CN103848928A - 可注射的改性透明质酸及其制备方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可注射的改性透明质酸及其制备方法和组合物。改性透明质酸由透明质酸结构单元中的-COOH上中的-OH被
Description
技术领域
本发明主要涉及一种改性透明质酸，本发明还涉及该改性高分子的制备方法和组合物。
背景技术
透明质酸是一种高分子的聚合物。是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-糖苷键相连，双糖单位之间由β-1,4-糖苷键相连。双糖单位可达25000之多。在体内透明质酸的分子量从5千到2千万道尔顿。透明质酸具有特殊生物学上的活性，且拥有无毒、低免疫反应、高生物相容、及生物可分解以及人体可吸收等特性，所以也可用于眼睛外科手术、关节内注射液、伤口愈合、外科手术防黏剂。实验证明，透明质酸也可以透过口服，进入人体血液、肌肉、硬骨组织堆积，排出体外的仅5%左右。另外，透明质酸也可用来进行皱纹的填补，脸部组织的调整。
烧伤及慢性皮肤溃疡，是一个可以引起严重生理压力并危及生命的重要公众健康问题。皮肤损伤会引发包括体液损失、体温降低、感染和疤痕组织在内的一系列问题。皮肤损伤的修复过程涉及多种细胞和生长因子的复杂反应，这些反应包括凝聚、炎症反应、基质降解、合成及沉积，血管生成，纤维素增生，上皮的再次形成，收缩以及重建。在三度烧伤及慢性溃疡性损伤时，皮肤的再生及修复仍然是临床面临的难以攻克的挑战。细胞增殖、血管生成及上皮组织的重生是皮肤再生的决定性因素。而现有的组织工程皮肤支架材料在治疗这些皮肤损伤的过程中，在功能方面有其相应的局限性，不能很好地修复皮肤。
聚合纤维及水凝胶可以用来载荷生物活性分子及细胞以促进血管生成、上皮细胞迁移及整合。在组织工程中，透明质酸（HA）由于其生物相容性好、非硫酸化、源自糖胺聚糖，不引发炎症而被广泛使用，但是细胞不能黏附天然透明质酸上，这严重限制了其应用。
为了方便使用，人家对HA进行了改性，以使其可被制成注射剂。现有主要的改性方法中，其中一种是氧化透明质酸(HA)从而获得乙醛基，而醛基可与其他聚合物的氨基起反应产生水凝胶。但是这氧化过程需要HIO4与H2O2参与破坏HA中的化学键，致HA整个结构的丢失及进一步降解等问题。另一种方法是赋予HA可用于聚合反应的烯键，从而获得多种可注射的水凝胶包括热敏类型的水凝胶。但此方法需要应用引发物及化学交联剂，会对宿主产生不可避免的毒害。
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发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新型的可用于注射的改性HA。
本发明的另一个目的在于提供一种改性HA的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述改性HA的组合物。
本发明所采取的技术方案是：
改性透明质酸，其特征在于：透明质酸结构单元中的-COOH上中的-OH被 
基部分取代，其结构示意式如下所示：
上述改性透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
1) 将透明质酸溶解于水性溶液中，加入1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷ADEP以及可选的酰胺反应催化剂，反应完全得到反应物HA-ADEP并纯化；
2) 将纯化的HA-ADEP溶解，使用非氧化性酸调节HA-ADEP溶液的pH至酸性，反应完全，纯化得到改性HA，记为AHA。
优选的，上述制备方法中，ADEP的摩尔添加量至少为透明质酸中羧基量的 0.4 倍。更佳的，ADEP的摩尔添加量优选为为透明质酸中羧基量的0.6～3倍。
优选的，上述制备方法中，调节HA-ADEP溶液的pH至1～6。
优选的，上述制备方法中，酰胺反应催化剂为EDC，或者是EDC与NHS、N-羟基硫代琥珀酰亚胺至少一种的混合物。
一种组合物，由上述的改性透明质酸和壳聚糖组成，改性透明质酸和壳聚糖的当量比为1：0.2～3。
本发明的有益效果是：
本发明的改性HA（AHA），可以与壳聚糖直接反应形成水凝胶。在形成水凝胶的过程中，没有化学交联反应，也不会破坏HA的结构。
本发明的改性HA制备方法，反应条件温和，方法简单高效，不会对HA的固有结构造成破坏。
本发明的改性HA可与壳聚糖（CS）在温和条件下反应生成水凝胶。流变动力学实验显示AHA-CS可被制成注射剂，形成的水凝胶结构较为稳定。动物实验表明AHA-CS水凝胶能加快伤口的愈合，促进细胞增殖(Ki67 marker)并能促进角化细胞迁移(p63 marker)。在水凝胶治疗的伤口中，组织学检测同时证明这种水凝胶促进肉芽组织及毛血管形成。在凝胶处理的创伤处，血管生成因子(VEGF-A)、趋化因子(SDF-1)、细胞外基质重构因子MMPs (MMP3 and MMP9)等MRNA的表达增加或表达上调。更有意义的是，在凝胶处理的伤口上找到了新生成的毛囊。
附图说明
图1是不同化合物的表征图谱；
图2是水凝胶的粘弹性曲线；
图3是MCS的细胞活力检测结果；
图4是不同处理组的创伤愈合情况图；
图5是不同处理组的血管生成情况图；
图6是不同处理组的细胞迁移情况图（基于Ki67）；
图7是不同处理组的肉芽组织情况图；
图8 是不同处理组的细胞迁移情况图（基于Ki67）；
图9是不同处理组的MMP表达情况图；
图10是AHA-CS水凝胶的电镜扫描图。
具体实施方式
本发明中所使用的缩写如下：
HA：透明质酸；ADEP：1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷；EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；CS：壳聚糖。
改性透明质酸，透明质酸结构单元中的-COOH上中的-OH被
基部分取代，其结构示意式如下所示：
为保证其可以与CS反应生成水凝胶，透明质酸结构单元中的-COOH上中的-OH的取代率不低于20%，优选不低于30%，更佳不低于40%、50%、60%，直至完全取代。
改性透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
1) 将透明质酸溶解于水性溶液中，加入1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷ADEP以及可选的酰胺反应催化剂，反应完全得到反应物HA-ADEP并纯化；
2) 将纯化的HA-ADEP溶解，使用非氧化性酸调节HA-ADEP溶液的pH至酸性，反应完全，纯化得到改性HA，记为AHA。
反应式如下：
。
ADEP的添加量可以根据取代率进行调节，为加快反应速度，同时有利于后续的纯化，ADEP的添加量一般过量添加。
上述的水性溶液可以是水，或各种缓冲液，如PBS溶液、醋酸缓冲液、TE缓冲液、 HEPES缓冲液等；HA和ADEP溶解于水性溶液中，可以更为均匀、温和地反应，不易破坏HA的结构。
酰胺反应催化剂的目的在于加快反应进行。在本方法中，酰胺反应催化剂为人们所熟知的催化剂，如异戊二醛、Genipin、EDC，或EDC与NHS和N-羟基硫代琥珀酰亚胺之中至少一种的混合物。
下面结合实施例及实验数据，进一步说明本发明。
AHA的合成
实施例1
取250mg HA溶解在10ml 0.1mol/l的PBS中，加入125mg EDC和100mg NHS作为酰胺反应催化剂，搅拌均匀，之后加入389mg ADEP静置反应过夜，透析去除未反应的小分子，干燥得到纯化的反应物HA-ADEP；
将HA-ADEP溶解于水中，加入盐酸调节溶液的pH为1～3，静置反应以生成醛基，反应完全后，透析纯化，干燥得到改性HA，记为AHA。
实施例2
取250mg HA溶解在10ml 0.1mol/l的醋酸中，加入100mg EDC和100mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺作为酰胺反应催化剂，搅拌均匀，之后加入800mg ADEP静置反应过夜，透析去除未反应的小分子，干燥得到纯化的反应物HA-ADEP；
将HA-ADEP溶解于水中，加入盐酸调节溶液的pH为1～3，静置反应以生成醛基，反应完全后，透析纯化，干燥得到改性HA，记为AHA。
实施例3
取250mg HA溶解在10ml超纯水中，加入125mg EDC和100mg NHS作为酰胺反应催化剂，搅拌均匀，之后加入500mg ADEP静置反应过夜，透析去除未反应的小分子，干燥得到纯化的反应物HA-ADEP；
将HA-ADEP溶解于水中，加入盐酸调节溶液的pH为1～3，静置反应以生成醛基，反应完全后后，透析纯化，干燥得到改性HA，记为AHA。
水凝胶的制备
将AHA与CS溶解于1（wt）%的醋酸溶液中， AHA中的醛基与CS中的NH2基反应连接，得到水凝胶，其反应原理如下：
。
取实施例1制备得到的AHA用PBS溶解，将CS溶解于1（wt）%的醋酸溶液中配制成为2.5% (w/v)的溶液，按AHA：CS=1：2的质量比混合将等体积的AHA溶液和CS溶液混合，反应得到水凝胶。以下各种实验中所使用的水凝胶，均按此方法制备得到。
统计学分析
统计学差异应用单因素方差分析，95%的可信区间，当P<0.05时，差异被视为有统计学意义。
水凝胶的结构、成分分析：
水凝胶的结构和成分由FTIR和1H-NMR谱确定。在进行FTIR分析时，将材料粉碎并以1：200的体积比与干KBr混和。使用FTIR色谱仪(Nicolet Avatar 360, USA)记录样品的光谱，以KBr粉末作为对照。使用Jeol E-270核磁共振仪获取样品在300 MHz下的1H-NMR谱，核磁共振分析时，AHA以9-10mg/ mL的浓度溶解在D2O中。
HA，AHA（实施例1）, CS, AHA-CS的FTIR光谱如图1 A所示，AHA及AHA-CS水凝胶的FTIR光谱如图1 B所示。从图中可以推断出，明胶的合成的机理是CS的氨基与AHA的醛基结合发生希夫碱反应，1730 cm-1和 2780 cm-1处新出现的特征峰与AHA上–CH=O的伸缩振动和C-H振动相同。这两个峰消失，归功于AHA-CS间醛基被消耗形成亚胺键。AHA-CS的FTIR光谱显示在1680 cm-1处的吸收有轻微增加，对应于C=N键的增加。图中清楚地显示AHA的醛基通过希夫碱与CS的氨基共价连接后，1730 cm-1的峰消失，对应显示为1680 cm-1处的吸收增加。
实施例1中的中间产物HA-ADEP的1H-NMR谱如图1 C所示，在1.2ppm和2.0ppm处的峰分别由HA-ADEP的二乙氧基丙烷基上的6个末端H（峰a）和聚糖-CH3的H（峰a）贡献。通过峰a和b的积分计算得到ADEP在HA上的偶联率均为60。
凝胶化特性：
在AR 2000 Rheometer (TA Instruments, UK)上进行粘弹性测试确定AHA-CS凝胶化的动力学参数。在室温下，测试不同频率下的粘性、储存模量(G’)及损耗模量(G’’)。
实验结果如图2所示，其中，A为AHA与CS混合物凝胶化过程上G’和G’’与时间的变化关系曲线，取样频率为0.1 Hz，B为AHA-CS水凝胶与频率的变化关系图。凝胶化的时间为两种溶液混合时间与凝胶形成时间之间的间隔，G’和G’’曲线的交叉点被认为是溶胶-凝胶的转化起始点。使用动态振荡仪测定AHA-CS水凝胶的粘弹性，监测G’和G’’的模量以确定其扫描频率在低压力下的关系。实验结果显示AHA确实与CS反应形成水凝胶。损耗模量(G’’) 比储存模量(G’)小，显示AHA-CS水凝胶表现出弹性行为。
水凝胶的特性：
使用扫描电镜（SEM, Cambridge Stereoscan 120，加速电压20kV）对水凝胶的形态进行测试。取双蒸水中最大肿胀率下的水凝胶样品，置于液氮快速冰冻然后冻干3天，冻干的样品真空喷金后进行电镜扫描检测。电镜扫描图如图10所示，显示AHA-CS水凝胶的横切面结构形态，并显示此水凝胶有一定的孔隙率。
细胞培养实验：
BMSCs培养在添加了10%胎牛血清（GIBCO）的DMEM中，培养基中还添加了1.0×105 U/l的青霉素（Sigma）和100 mg/l的链霉素（Sigma），培养条件为37℃，5% CO2。两份凝胶前液（每份100 μl）分别滴加至两个玻片上，然后将两个玻片叠放在一起，37℃保温30 min，使两种溶液凝胶化，接着将水凝胶在培养基中洗涤3次，5×104 个细胞被接种至水凝胶上并培养。
细胞活力：
在96孔培养板上，37℃保温5 min进行凝胶化。在MTT实验中使用MSCs测试细胞活力。细胞首先以5×104 个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，每2～3天更换一次培养基。在指定时刻，每个孔使用PBS溶液洗涤3次，然后加入10 μl MTT试剂，进一步培养4 h。之后，将孔内的溶液移出，加入溶解于200 μl DMSO中的甲瓒晶体，测量570nm（n=3）下的吸收值。
细胞染色：
应用共聚焦显微镜观察MSCs在水凝胶上的形态。室温下使用4%的多聚甲醛处理20 min将水凝胶上的细胞固定。使用PBS冲洗后，，室温下，样本用0.5 % Triton X-100(溶解于PBS)透化处理5分钟。室温下，样本在BODIPY? FL phallacidin溶液中孵育20分钟。细胞核应用TO-PRO-3染色。然后应用共聚焦显微镜(Olympus FV1000, Japan)拍照。
实验结果如图3所示。A为水凝胶上培养1天的照片，B为培养14天的照片。MSCs的细胞骨架使用类鬼笔环肽进行染色（绿），核使用To-pro-3染色（红），使用共聚集显微镜拍照。标尺为100μm；C为使用MTT法测定的细胞在聚苯乙烯（TCPS）和水凝胶培养48 h后的活力数据（显著性水平：p < 0.05，n=3）。
50,000 MSCs在day 0时接种在AHA-CS水凝胶上。Day 1和day 14的样本使用共聚集显微镜观察。在day 1，MSCs显示相对相同的群体特性，显现出纺锤形表型（A）。培养2周后，MSCs在凝胶上建立了一种细长的管状外形（B）。培养48 h后，使用MTT法测定细胞活力。对照组（TCPS）上的细胞活力值被设定为参照值。接种在AHA-CS水凝胶上的MCS的活力约为55%（C）。
皮肤缺损模型
24只C57BL/6J鼠(6-8w,20-25g)，按南方医科大学动物标准规程操作。手术前24小时背部剃毛，应用60 mg/kg量戊巴比妥麻醉对动物进行麻醉。一方形的1cm×1cm大小的模板在背部作标记。为了造成皮肤的全层缺损，皮肤包括筋膜及血管网膜层被切除。伤口首先用生理盐水湿润，然后伤口被平铺0.5ml水凝胶(实验组)或不做任何处理(对照组)。然后，伤口用Combi DERM dressings (Conva Tec Inc., Skillman, NJ)覆盖，三天更换一次。伤口的轮廓分别在0、3、7、10、14及21天拍照。7天及14天时每组6只动物被处死，收集整个创伤部，包括伤口及伤口周围5mm的组织。取材后从中间分成两半。一半在10%中性缓性的福尔马林中固定48小时，然后保存在70%酒精中，在4℃ 后期行H&E染色。另一半在液氮中冰冻，然后进行RT-PCR检测。
伤口愈合情况合分析
麻醉成功后，每伤口进行照相，小鼠的伤口愈合的情况分别在0、3、7、10、14和21天各时间点进行测量。不同时间的伤口大小不同，伤口收缩测量应用Image J (NIH, Bethesda, MD)测量。
伤口愈合情况=(A0-At)/A0×100%
其中A0即为原来的伤口大小，At即为各时间点所测得的伤口大小。原始伤口大小即为所造成的全层皮肤缺损的大小，即为时间点0天时的伤口大小。所量者对所测的对照组及实验组实行双盲测量。
实验结果显示，在小鼠模型中，与对照组相比，AHA-CS水凝胶可以促进伤口愈合（图4 A和B）。在水凝胶处理组中，day 10创伤面积缩小了86%，而对照组中仅缩小了49%（图 4 B，P＜0.001）。AHA-CS处理组中，day 14创伤愈合了62%，而对照组中仅愈合了31%（图4 C，* P < 0.05, ** P<0.01）。
血管密度定量
血管密度测定采用HE染色，应用20倍放大倍率。这些图像应用PS软件测量、标记，并计数。
依据手工提取RNA的方法，应用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)试剂盒进行组织冰冻后的RNA提取。应用SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA)合成cDNA。应用(GAPDH)作内参。引物序列如下：
MMP3-F: 5′- GACGATGATGAACGATGGA （SEQ ID NO：1）
MMP3-R: 5′ -CCATAGAGGGACTGAATACCA （SEQ ID NO：2）
MMP9-F: 5′-TCCAGTACCAAGACAAAGC （SEQ ID NO：3）
MMP9-R: 5′-GAGCCCTAGTTCAAGGGCAC （SEQ ID NO：4）
SDF1-F: 5′- GCCAGTCCCTCTGTTACAA （SEQ ID NO：5）
SDF1-R: 5′-CTGCACTTCCTTGCTAAAGTC （SEQ ID NO：6）
VEGF-F: 5′-TGCCGGTTCCAACCAGAA （SEQ ID NO：7）
VEGF-R: 5′-GTGGAGGAGCGAGCTGAA （SEQ ID NO：8）
GAPDH-F: 5′ -GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA （SEQ ID NO：9）
GAPDH-R: 5′ -GCCCCTCCTGTTATTATGG（SEQ ID NO：10）
根据Ct值计算PCR产物的量。
为了检验AHA-CS水凝胶是否可以促进血管的形成，在day 7和14对样本中的毛细血管进行计数。与对照组相比，AHA-CS水凝胶处理组可以使创伤处在day 7和14的血管密度分别增加2.0～2.5倍（图5 A和B，** P<0.001）。通过RT-PCR测定的VEGF和SDF-1 mRNA表达量显示具有与水凝胶处理组中血管密度增加相一致的趋势。Day 7，水凝胶组中VEGF的表达量是对照组的近1.3倍（图5 C，P<0.05），day 7和14，水凝胶组中SDF-1的表达量分别是对照组的近2.1倍和1.6倍（图5 D，P<0.05）。
免疫组织化学检测Ki67and p63
每个组织样品切成两部分，并放置在玻璃片上，这两个玻片各自应用anti-Ki67 and p63 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California)染色，然后应用FITC-labeled二抗染色，样本应用DAPI (Invitrogen, Eugene, OR)反染。所有的检测采用盲法。
组织学分析
伤口包括其周围在福尔马林中浸泡，石蜡包埋，常规进行组织检测。石蜡切片厚度为3μm，常规进行HE染色，显微照片使用PS分析。应用Image J对肉芽组织的范围及厚度进行测量，采用双组工具测量，采用双盲检测方法，采用4倍放大倍率。
在3度烧伤和慢性溃疡的复杂组织缺陷中，原位细胞增殖不足是一个重要原因。Ki67是细胞增殖的一个细胞标记。通过测定创伤处Ki67的免疫荧光强度确定AHA-CS水凝胶是否可以促进创伤处的细胞迁移（图6 A）。处理组的肉芽组织中，day 7和14 时Ki67荧光阳性细胞的量分别是对照组2.1和1.9倍。（图6 B，P<0.001）。
在创伤修改的起始阶段，肉芽组织可以作为ECM。如图7 A所示，在处理组中，新形成的肉芽组织是对照组的2.1倍（P<0.05）。对照组中创伤处的结构特征为：肉芽组织较薄，松散，无序，而水凝胶处理组中的肉芽组织较厚，呈层状。有趣的是，day 7和14时，分别在肉芽组织和真皮层观察到少量的脂肪细胞和新形成的毛囊（图7 B），图7中的标尺为1 mm。
皮肤受创后的表皮再形成是新组织修复的一个重要标志。在愈合的早期阶段，角质细胞迁移是引发表皮再形成的一个关键步骤。迁移可以通过检测p63的免疫组织化学染色确定（图8 A），在处理组中，在创伤表面，包括创伤边缘，以及肉芽组织的深层都发现有p63阳性细胞。day 7和14时，处理组中创伤组织中的p63阳性细胞分别是对照组1.7倍和2.7倍（图8 B，P<0.05）。图8中的标尺为100 μm。
这种类型的迁移可能是因为表皮干细胞和具有生物活性的水凝胶之间的交互作用。
基质金属蛋白酶(MMP)与细胞外基质沉积及重塑有关，在伤口愈合过程中起着重要作用。应用RT-PCR检测水凝胶处理组上调MMP的表达情况，MMP3在水凝胶处理组上的表达是对照组的1.6倍(day14, P<0.05)。而在水凝胶处理组中，MMP9的表达水平分别是对照组的2.3倍(day 7, P<0.05) 和9.1倍(day14, P<0.01)（图9），表明AHA-CS水凝胶可以促进基质和重构。
综上所述，本发明的AHA-CS水凝胶可以促进伤口愈合，表现在其可显著促进创伤封闭，促进细胞增殖，提高角质细胞迁移。AHA-CS水凝胶同样可以显著促进创伤处肉芽组织和毛细血管的形成。在AHA-CS水凝胶处理组中，血管生成标记物（VEGF）和血管分化因子（SDF-1）以及ECM重构MMPs（MMP3, MMP9）的表达量均上调。
<110> 南方医科大学南方医院
<120> 可注射的改性透明质酸及其制备方法和组合物
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (7)
1.改性透明质酸，其特征在于：透明质酸结构单元中的-COOH上中的-OH被 
基部分取代，其结构示意式如下所示：
2.改性透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
将透明质酸溶解于水性溶液中，加入1-氨基-3,3-二乙氧基丙烷ADEP以及可选的酰胺反应催化剂，反应完全得到反应物HA-ADEP并纯化；
将纯化的HA-ADEP溶解，使用非氧化性酸调节HA-ADEP溶液的pH至酸性，反应完全，纯化得到改性HA，记为AHA，AHA的结构如权利要求1所述。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：ADEP的摩尔添加量至少为透明质酸中羧基量的 0.4 倍。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：ADEP的摩尔添加量优选为透明质酸中羧基量的0.6～3倍。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：调节HA-ADEP溶液的pH至1～6。
6.根据权利要求2～5任意一项所述的制备方法，其特征在于：酰胺反应催化剂为EDC，或者是EDC与NHS、N-羟基硫代琥珀酰亚胺至少一种的混合物。
7.一种组合物，由权利要求1所述的改性透明质酸和壳聚糖组成，改性透明质酸和壳聚糖的当量比为1：0.2～3。
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