CN103861118A

CN103861118A - 石墨烯－CpG制备方法及应用

Info

Publication number: CN103861118A
Application number: CN201410109624.7A
Authority: CN
Inventors: 任辉; 汤钧; 史莹; 王丹; 林巍; 于晓强; 赵树理; 张研
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2014-03-24
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-24
Also published as: CN103861118B

Abstract

本发明涉及一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：首先功能化石墨烯（Graphene），称量1mgGraphene和5mgPL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解；室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱；Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L，4°C保存；再将石墨烯与寡核苷酸CpG结合；其制备方法独特，可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。

Description

石墨烯－ CpG 制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种石墨烯－CpG制备方法及应用，用于医药领域。

背景技术

石墨烯在生物医药领域的应用面临着引起炎症反应的缺点。CpG寡核苷酸片段是最早于细菌中发现的能有激发免疫系统的杀伤作用的识别分子。目前，常被用于免疫治疗或免疫辅助治疗中。TLR-9是CpG发挥作用的胞内信号分子。但是人工合成的CpG寡核苷酸通常难以进入细胞，如何寻找稳定、高活性和生物相容性好的载运体系是CpG药物应用的关键。石墨烯或者CpG的单独应用，稳定性差，细胞摄取效率低。使得二者的生物治疗应用明显受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石墨烯－CpG制备方法及应用，其制备方法独特，可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。

本发明的技术方案是这样实现的：一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（一）首先功能化石墨烯（ Graphene ）

1）称量1mgGraphene和5mg PL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解；

2）置于Vrtis VirSonic 300S水浴超声机中超声处理60分钟，每间隔5～10分钟输出功率调到7级，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免过热；

3）室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；

4）记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱；Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L，4°C保存；

5）从第3步骤制备的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量筛截（MWCO）作用的4ml的Aicon离心过滤装置中，加入3ml蒸馏水，室温，离心10min，转速3000g，滤器中的残留物体积应该小于0.5ml，加蒸馏水至4ml，离心，重复加水，离心，共3次，以保证完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG，最后一步清洗完毕后，应用UV–VIS–NIR分光光度仪（重量消光系数是808nm，0.0465 l mg⁻¹ cm⁻¹）检测Graphene溶液浓度，加入蒸馏水调整Graphene浓度至100mg/L备用；

（二）再将石墨烯与寡核苷酸 CpG 结合

6）应用1mg Sulfo-LC-SPDP（磺基丁二酸亚胺基丙酸酯）混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene 50μlg/500μl，加入50ul 10×PBS，室温下孵育2h；

7）第6步开始后，立即制备10mM DTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸馏水），15μl DTT溶液制成100μM CpG 100μl，室温下，反应1.5h；

8）第6步后，应用Amicon（超过滤器）离心设备（截留分子量MWCO = 100 kDa）去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4ml DNase/RNase-free水，离心10min，转速3000g，清洗3次，滤器中的残留体积应该小于0.5ml；

9）第7步后，与第8步同时进行，应用NAP-5 column Sephadex G-25 DNA Grade （甲氧萘丙酸,2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸）葡聚糖柱蛋白凝胶分离）（GE Healthcare, 17-0853-01）纯化CpG处理的DTT；应用500 μl DNase/RNase free 1 × PBS洗涤柱中的CpG，保存10～20 µl DNA样品；

10）应用第9步中的纯化的CpG 500 μl重悬第8步中活性Graphene；结合过程在4 °C下持续24h；Graphene和CpG的终浓度分别是40 mg l⁻¹ and 5µg/µl；

11）过滤活性Graphene溶液3次，收集每次过滤的上清液测量OD值；通过底物总上清（总共3次）计算第9步中的CpG终浓度，CpG终浓度＝第9步－第11步；

石墨烯－CpG用于治疗乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的药物应用。

本发明的积极效果是其制备方法独特，可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。石墨烯－CpG可以避免单独应用石墨烯引起的相关炎症反应的发生，比Free-CpG更容易及高效地被免疫细胞吞噬，由于稳定性与摄取效率的同步提高，纳米载体极大增强了CpG寡核苷酸的免疫刺激效果。同时，DNA纳米结构本身就是核酸分子，容易与待载运核酸分子偶联，且在体内具有可降解、无免疫原性等优点。

附图说明

图1为本发明的Graphene-CpG与Raw blue细胞共同孵育24h的示意图。说明Graphene-CpG能够诱导细胞核因子NF-κB生成，并具有时间和剂量依赖性，而且浓度为1mg/ml时，具有最大生物活性和最低细胞毒性。

图2为本发明的荧光显微镜下观察细胞摄入情况示意图。说明细胞摄入随着时间的增加而增多，细胞活力良好。

图3为本发明的结直肠癌实验结果示意图。说明，应用本发明药物能够明显抑制肿瘤的生长速度，当本发明与免疫增强剂联合应用时，抑制作用明显。

图4为本发明的乳腺癌实验结果示意图。说明，通过荧光检测肿瘤生长情况，实验组比较对照组具有明显的荧光强度减弱，肿瘤生长速度减缓。

图5为本发明的乳腺癌实验结果示意图。说明本发明组肿瘤体积明显小于对照组，对肿瘤具有显著的抑制作用。

图6为本发明的脑部肿瘤的分组情况。说明，本品原位注射浓度为1mg/ml，在接种肿瘤后的第4d和第8d应用。

图7为本发明的脑部肿瘤生长情况。说明，在原位接种脑胶质瘤术后第7d、14d和第21d时检测脑肿瘤的荧光强度，本发明组荧光强度明显减弱，说明肿瘤生长速度明显受到抑制。

图8为本发明的生存期曲线图。说明，本发明组比较Free-CpG组和PBS组，生存期明显延长，显著抑制肿瘤生长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1功能化石墨烯（Graphene）

1）称量1mg石墨烯和5mg PL-PEG5000-Amine或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解。

2）置于Vrtis VirSonic 300S水浴超声机中超声处理60分钟，每间隔5～10分钟输出功率调到7级，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免过热。

3）室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液。

4）记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱。Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L。4°C保存。

5）从第3步骤制备的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量筛截（MWCO）作用的4ml的Aicon离心过滤装置中。加入3ml蒸馏水，室温，离心10min，转速3000g。滤器中的残留物体积应该小于0.5ml。加蒸馏水至4ml，离心，重复加水，离心，共3次，以保证完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG。最后一步清洗完毕后，应用UV–VIS–NIR分光光度仪（重量消光系数是808nm，0.0465 l mg⁻¹ cm⁻¹）检测Graphene溶液浓度，加入蒸馏水调整Graphene浓度至100mg/L备用。

再将石墨烯 Graphene 与寡核苷酸 CpG 结合

6）应用1mg Sulfo-LC-SPDP混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene 50μlg/500μl。加入50ul 10×PBS。室温下孵育2h。

7）第6步开始后，立即制备10mM DTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸馏水）。15μl DTT溶液制成100μM CpG 100μl。室温下，反应1.5h。

8）第6步后，应用Amicon离心设备（MWCO = 100 kDa）去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP。加入4ml DNase/RNase-free水，离心10min，转速3000g，清洗3次，滤器中的残留体积应该小于0.5ml。

9）第7步后，与第8步同时进行，应用NAP-5 column Sephadex G-25 DNA Grade (GE Healthcare, 17-0853-01)纯化CpG处理的DTT。应用500 μl DNase/RNase free 1 × PBS洗涤柱中的CpG，保存10～20 µl DNA样品。

10）应用第9步中的纯化的CpG 500 μl重悬第8步中活性Graphene。结合过程在4 °C下持续24h。Graphene和CpG的终浓度分别是40 mg l⁻¹ and 5µg/µl。

11）过滤活性Graphene溶液3次。收集每次过滤的上清液测量OD值。通过底物总上清（总共3次）计算第9步中的CpG终浓度。CpG终浓度＝第9步－第11步。

实施例 2

（一）体外实验

1.不同剂量的Graphene-CpG和 Free CpG与 RAW Blue细胞共同孵育，检测NFκB活性，确定Graphene-CpG的有效浓度及活性。如图1所示；Graphene-CpG能够诱导细胞核因子NF-κB生成，并具有时间和剂量依赖性，而且浓度为1mg/ml时，具有最大生物活性和最低细胞毒性。

2. 将Graphene耦联CY3和CY5.5，与HMPC细胞共同孵育4h，然后荧光显微镜下观察细胞摄入情况。如图2所示；细胞摄入随着时间的增加而增多，细胞活力良好。

（二）体内实验

1. 结直肠癌

（1）实验材料：结直肠癌细胞SW480；无胸腺nude裸小鼠（雌性，4W，体重18～20g）。

（2）实验方法：应用人结直肠癌细胞系SW480，经过细胞培养，细胞数10⁶异位种植在裸小鼠（分四组：CTLA4+Graphene-CpG组、Graphene-CpG、Free-CpG和PBS组）背部皮下组织，CTLA4为一周两次腹腔注射，每次注射100mg，连续两周。分别在接种肿瘤后第4d、8d、12d和16d接种肿瘤部位注射Graphene-CpG、Free-CpG和PBS，观察记录一般状态，肿瘤体积。

（3）实验结果：如图3所示，应用本发明药物能够明显抑制肿瘤的生长速度，当本发明与免疫增强剂联合应用时，抑制作用更明显。

（4）结论CTLA4+Graphene-CpG组及Graphene-CpG组明显抑制结直肠肿瘤生长，比较Free-CpG组和PBS组差异显著。

2. 乳腺癌

（1）实验材料：鼠源性乳腺癌系SCC891；Wild Type小鼠（雌性，4W，体重16～18g）

（2）实验方法：应用鼠源性SCC891细胞，经过细胞培养，细胞数10⁶异位种植在WT小鼠右侧背部皮下组织，分别在接种肿瘤后第4d、8d、12d和第16d肿瘤部位注射Graphene-CpG和PBS，观察记录一般状态及测量肿瘤体积，接种肿瘤后每7天行xenogen检测脑部肿瘤生长情况，共检测3次。根据实验的protocol，因为肿瘤生长，皮肤破溃，第30d～42d处死小鼠。

（3）实验结果：如图4所示，通过荧光检测乳腺肿瘤生长情况，实验组比较对照组具有明显的荧光强度减弱，肿瘤生长速度减缓。

如图5a和5b 所示本发明组肿瘤体积明显小于对照组，对肿瘤具有显著的抑制作用。

（4）结论：Graphene-CpG明显抑制乳腺肿瘤生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。

3. 脑胶质瘤

（1）实验材料：恶性脑胶质瘤细胞Klu；Wild Type小鼠（雌性，体重16～18g）

（2）实验方法：应用恶性度极高的鼠源性Klu细胞，经过细胞培养，原位种植WT小鼠脑实质（种植点位于Bregma线右后方1.0mm处），分别在接种肿瘤后第4d和第8d原位注射Graphene-CpG、Free-CpG和PBS，观察记录一般状态及生存期，接种肿瘤后每7天行xenogen检测脑部肿瘤生长情况，共检测3次。描绘生存期曲线。

（3）实验结果：如图6所示本品原位注射浓度为1mg/ml，在接种肿瘤后的第4d和第8d应用。如图7所示脑部肿瘤生长情况，在原位接种脑胶质瘤术后第7d、14d和第21d时检测脑肿瘤的荧光强度，本发明组荧光强度明显减弱，说明肿瘤生长速度明显受到抑制。如图8所示的生存期曲线图中本发明组比较Free-CpG组和PBS组，生存期明显延长，显著抑制肿瘤生长。

Graphene-CpG组、CpG组和PBS对照组生存期分别约为30d、25d和20d。本发明的药物应用后，小鼠生存时间显著延长。观察第7d、14d和第19d的荧光检测肿瘤生长情况，治疗组小鼠脑部荧光强度明显低于PBS对照组。

（4）结论：Graphene-CpG明显抑制恶性胶质瘤生长，比较Free-CpG组和PBS组差异显著，生存期明显延长，具有统计学意义。

Claims

1.一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（一）首先功能化石墨烯（Graphene ）

3）室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；

（二）再将石墨烯与寡核苷酸CpG 结合

6）应用1mg Sulfo-LC-SPDP磺基丁二酸亚胺基丙酸酯混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene 50μlg/500μl，加入50ul 10×PBS，室温下孵育2h；

8）第6步后，应用Amicon超过滤器离心设备，截留分子量MWCO = 100 kDa去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4ml DNase/RNase-free水，离心10min，转速3000g，清洗3次，滤器中的残留体积应该小于0.5ml；

11）过滤活性Graphene溶液3次，收集每次过滤的上清液测量OD值；通过底物总上清（总共3次）计算第9步中的CpG终浓度，CpG终浓度＝第9步－第11步。

2.石墨烯－CpG用于治疗乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的药物应用。