁米诺的交叉反应。
检测条件:在体系中存在3mM过硫酸根粒子时,在负电位的条件下,分别检测100μM联吡啶钌、100μM联吡啶钌粒子和100μM鲁米诺的混合溶液以及100μM鲁米诺的发光曲线。其中,整个检测体系在pH7.4的PBS缓冲液中,在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极,电压扫速为-0.2V/s(以下各实施例中的电压扫速均采用-0.2V/s)。
结果如图1所示,其中a为单独检测联吡啶钌溶液的发光曲线,b为联吡啶钌和鲁米诺共存时的发光曲线,c为单独的鲁米诺的发光曲线,可以看到在负电位下,当鲁米诺和联吡啶钌同时存在时,体系中引入过硫酸根离子得到的发光信号比单一联吡啶钌与过硫酸根粒子共存是的发光信号大。这种增加的发光信号是由于鲁米诺和过硫酸根粒子两者在负电位下的交叉反应产生的。将工作电极材料置换为金电极并没有改变这个现象,因此表明这种鲁米诺和过硫酸根离子的反应与电极材料无关。在负电位下,鲁米诺和联吡啶钌均会在过硫酸根离子存在的情况下发光的现象使得区分出负电位下来自联吡啶钌的发光信号变的困难。
(2)负电位下高浓度鲁米诺的发光自猝灭现象。
检测条件:在pH7.4PBS缓冲液中,在体系中有100μM联吡啶钌和3mM过硫酸根离子时,随着鲁米诺浓度变化为0.1mM、1mM、5mM、10mM、15mM、20mM时,在-1.0V的电位下检测发光信号,在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极进行检测。
结果如图2所示。从图2中可以看出,在负电位下过硫酸根离子存在时,不断增加鲁米诺溶液的浓度可以看到发光信号不断减弱。当鲁米诺浓度高于15mM时,来自鲁米诺的发光变成一个较小且稳定的常数,并不再受鲁米诺量增加的影响。当鲁米诺增加至20mM时,此时再引入联吡啶钌,会发现发光信号开始增加,证明了这种高浓度鲁米诺存在的条件下,来自联吡啶钌的发光是可以被从总的发光信号中分离出来的。这种分离出来的光信号即为在负电位下来自联吡啶钌的发光信号。
(3)正电位下联吡啶钌和鲁米诺的化学发光。
检测条件:在pH7.4PBS缓冲液中,分别检测200μM鲁米诺和200μM联吡啶钌在正电位下的发光。在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极,扫速为-0.2V/s进行检测。结果如图3所示,从图中可以看出,鲁米诺和联吡啶钌发光的起始电压分别为0.4V和0.6V,即在0~0.6V的电压范围内联吡啶钌没有化学发光。
(4)双氧水对过硫酸根体系下的联吡啶钌和鲁米诺的化学发光的影响。
检测条件:在pH7.4PBS缓冲液中,在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极进行检测,分别检测下述情况下的化学发光:
(a):100μM鲁米诺,100μM联吡啶钌,3mM过硫酸根离子和1mM双氧水;
(b):100μM鲁米诺,3mM过硫酸根离子和1mM双氧水;
(c):100μM鲁米诺,3mM过硫酸根离子。
电压扫描范围为0~(-1.0)V,扫速为-0.2V/s。结果如图4所示。双氧水是一种常用的增强鲁米诺电致化学发光的共反应剂。图4显示出在鲁米诺、联吡啶钌、双氧水和过硫酸根离子同时存在时会产生化学放光,这种化学发光现象与电位无关,且会使得联吡啶钌和过硫酸根离子在负电位下的发光信号猝灭。推测最可能的反应机理为过硫酸根是一个很强的氧化剂,会使得双氧水产生氧自由基,使得鲁米诺发生化学发光。这种化学发光现象消耗了过硫酸根离子,从而抑制了负电位下过硫酸根向硫酸根自由基转换的过程,进一步阻碍了对联吡啶钌基团的电致化学发光现象。由于鲁米诺自身也存在电致化学发光现象,因此双氧水从体系中排除,从而保证联吡啶钌/过硫酸根离子体系的电化学发光体系正常进行。当正电位由0.6V扫描至0V,在该电位范围内的发光就仅仅来自鲁米诺,而与联吡啶钌无关。
因此,在鲁米诺-联吡啶钌-过硫酸根离子体系中,在正电位信号检测结束后,可以通过向体系中引入高浓度的鲁米诺和过硫酸钾使得负电位下的鲁米诺的发光信号成为一个常数且与鲁米诺的含量无关,从而使得在正电位和负电位下的发光分别为鲁米诺和联吡啶钌,且没有相互干扰。因此,通过电压扫描,实现两种抗原分析的电位分辨的电致化学发光分析是可行的。
实施例2粒子表面鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光。
为了模拟用鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光来同时检测细胞表面两种抗原,我们在直径为20微米左右的二氧化硅表面修饰了抗原,该尺寸和细胞尺寸相似。在分析实验中,粒子沉降在电极表面,模拟了细胞的粘附行为。具体地,包括如下步骤:
(1)抗体修饰的鲁米诺复合物的制备:制备过程如图5(1)所示。将浓度为10-3M的3-巯基丙酸(3-MPA)首先加入到平均直径为13纳米的金纳米颗粒(AuNPs)溶液中。混合溶液于37℃条件下反应12小时,之后于转速为14000rpm条件下离心30分钟收集金纳米粒子轭合物(AuNPs-MPA)。为了活化金纳米粒子轭合物表面的羧酸基团,于金纳米粒子轭合物中加入浓度为1mM的EDC和NHS混合溶液,并在37℃条件下反应1小时。此后,将12.88μg/mL的甲胎蛋白(AFP)抗原抗体溶液与活化的金纳米粒子溶液混合,于37℃条件下反应12小时。最后将0.25mM的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(异鲁米诺)加入溶液中,在黑暗条件下继续反应12小时使得鲁米诺被连接到金纳米粒子上。最终的表面连接了AFP抗原抗体和鲁米诺的金纳米粒子产物悬浮于pH为7.4,浓度为10mM磷酸盐缓冲溶液(PBS)中,4℃下保存。
(2)链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物的制备:将0.1mg浓度为1mg/mL的链霉亲和素(SA)溶液与1mg联吡啶钌复合物(Ru)于4℃下反应2小时。两者的结合产物SA-Ru由截留分子量为10K的超滤管(Millipore,USA)进行超滤纯化处理。SA-Ru由pH为7.4的PBS溶液稀释至20μg/mL,4℃下保存。
(3)抗原修饰的二氧化硅粒子的制备:如图5(2)所示,二氧化硅粒子(SPs)与0.2M的NHS和0.8M的EDC混合溶液于37℃条件下反应1小时来活化二氧化硅粒子表面的羧酸基团。此后粒子与12.88μg/mL的抗体溶液于37℃条件下反应24小时使得抗体与粒子表面相连。余下的活化羧酸基团由与PBS溶液质量体积比为0.1%的牛血清蛋白溶液在37℃条件下反应1小时进行封闭。离心清洗过后,粒子中加入2μg/mL的抗原溶液,两者在37℃条件下反应2小时,最终得到抗原修饰的二氧化硅粒子。
(4)鲁米诺、联吡啶钌复合物与抗原修饰的粒子的连接:表面修饰了AFP抗原抗体和鲁米诺的金纳米粒子与表面修饰抗原的二氧化硅粒子的连接按如下步骤进行:二氧化硅粒子首先悬浮于与PBS溶液质量体积比为0.02%的吐温20溶液中,之后与修饰了AFP抗原抗体和鲁米诺的金纳米粒子在37℃条件下反应2小时。SA-Ru复合物与抗原修饰的二氧化硅粒子的连接按如下步骤进行:二氧化硅粒子先与3μg/mL的生物素化的抗体溶液于37℃条件下反应30分钟。离心清洗三遍之后,产物与20μg/mL的SA-Ru溶液反应2分钟从而得到联吡啶钌修饰的二氧化硅粒子。
(5)发光检测:在ITO电极表面粘上直径为2cm的O型圈作为溶液室作为发光检测的工作电极,银-氯化银和铂电极被分别用作参比电极和对电极。第一步,由0.6V变化至0.0V的正电位以-0.2V/s的扫速(以下各个实施例中的电极条件和扫速均相同)加载在ITO电极上,检测来自鲁米诺复合物的发光信号。第二步,3mM的过硫酸钾和15mM的鲁米诺溶液引入到体系中,电压持续以相同的扫速由0.0V扫描至-1.0V,从而检测来自联吡啶钌的发光信号。在同样的电压范围内,粒子或者细胞表面在连接了鲁米诺和联吡啶钌之前测定了体系的背景信号。为了避免由于不同ITO试验带来的测量误差,对于鲁米诺发光的分析,在0.6V条件下得到的来自鲁米诺基团的信号被其在0V时得到的背景信号归一化,同样的对于联吡啶钌的发光分析,在-1.0V时得到的来自联吡啶钌的信号也被其在0V下的背景信号归一化。
在负电位的条件下,当扫描电压由0.0V变化至-1.0V时,连接了联吡啶钌复合物的二氧化硅粒子会在过硫酸根离子存在的条件下发光。在溶液实验中已证明鲁米诺会在过硫酸根存在时负电位下给出发光信号。鲁米诺和联吡啶钌复合物均会在负电位下发光,因此就使得在0.0至-1.0这个电压范围内得到与联吡啶钌相连的抗原的信息变得不可行。加入溶剂1(主体成分为15mM鲁米诺和3mMK2S2O8)后,来自鲁米诺复合物光信号会变成一个常量。此时来自鲁米诺为常量的发光强度不再与修饰了鲁米诺复合物的粒子有关。
图6显示了联吡啶钌复合物修饰的粒子在体系存在溶剂1的条件下,负电位扫描时体系含有和不含有鲁米诺复合物修饰的粒子时候的发光情况。曲线a表明了在同样的溶液中含有未修饰的二氧化硅粒子时测得的背景信号。曲线b表明在体系中引入联吡啶钌复合物修饰的粒子后发光信号增加,继续加入鲁米诺复合物修饰的粒子,发光信号没有显示出增加的效果,证明在这种条件下测试来自联吡啶钌复合物的信号的可行的。曲线c和曲线d的差值表现出加入联吡啶钌修饰粒子的发光信号。继续加入更多的的联吡啶钌修饰的粒子可以观察到信号的持续上升,显示出在我们体系中负电位下测得的发光信号的强度与二氧化硅粒子表面的抗原数量有相关性。
在正电位的条件下,联吡啶钌复合物修饰的粒子在电压为0到0.6V的范围内不会发光,如图7所示。由于来自鲁米诺复合物修饰的粒子的发光可以在电压高于0.45V时即可观察到,因此低于0.6V的电位可仅仅激发来自鲁米诺复合物的发光。即电压扫描范围为0到0.6V时得到的发光信号提供了与鲁米诺相连的抗原的相关信息。
图8中的曲线b和c分别代表鲁米诺复合物修饰的粒子在联吡啶钌复合物修饰粒子不存在和存在的条件下得到的发光信号。曲线a代表没有鲁米诺复合物修饰的粒子的发光信号。在联吡啶钌复合物修饰的粒子引入到体系中时,没有观察到发光信号的增加,这个结果表明在正电位下测得的信号是准确的,是仅仅来自鲁米诺复合物修饰粒子的。持续的加入鲁米诺复合物修饰的离子会观察到发光信号的增强,如图8中曲线d和e所示,这个结果表明我们的实验体系中正电位下测得的发光信号强度与二氧化硅离子表面的抗原数量有相关性。
总的来说,来自鲁米诺和联吡啶钌复合物的发光可以在电压扫描范围为0.6到-1.0V的范围内进行检测。仅仅使用一个光电倍增管,这种由电位控制的电致化学发光信号的检测可以实现两种抗原的联合检测。
进一步的,我们使用这种方法对两种抗原进行定量的检测。连接了AFP抗体(抗体A)的鲁米诺和连接了CEA抗体(抗体B)的联吡啶钌分别识别粒子表面的AFP(抗原A)和CEA抗原(抗原B),调节粒子数目即可通过检测发光强度可对粒子数目(即相应抗原)进行定量。
因此需要估算每个二氧化硅粒子表面的抗原数量,设计实验如下:抗原A和抗原B修饰的二氧化硅粒子分别与相应的抗体修饰的金纳米粒子反应。由于每个金纳米粒子上修饰了一个相应的抗体,那么通过测定反应前和反应后金纳米粒子溶液的荧光即可以得到与二氧化硅粒子表面抗原结合的抗体数,进而可以估算参加反应的二氧化硅粒子表面的抗原A或抗原B的个数。由于实验中二氧化硅粒子的数目是可以控制的,最终计算出每个粒子表面的抗原A和抗原B的数目为1.60×10-19摩尔和0.30×10-19摩尔。
定量检测中,通过控制氧化铟锡电极表面的二氧化硅粒子个数,按照如前文方法进行检测,得到了与其数目成线性关系的发光信号。由于其表面的抗原数目已经确定,进而就得到了抗原A或B与鲁米诺或联吡啶钌发光强度的线性关系。如图9所示。图9A中为抗原A与鲁米诺发光信号的线性关系。图9B中为抗原B与联吡啶钌发光信号的线性关系。对于抗原A,检测的范围为0.2~1.0ng。对于抗原B,检测的范围为3.4~16.7ng。
实施例3细胞表面两种抗原的联合检测。
细胞培养MCF-7细胞和PC-3细胞分别在加了10%(v/v)胎牛血清和1%(v/v)抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM高糖培养基和F-12K培养基中培养。细胞培养于含有5%(v/v)的CO2,温度为37℃且气氛湿润的细胞培养箱中。其中,抗生素为青霉素和链霉素的混合物,其中青霉素浓度为100U/ml,链霉素浓度为100μg/ml。即培养基总体积是500ml,其中胎牛血清为50ml,青霉素和链霉素购入的为10000U/ml和10000μg/ml的混合溶液(购买自ThermoScientific的青霉素-链霉素100X溶液(HyCloneTMPenicillin-Streptomycin100XSolution),加5ml入500ml中,相当于稀释100倍从而达到青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml的浓度。
如图10所示,在细胞表面连接鲁米诺和联吡啶钌时同如上过程。在连接之前,细胞用2.5%的戊二醛固定在我们的实验中,大约180,000个MCF7细胞被培养在氧化铟锡电极的表面。细胞首先由2.5%的戊二醛进行固定,从而保证细胞表面抗原抗体的免疫反应,并且使得高浓度溶液鲁米诺引入对细胞活动产生的影响最小化。其中,MCF7细胞表面具有高表达的CEA和AFP抗原,先通过免疫反应将抗体修饰的鲁米诺和联吡啶钌复合物均连接在细胞表面。在细胞表面连接鲁米诺和联吡啶钌时同如实施例2。在连接之前,细胞用2.5%的戊二醛固定。图11是电位由0.6V扫描至-1.0V的发光信号-电位图。在电位扫描至0V时向体系中引入3mM的过硫酸根离子和15mM的鲁米诺溶液。对比背景发光信号的曲线,可在正电位和负电位下均观察到发光信号的上升,该现象说明使用我们的实验体系可完成细胞表面的两种抗原的联合检测。如图12阴影柱状图所示,细胞表面标记电致化学发光信号分子之前和之后的发光信号的比值求得平均值分别为2.59和0.92,对应地反映出CEA和AFP抗原数量的相关信息。进行了三组平行的细胞实验,求得来自鲁米诺和联吡啶钌复合物的信号与背景比值的标准差分别为3.5%和14.1%。
为了证明在细胞实验中来自正电位和负电位催下的发光信号不会有相互干扰,在MCF7细胞表面分别进行了鲁米诺和联吡啶钌复合物的单独标记。相应的,发光信号分别仅仅在正电位和负电位下检测。如图12白色柱状图所示,标记之后和之前的发光信号的比值分别为2.68和1.05。与鲁米诺和联吡啶钌复合物双标记时测得的信号比值相近,证明我们的体系对双抗原的同时检测是准确可行的。PC3细胞表面没有CEA和AFP抗原的表达,在实验中被用作空白对照。如图13所示,在扫描电压为0.6到-1.0V的条件下,标记前后没有观察到电致化学发光信号的变化。该结果证实了我们实验体系的可行性。
综上所述,本发明提出一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法,利用该检测方法,可以发展一种基于电致发光的细胞表面双标志物同时检测的试剂盒,从而实现了对细胞表面两种抗原的同时分析。当抗体修饰的鲁米诺和联吡啶钌与细胞表面相应抗原相连后,过硫酸根离子需在引入体系中来激发负电位下联吡啶钌的发光;正电位下仅仅由鲁米诺复合物发光从而提供与鲁米诺相连的抗原的信息。负电位下,由于鲁米诺复合物在过硫酸根离子存在时同样会发光,干扰联吡啶钌发光的检测,因此在正电位信号检测结束后,将15mM鲁米诺和3mMK2S2O8引入体系当中使得鲁米诺的发光产生自淬灭现象。此时负电位下来自鲁米诺的发光成为一个常数且与鲁米诺复合物的含量无关。此时联吡啶钌复合物的发光信号可由从负电位下总的发光信号中除去来自高浓度鲁米诺的常数部分而得到。从而可以制备实现对两种细胞表面癌症标志物快速、灵敏的检测的试剂盒,同时具有操作简便,设备简单,成本低廉等优点。
Claims (6)
1.一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法,其特征在于,以鲁米诺和联吡啶钌为发光探针,在检测时包括如下步骤:
(1)电极准备:在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极;
(2)正电位下检测鲁米诺的发光信号:以-0.01~-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V,检测来自鲁米诺的发光信号;
(3)负电位下检测联吡啶钌的发光信号:向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺,以-0.01~-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V,检测来自联吡啶钌的发光信号;
其中,所述鲁米诺的检测范围为20μM~200μM,所述联吡啶钌的检测范围为20μM~200μM;加入的过硫酸根与联吡啶钌的摩尔比为20∶1~30∶1,加入的过量的鲁米诺的量为15~20mM。
2.权利要求1所述的方法在同时检测细胞表面两种抗原上的应用,其中,所述的细胞为MCF-7细胞,所述的两种抗原为抗原A和抗原B,所述的抗原A为癌胚抗原,抗原B为甲胎蛋白。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,包括如下步骤:
(1)电极准备:在ITO电极表面粘上O型圈作为溶液室,以ITO电极作为发光检测的工作电极,以银-氯化银电极作为参比电极,以铂电极作为对电极;
(2)将细胞表面待测的抗原A和抗原B分别用联吡啶钌和鲁米诺标记;
(3)对细胞表面的联吡啶钌和鲁米诺进行检测,其中,以-0.01~-1V/s的扫速由0.6V扫描至0.0V,检测来自鲁米诺的发光信号;向检测体系中加入过硫酸根和过量的鲁米诺溶液,以-0.01~-1V/s的扫速由0.0V扫描至-1.0V,检测来自联吡啶钌的发光信号。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(2)中,标记联吡啶钌和鲁米诺的步骤如下:
(a)细胞培养:将细胞在步骤(1)所述的ITO电极的表面培养,并用2.5wt%的戊二醛进行固定;
(b)制备链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物:将链霉亲和素与联吡啶钌在3~5℃下反应2~3小时得到结合产物SA-Ru,结合产物用超滤管进行超滤纯化处理,然后在4℃下于pH7.4的PBS缓冲液中保存;
(c)制备抗体B修饰的鲁米诺复合物:将3-巯基丙酸加入到金纳米颗粒溶液中在35~38℃下反应10~12小时,在转速为14000rpm条件下离心25~40分钟收集金纳米粒子轭合物,向金纳米粒子轭合物中加入EDC和NHS的混合溶液,在36~38℃下反应0.8~1.5小时,得到活化的金纳米粒子溶液;将活化的金纳米粒子溶液与抗体B溶液混合,在36~38℃下反应11~13小时得到金纳米粒子-抗体B复合物;将N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺加入到金纳米粒子-抗体B复合物中,在黑暗条件下反应11~13小时得到抗体B修饰的鲁米诺复合物;
(d)标记链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物:将(a)中固定有细胞的ITO电极与生物素化的抗体A溶液于37℃条件下反应25~40分钟,用pH7.4的PBS缓冲液清洗,加入步骤(b)中得到的SA-Ru溶液反应2~4分钟从而在抗原A上标记上链霉亲和素修饰的联吡啶钌复合物;
(e)标记抗体B修饰的鲁米诺复合物:将经过(d)步骤处理的ITO电极的O型圈表面加入0.02%(w/v)的吐温20溶液,然后与步骤(c)制备的抗体B修饰的鲁米诺复合物在37℃下反应2小时,从而在抗原B上标记上抗体B修饰的鲁米诺复合物。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述O型圈的直径为2cm。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的金纳米颗粒的粒径为11~13nm。
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