CN103875718A - 一种枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配的土壤处理剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复配土壤处理剂及其应用，尤其是一种枯草芽胞杆菌与恶霉灵的复配杀菌剂，其有效成分由枯草芽胞杆菌R31和恶霉灵组成，有效成分占产品的重量百分比为5-90％，其中恶霉灵原药与枯草芽胞杆菌原粉的重量比为1-5∶1-15；其剂型可以为水悬浮剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。该复配制剂不但可以同时杀灭土壤中的各种真菌及细菌性病原菌，有效防治土传病害；而且对土壤益生菌(细菌、放线菌等)没有不利影响，无污染；还能够在枯草芽胞杆菌大量繁殖后实现土壤微生物群落合理分布，最终实现土壤中生态结构的合理化。长期使用，可以达到根治土传病害、改善土壤微生物环境、提高土壤肥力、促进作物生长、增强作物抗病能力、提高作物产量和品质的效果。

Description

一种枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配的土壤处理剂

技术领域

本发明涉及一种复配土壤处理剂及其应用，尤其是一种枯草芽胞杆菌与恶霉灵的复配杀菌剂，其不但可以有效防治土传病害、同时杀灭土壤中的各种真菌及细菌性病原菌；而且对土壤中的病菌以外的细菌、放线菌等有益菌影响很小，可以改善土壤的生态结构；还能促进作物生长，提高作物的抗病能力。 

技术背景

依靠化学肥料和化学农药，农业在极短的时间里取得了很大的发展，粮食产量大幅提高，解决了人们的吃饭问题。然而，长期和大量的使用化学肥料和化学农药也使我们的土地和环境受到了前所未有的影响和破坏。土壤酸化板结，结构被破坏，肥力下降，重金属含量超标，农药残留和污染严重，土壤微生物群落被破坏，诱发有害微生物突变和快速滋生，引起土传病害暴发流行，极大地制约了农业健康可持续发展，引发农产品安全问题，直接危害人民的身体健康。 

近年来我国土传病害的发生频率和危害程度不断上升，一些病害已呈持续暴发之势，导致损失惨重，成为阻碍农业生产发展的突出问题。目前在我国瓜类作物枯萎病，尤其西瓜、甜瓜和苦瓜枯萎病，常年在全国大部分省市普遍发生与危害，一般减产20％-30％，严重可达50％～80％，甚至绝产。辣椒枯萎病发病率约为15％，常年发生约340万亩；茄子枯萎病发病率在15％，常年发生约45万亩。黄瓜根腐病、茄子黄萎病、番茄疫病等土传病害发病株率一般在15％～30％，重者高达50％。我国各玉米产区主要的土传病害，即茎基腐病、丝黑穗病、纹枯病和全蚀病有逐年加重的趋势，一般发病率大约在10％～30％，严重时可以达到60％以上，产量显著降低。土传病害已成为我国农产品高产，稳产的主要制约因素之一。 

同时土传病害防治难度非常大，已经成为现在作物四大病害之首。这主要是因为传统防治土传病害往往是通过化学农药作用于病原物靶标和使用化肥营养来促进作物生长，但是这种防治仅对少数土传病害有效，对大多数土传病害防效甚微，在防除有害微生物的同时也抑制了大量的有益微生物；而且滥施化学农药易引起有害生物抗药性、再猖撅和残留等问题的出现。长期大量施用化肥破坏了土壤结构，严重破坏了土壤的微生物生态环境和农业生态环境，这样就反而加剧了土传病害的肆虐程度，形成了一种恶性循环。 

因此现在采用生防菌剂防治土传病害成为一个研究热点，其中枯草芽胞杆菌就是目前研究最多的一个方向，它是通过在土壤中引入有益微生物来控制土壤中病原菌的，其机理是： 有益微生物能利用土壤中营养成分进行生长逐渐成为优势菌群，从而在土壤中能有效地抢占病原菌的生存空间和抢夺病原菌所需的营养成分，抑制病原菌生长，从而调节维持土壤生态平衡，控制土传病害。但是采用这种方式往往见效慢，受环境制约严重，例如：在低温下枯草芽胞杆菌的萌发受到影响而不能迅速见效，而在与土壤中病原菌的竞争中也会受到病原菌菌群数量的影响。这些缺点使得其在田间的效果往往很不稳定，甚至有时完全见不到效果，因此严重限制了其在实际生产中的应用。 

而本专利则提供了一种比较好的解决方案，通过将枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配，先通过恶霉灵降低土壤中的病原菌基数，为枯草芽胞杆菌创造出较好的生存竞争环境，有利于枯草芽胞杆菌在土壤中的定植；再通过枯草芽胞杆菌持续优化土壤中的菌群结构，改善土壤的生态结构，从而减少土传病害，提高有益微生物和有机质含量的目的。该组合可以同时杀灭土壤中的各种真菌及细菌性病害，而且对土壤中的病菌以外的细菌、放线菌等有益菌影响很小，表现在施用效果上就是药效稳定，不但能够有效地防治各种土传病害，而且持效期长，能持续优化土壤环境，最终可以显著增强作物健壮度。而该技术方案的形成是基于该枯草芽胞杆菌与恶霉灵的特性的。 

枯草芽胞杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性细菌，可以产生内生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无害，不污染环境。它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖和与繁殖，而且生产枯草芽胞杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方便，存储期长，是一种理想的生防微生物。 

珠海市农科中心自双色石斛兰叶片分离、筛选获得的枯草芽胞杆菌R31菌株(Bacillus subtilis R31)，已于2009年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCC NO：M209261。该菌株为革兰氏阳性菌，菌体杆状，产生芽胞，接触酶、氧化酶试验阳性，具有水解淀粉、酪蛋白、酪氨酸、尿素、吐温80的能力，能够利用柠檬酸盐和丙酸盐，V.P试验呈负反应，具有糖酵解能力、硝酸盐还原能力，具有产吲哚、硫化氢、二羟基丙酮的能力，不产生苯丙氨酸脱氨酶，好氧生长，生长pH范围较广，pH5.0-pH9.0均能生长，偏酸偏碱生长良好，最佳氮源为酵母浸提物，最佳碳源为蔗糖，不能利用苹果酸和甘氨酸，能在50℃生长，55℃不能生长，10℃不能生长，能够在0.001％溶菌酶、3％-7％的NaCl中生长。在NA培养基上，老龄菌落颜色金黄色、表面光滑较粘稠、有时会出现褶皱。该枯草芽胞杆菌对多种植物病原真菌具有较好的平板拮抗活性，尤其对各种尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、交链孢霉等土传维管束病害具有很好的拮抗能力，并在温室和田间表现出良好的防治效果。目前该枯草芽胞杆菌已获得专利授权，专利证书：一株广谱抗真菌植物内生枯草芽胞杆菌及其应用，专利号ZL200910214430.2。同时本公司已经通过专利转让方式获得了该专利的所有权。 

恶霉灵是一种内吸性杀菌剂和植物生长调节剂。高效、低毒，对各种植物真菌病害，如镰刀菌、苗腐菌、腐霉菌、丝核菌、根壳菌、雪微菌等均有显著的防治效果。广泛适用于水 稻、小麦、棉花、甜菜、烟草、蔬菜、苗木、果树、谷类、油科、瓜类、草坪、花卉等作物由上述病原真菌引起的作物病害。恶霉灵作为一种土壤消毒剂，具有独特的作用机理。恶霉灵进入土壤后被土壤吸收并与土壤中的铁、铝等无机金属盐离子结合，有效抑制孢子的萌发和病原真菌菌丝体的正常生长或直接杀灭病菌，药效可达两周。恶霉灵能被植物的根吸收及在根系内移动，在植株内代谢产生两种糖苷，对作物有提高生理活性的效果，从而能促进植株生长，根的分蘖，根毛的增加和根的活性提高，因此可促进秧苗根系发达，植株健壮，增强对低温、霜冻、干旱、涝渍、药害、肥害等多种自然灾害的抗御性能。 

此外恶霉灵与一般的化学农药相比还有三个非常重要的特点，一是其对土壤中病原菌以外的细菌、放线菌的影响很小，所以对土壤中微生物的生态不产生影响；二是其在土壤中能分解成毒性很低的化合物，对环境安全，且安全低毒无残留，是绿色食品的首选农药；三是其在土壤中能提高药效，而大多数化学杀菌剂则容易被土壤吸附，有降低药效的趋势。正是由于这三个特点，使得恶霉灵具备了生物农药的一些特性，也赋予了恶霉灵与生防菌剂枯草芽胞杆菌复配增效的独特优势：其不会破坏土壤的生态结构，不会造成化学污染，还可以明显增效。 

并且根据我们实验证明，恶霉灵对枯草芽胞杆菌R31菌株有很好的兼容性，恶霉灵对枯草芽胞杆菌没有抑制作用，枯草芽胞杆菌也不会造成恶霉灵的不稳定或分解，这就为枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配土壤处理剂提供了坚实的基础。我们对恶霉灵和枯草芽胞杆菌混合药剂的贮藏稳定性试验显示，常温贮存12个月后芽孢的检出量达到了80％，恶霉灵的分解率小于6％。 

目前，将枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配的产品并未见诸报道。 

发明内容

本发明的目的在于：针对目前土传病害肆虐，化学农药效果不佳且造成土壤污染、农药残留超标、土壤生态系统被破坏的情况，提供一种对多种土传病害具有良好的防治效果、且可以持续改善土壤结构、优化土壤菌群结构的土壤调理产品枯草芽胞杆菌与恶霉灵的复配制剂及其应用。枯草芽胞杆菌与恶霉灵复配后，即可以高效、快速防治多种土传病害，又对土壤益生菌(细菌、放线菌等)没有不利影响，无污染，并能够在枯草芽胞杆菌大量繁殖后实现土壤微生物群落合理分布，最终实现土壤中生态结构的合理化，达到持久控制土传病害发生的目的，并有利于作物更健康，提高产品和品质。 

本发明的目的是这样实现的：一种枯草芽胞杆菌与恶霉灵的复配土壤调理剂，其中有效成分由枯草芽胞杆菌R31和恶霉灵组成，有效成分占产品的重量百分比为5-90％，其中恶霉灵原药与枯草芽胞杆菌原粉的重量比为1-5∶1-15。 

本发明中所述的复配土壤调理剂的剂型为水悬浮剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。 

本发明所述的枯草芽胞杆菌与恶霉灵的复配土壤调理剂，其成品药剂中包括了有效成分、分散剂、润湿剂、填料，均可以使用农药中的常规助剂(包括但不限于后面实施例中所使用的助剂)。 

本发明中所述的复配土壤调理剂的使用方法非常方便，既可以稀释后喷雾使用，也可以灌根使用(包括淋施和滴灌)，还可以拌土使用或与其它颗粒产品拌匀后撒施。 

本发明的有益效果是：该复配制剂对于土传病害有特效，且增效显著，枯草芽胞杆菌的施用显著降低了化学药剂的用量，而恶霉灵的施用在不降低生物农药的优势情况下提高了枯草芽胞杆菌的效果，保证了其效果的稳定性。同时该制剂可以长期使用，对调理土壤微生物环境有很好的作用，最终达到根治土传病害、提高土壤肥力的作用。 

附图说明

图：5％恶霉灵·200亿孢子/克枯草芽胞杆菌R31水悬浮剂对黄瓜出苗率试验 

具体实施方式

实施例1：10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂 

取枯草芽胞杆菌原粉(1000亿个孢子/克)50公斤、98％恶霉灵原药10.2公斤、烷基萘磺酸盐缩聚物钠盐3公斤、异丙基萘磺酸钠2公斤、硅酸镁铝5公斤、硅藻土29.8公斤，将所有原材料混合均匀，经粉碎机粉碎并过筛。这样即制成10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂100公斤，该产品为棕褐色粉末。 

恶霉灵含量的检测方法：采用高效液相色谱法。试样用甲醇溶解稀释，甲醇：0.1％醋酸水溶液(80：20)为流动相，使用TC-C18(2)不锈钢柱为填料的不锈钢柱和可变波长紫外检测器，对试样中的恶霉灵进行高效液相色谱分离和测定。具体为：准确称取恶霉灵标样0.05g(精确到0.0001g)于25mL容量瓶中，用甲醇溶解定容；准确吸取1.0mL该溶液置于另一10mL容量瓶中，用流动相溶解定容。准确称取含上述样品0.5克(精确到0.0001g，理论约含恶霉灵0.05克)于25mL容量瓶中，用甲醇溶解定容；准确吸取1.0mL该溶液置于另一10mL容量瓶中，用流动相溶解定容。在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各针相对响应值，待相邻两针响应值变化小于1.2％时，按照标样溶液，试样溶液，试样溶液，标样溶液的顺序进行测定。将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中恶霉灵峰面积分别进行平均，计算恶霉灵的质量分数ω₁(％)。 

${\mathrm{\ω}}_1=\frac{A_2\×m_1\×\mathrm{\ω}}{A_1\×m_2}$    式中： 

A1——标样溶液中恶霉灵峰面积平均值； 

A2——试样溶液中恶霉灵峰面积平均值； 

m1——恶霉灵标样的质量，g； 

m2——试样的质量，g； 

ω——恶霉灵标样质量分数，％ 

枯草芽胞杆菌的检测方法：采用平板计数法。称取样品10g(精确到0.01g)，加入带玻璃珠的90mL的无菌水中，液体菌剂取10.0mL(精确到0.01mL)加入90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r／min充分振荡30min，即成母液菌悬液(基础液)。将母液在80℃水浴锅恒温水浴30min。用无菌移液管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加入45mL无菌水中，按1∶10进行系列稀释，分别得到1∶1×10¹，1∶1×10²，1∶1×10³，1：1×10⁴……稀释的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)。每个样品取3个连续适宜的稀释度，用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，于37℃条件下培养。根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。以出现30-300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度，其平均菌落数在30-300个之间时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。有效活菌数按式(1)计算： 

n_m＝kv₁／(m₀v₂)×10^-8    .....................(1) 

式中：n_m-质量有效活菌数，    亿／g或亿／mL 

         -菌落平均数，       个 

      k-稀释倍数 

      v₁-基础液体积，          mL 

      v₂-菌悬液加入量，        mL 

      v₀-样品量，              mL 

      m₀-样品量，              g／mL 

除样品有效菌外其它的菌均为杂菌。样品中杂菌率按式(2)计算： 

m＝n1／(n1+n)×100    .....................(2) 

式中：m-样品杂菌率，    ％ 

      n1-杂菌数，             亿／g(mL) 

      n-有效活菌数，          亿/g(mL) 

经检测，该样品中恶霉灵含量为10.05％，枯草芽胞杆菌含量为550亿个孢子/克。同时进行了贮藏稳定性试验，试验结果显示该产品稳定性非常理想：25℃贮藏12个月后，该产品外观及各项物理性状都无明显变化，恶霉灵分解率小于5％；枯草芽胞杆菌R31的含量仍为550亿个孢子/克左右，优于国家标准。同时产品的杂菌率为0。 

实施例2：5％恶霉灵·200亿孢子/克枯草芽胞杆菌SC 

取枯草芽胞杆菌原粉(1000亿个孢子/克)20公斤、烷基萘磺酸盐1公斤、苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚2公斤、黄原胶0.1公斤、硅酸镁铝1公斤、水60公斤，搅拌均匀后依次进入胶体磨、砂磨机进行研磨。待物料细度达到1-5微米，将物料转移至反应釜中。在反应釜中加入恶霉灵5公斤搅拌30分钟至恶霉灵完全溶解，再加0.5公斤的37％盐酸溶液搅拌10分钟，最后加水补足定量到100公斤。即得到5％恶霉灵·200亿孢子/克枯草芽胞杆菌水悬浮剂。 

该水悬浮剂中有效成分含量的测定方法与实施例1中的测定方法相同。经检测，该样品中恶霉灵含量为4.9％，枯草芽胞杆菌含量为220亿个孢子/克。 

实施例3：10％恶霉灵·600亿个孢子/克枯草芽胞杆菌WDG 

取枯草芽胞杆菌原粉(1000亿个孢子/克)60公斤、98％恶霉灵原药10.2公斤、烷基酚聚氧乙烯基醚甲醛缩合物硫酸盐4公斤、烷基萘磺酸盐2公斤、脂肪醇聚氧乙烯醚2公斤、白炭黑3公斤、高岭土18公斤投入混合器中充分混匀，并经气流粉碎机进行粉碎。在捏合机中将13公斤水均匀加入到粉碎好的物料中进行捏合后，投入到造粒机中进行挤压造粒。将挤出的湿颗粒转至流化床中进行干燥，至产品中残留水分含量为1％左右。这样即制成10％恶霉灵·600亿个孢子/克枯草芽胞杆菌水分散粒剂约100公斤。 

该水分散粒剂中有效成分含量的测定方法与实施例1中的测定方法相同。经检测，该样品中恶霉灵含量为9.8％，枯草芽胞杆菌含量为620亿个孢子/克。 

实施例4：10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对香蕉枯萎病的田间试验 

2012年12月开始，我们在湛江市徐闻县龙塘镇黄定管区香蕉地开展R31可湿性粉剂的防效试验。此地块之前有发生香蕉枯萎病，种植面积60亩。防治对象为第一代巴西蕉，2012年10月中旬移栽。 

试验设计3个处理，分别为10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂2500倍(编号A)、15％恶霉灵水剂1500倍(编号B)、500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂1500倍(编号C)和空白对照(CK)。每个试验4个重复，每小区种植约100株香蕉。由于香蕉枯萎病属传染性病害，为了减少各处理区的相互影响，各处理区的安排见如下表： 

采用人工灌根法，往蕉头上淋药水，每次每棵淋水2000ml，在晴天天气淋药水，在香蕉苗期时开始用药，每时隔35天左右用一次。第一次淋药时间为2012年12月20日，第二次淋药时间为2013年2月1日，第三次淋药时间为2013年3月7日，第四次淋药时间为2013年4月18日，5月28日调查时有个别香蕉株数抽蕾。调查每个处理的香蕉总株数及发病株数，采取多次调查，每次淋药前都调查发病株数，结果如下表： 

从试验结果可以10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌可湿性粉剂对香蕉枯萎病的效果要明显优于两者的单剂，说明其具有很好的增效作用。并且从病情发展趋势来看也研制了我们的判断，恶霉灵在前期表现较好，而枯草芽胞杆菌则需要一定是时间才能逐渐显示出其优势。香蕉枯萎病是一种非常难以防治的土传病害，其病原菌为厚垣孢子，是普通的药剂难以获得较好的防治效果。而该试验中10％恶霉灵·500亿个孢子/克枯草芽胞杆菌R31WP则表现出了相当理想的防效，为这类病害的防治提供了一个方向。并且使用该土壤调理剂处理后，香蕉的长势也明显优于对照，最终香蕉的平均产量比对照约高18.6％(这里仅计算未发病香蕉的产量)。 

实施例5：5％恶霉灵·200亿孢子/克枯草芽胞杆菌R31水悬浮剂对黄瓜出苗率试验 

试验方法：采用规格60cm*45cm*30cm的泡沫箱育苗，采用田间经过多轮连作、黄瓜死苗非常严重的地块土壤。于2013年4月播种，每个药剂设4个重复，每个重复(1个泡沫箱) 播种200颗黄瓜种子。播种后第二天进行苗床淋施，均匀浇透。定期调查死苗及作物生长情况。 

通过药后的调查，结果如下表： 

并且在试验中观察到(如图所示)5％恶霉灵·200亿孢子/克枯草芽胞杆菌SC的处理比其他两个药剂处理长势好，主要表现在子叶厚大，真叶长出速度相对快。此次试验全程无药害现象出现。 

Claims (4)

1.一种含胺鲜酯和香菇多糖的抗植物病毒组合物，其特征在于：它的有效成分是胺鲜酯或其盐和香菇多糖。所述的胺鲜酯或其盐含量为1％～50％，香菇多糖含量为0.5％～20％，溶剂含量10％～91％、乳化剂含量5％～20％和稳定剂3％～10％组成。

2.根椐权利要求1所述的胺鲜酯盐为胺鲜酯苯甲酸盐、胺鲜酯草酸盐、胺鲜酯柠檬酸盐、胺鲜酯盐酸盐、胺鲜酯硫酸盐、胺鲜酯磷酸盐。

3.根椐权利要求1所述的含胺鲜酯或其盐和香菇多糖的抗病毒组合物，其特征在于：所述混合物中还包括溶剂、稳定剂和乳化剂。溶剂为水、苯、甲苯、二甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸、乙酸乙酯、己烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的一种或几种；稳定剂为柠檬酸盐、柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、磷酸二氢钾、三聚磷酸钠中的一种和几种；表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基苯磺酸盐、蓖麻油聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、聚乙二醇、烷基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、EO-PO嵌段化合物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯等公知的乳化剂中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的抗植物病毒组合物，其特征在于在烟草抗病毒病上的的应用。

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