CN103827142A - 具有降低的效应子功能的Fc变体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcgγR的结合。

Description

具有降低的效应子功能的Fc变体

发明领域

本发明涉及制备展示降低的效应子活性的Fc变体的方法。

相关领域的描述

衍生自抗体的疗法在多种病理学病况，例如癌症、自身免疫疾病、移植排斥和传染病的治疗中使用得越来越多。在2010年，超过37种抗体和衍生的蛋白质被批准用于临床使用和超过1137种处于临床开发中，其中71％是完全的IgG。它们中的大多数(91％)含有来自IgG的Fc区并对应于全长单克隆抗体(mAb)或又称免疫粘附素的融合蛋白(ThompsonPharma2010年8月)。

多个研究显示，抗体的效应子功能对免疫疗法，特别是癌症的治疗的效力至关重要，所述癌症的治疗中寻求破坏细胞靶。能够消灭细胞靶的效应子功能主要涵盖抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。CDC主要通过Fc结构域与第一补体成分C1q的直接结合触发，而ADCP和ADCC则通过Fc结构域与Fcγ受体(FcγR)的结合触发。抗体的Fc结构域也通过与新生Fc受体(FcRn)的相互作用涉及血清持久性。因此在过去十年中已有大量研究集中在通过提高对FcRn的亲和力增强抗体诱导ADCC和CDC应答的能力和增加其血清半寿期上。

然而，在一些特定病况的治疗中，ADCC，CDC和／或ADCP的诱导不是实现治疗效果所必需的。在有些情况下必须避免这些诱导以降低副作用和避免IgG细胞毒性，例如在用抗CD3单克隆抗体orthoclone OKT3治疗进行的移植排斥的情况下。据显示，orthoclone OKT3的施用诱导促炎性细胞因子的大量全身性释放，这是orthoclone OKT3与Fcγ受体结合的结构。还显示FcγR的活化可能对例如EGFR靶向抗体，西妥昔单抗(cetuximab)的治疗具有负面影响，其被提示活化促肿瘤的M2巨噬细胞和降低患者的无恶化存活(progression-free survival)(Pander J.等人，2011)。

一般认为，当抗体或免疫粘附素仅当作针对内源或传染性靶的阻断剂或中和剂或作为细胞受体的激动剂或拮抗剂使用时，通过所述抗体或免疫粘附素的Fc区与FcγR和C1q的结合的免疫系统的募集对免疫疗法的治疗效力不是关键的，甚至因而应避免。

在这方面，据显示4种人IgG亚类表现出不同的效应子功能。一方面，IgG1和IgG3触发ADCC和CDC二者的活性。另一方面，IgG2引起CDC活性但不引起ADCC，而由于对C1q和Fcγ受体的低亲和力，IgG4展示了极差的诱导补体和细胞活化的能力。因此，IgG4已成为不希望募集宿主效应子功能的免疫疗法的优选亚类。中和性IgG4抗体已被批准用于特定病况的治疗。例如，那他珠单抗(natalizumab)是用于治疗多发性硬化的抗α4整合素mAb。尽管如此，有关IgG4在免疫疗法中的使用仍然存在一些阻碍，因为其体内不稳定性和动力学。

作为备选方案，设想了包含氨基酸修饰S228P的IgG4Fc变体。据显示，所述修饰稳定重链二聚体形成，伴随低比例(<8，3％)的仍然可能的Fab臂交换(Labrijn等人，Nature Biotech，2009，27，767-771)。也改造了IgG杂种以产生具有低效应子功能和改进的药理学谱的新的治疗mAb(Reddy等人，The journal of Immunology，2000，164，1925-1933)。AlexionPharmaceuticals公司已开发了针对补体组分C5的人源化IgG2／4κ抗体，名为依库丽单抗(Eculizumab)。依库丽单抗的重链在恒定区1(CH1)、铰链区和恒定区2(CH2)的相邻部分中包含人IgG2序列，在CH2的其余部分和恒定区3(CH3)中包含人IgG4序列。依库丽单抗已被欧洲药品管理局批准用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿和溶血性尿毒综合症。

基于IgG2和IgG4之间的结构差异，An等人通过在IgG2骨架的对应位置中引入来自IgG4的4个氨基酸(即268Q／309L1330S／331S)设想了具有改变的效应子功能的IgG2变体。得到的IgG没有展示出与C1q，FcγRI和FcγRIIIa的可检测到的结合并展示出对FcγRIIb／c的弱亲和力，但仍然具有和野生型IgG2相似的血清半寿期(An等人，mAbs，2009,1：6,572-579)。

此外，对IgG1的Fc区的多个位点特异性和随机诱变研究已导致鉴定了参与IgG1与C1q和多种促ADCC受体的结合的关键氨基酸(综述见Strohl，Current opinion in Biotechnol，2009，20，685-691)。据显示，在下游铰链结构域中的氨基酸，并且特别是第234和235位的亮氨酸残基对于IgG1Fc区对C1q，FcγRI，FcγRII和FcγRIII的亲和力至关重要。在CH2结构域中也发现了决定簇位置，例如氨基酸位置327，330和331，其突变可大大降低诱导ADCC和CDC应答的能力。

因此，Xu等人指出，在基于人IgG1的OKT3抗体中引入突变234A／235A显著降低了与FcγRI，FcγRII和C1q的结合，这避免了使用未修饰的OKT3抗体观察到的细胞因子释放综合症，而同时保留了逆转进行的移植排斥的能力(Xu等人，Cell Immunol，2000，1：16-26)。

Hezareh等人在包含突变234A／235A的抗HIV-1IgG1变体中进行了有关对效应分子的亲和力的相同的观察(Hezareh等人，Journal of virology，2001，12161-12168)。

同样地，Oganesyan等人描述了在抗CD19IgG1中引入三突变234F／235E／331S导致与若干效应分子，即FcγRI，FcγRIIa和FcγRIII和C1q的结合的完全丧失(Oganesyan等人Acta cryst.，2008，D64,700-704)。

相似地，InvivoGen公司出售编码包含突变233P／234V／235A／236Del／327G／330S／331S的人的改造的IgG1Fc变体的质粒。这些突变大大降低了IgGl Fc变体诱导ADCC和CDC的能力。

上述所有这些发明暗示将人氨基酸替换为不预期出现在这些位置上的残基，当在对患者施用的mAb中使用这些残基时将可能引起免疫反应。

也显示在Fc区第297位的天冬酰胺处的糖基化对单克隆抗体结合FcγR和触发ADCC的能力具有直接影响(综述见Abès等人，Pharmaceutica1s，2010,3，146-157)。

尽管在现有技术中描述了展示低ADCC和CDC活性的Fc变体，仍然需要制备展示对C1q和Fcγ受体的降低的亲和力的新的Fc变体的方法。

发明概述

本发明涉及生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，相比所述亲本多肽，所述变体展示与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的降低的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，Fc区的编号指根据EU索引(如在Kabat中)，或其在Kabat(Kabat编号)中的等同物的编号。

本发明的另一个目的是包含Fc区的亲本多肽的变体，相比所述亲本多肽，所述变体展示与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的降低的结合，并在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，Fc区中的氨基酸编号指根据EU索引，或其在Kabat中的等同物的编号。本发明也涉及包含所述变体的药物组合物和所述变体用于预防或治疗病理病况的用途，所述病理病况中不希望诱导ADCC和／或CDC应答。

附图简述

图1显示了天然的人IgG1序列的第216-447位(根据EU索引)与人IgG2(SEQ ID NO：7)，人IgG3(SEQ ID NO：8)和人IgG4(SEQ ID NO：9)的相应序列的比对。IgG1序列是G1m1，17同种异型(SEQ ID NO：5)和G1m3同种异型(SEQ ID NO：6)。IgG1的“下游铰链-CH2-CH3”结构域从第226位开始(见箭头)。

图2显示了质粒载体pMGM05-R603，其中将编码源自人IgG1重链的氨基酸残基226-447(根据EU索引)的人Fc基因(Fc226，SEQ NO：1)克隆进2个限制性位点BamHI和NotI之间。

发明详述

a.定义

为了能更完全地理解本申请，下面示出若干定义。这些定义旨在涵盖语法等同物。

在本说明书和权利要求书通篇，在Fc区中的残基的编号是根据在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中描述的EU索引的免疫球蛋白重链编号，将上述文献明确引入本文作为参考。本文中的“EU索引”或“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。在Kabat中的等同物指在Kabat编号中的数字。

本文中使用的“多肽”或“蛋白质”表示至少2个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。

本文中使用的“氨基酸”表示20个天然存在的氨基酸或可能在特定的定义的位置上存在的任意非天然类似物之一。

本文中的“氨基酸修饰”表示多肽的氨基酸序列中的改变。也可将“氨基酸修饰”称为“氨基酸改变”，本文中包括在多肽序列中的氨基酸突变，例如替换、插入和／或缺失。本文中的“氨基酸替换”或“替换”表示将亲本多肽序列中的特别的位置上的氨基酸替代为另一种氨基酸。例如，替换N434S指变体多肽，在此情况下指Fc变体，其中第434位的天冬酰胺被替代为丝氨酸。本文中使用的“氨基酸插入”或“插入”表示在亲本多肽序列中的特别位置上的氨基酸的添加。例如插入G>235-236指在第235和236位之间的甘氨酸的插入。本文中使用的“氨基酸缺失”或“缺失”表示在亲本多肽序列中的特别位置上的氨基酸的去除。E294Del或294Del指删除了在第294位上的氨基酸(此处为谷氨酸)。氨基酸修饰可指点突变或突变的组合。

在氨基酸突变的组合的情况下，优选的形式如下：294Del／259I／315D／434Y或E294Del／V259I／N315D／N434Y。这表示与其亲本多肽相比，在变体的Fc区中有4个氨基酸突变：一个在第294位，一个在第259位，一个在第315位，一个在第434位，第294位的氨基酸，即谷氨酸被删除，亲本多肽的第259位氨基酸，即缬氨酸被替代为异亮氨酸，亲本多肽的第315位氨基酸，即天冬酰胺被替代为天冬氨酸，亲本多肽的第434位氨基酸，即缬氨酸被替代为酪氨酸。同样地，氨基酸修饰293Del／294Del表示相比多肽亲本，在第293和294位上的氨基酸被删除。

术语“抗体”在本文中在最广泛的意义上使用。“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域的任意多肽。因此抗体包括但不限于，全长免疫球蛋白，多特异性抗体，包含至少一个可变区的Fc融合蛋白，合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)，包含多于一个Fc区的改造的抗体，嵌合抗体，人源化的抗体，全人抗体，抗体融合蛋白，抗体缀合物和分别地各自的片段。

本文中使用的“全长抗体”或“免疫球蛋白”表示构成抗体的天然生物学形式的结构，包括可变区和恒定区。“全长抗体”包括单克隆全长抗体、野生型全长抗体、嵌合全长抗体、人源化的全长抗体、全人全长抗体，此列表不是限制性的。

在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，全长抗体的结构一般是四聚体。所述四聚体由相同的2对多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(一般具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(一般具有约50-70kDa的分子量)。在有些哺乳动物中，例如在骆驼和美洲驼中，全长抗体可仅由2条重链组成，每条重链包含与Fc区连接的可变结构域。

每条链的氨基端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别并包含所谓的互补决定区(CDR)。

每条链的羧基端部分定义恒定区，其主要负责效应子功能。

在人免疫球蛋白的情况下，轻链分类为κ和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体同种型IgM，IgD，IgG，IgA,和IgE。

本文中使用的“IgG”表示属于基本由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类别的多肽。在人中，IgG包含IgG1，IgG2，IgG3,和IgG4亚类或同种型。在小鼠中，IgG包含IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3。全长IgG由相同的2对两条免疫球蛋白链组成，每一对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，每条重链包含免疫球蛋白结构域VH，Cγ1(又称CH1)，Cγ2(又称CH2)和Cγ3(又称CH3)。在人IgG1的情况下，“CH1”指根据EU索引的第118-215位，CH2结构域指第231-340位而CH3结构域指第341-447位，或分别在Kabat编号中的第114-223，244-360和361-478位。IgG1也包含铰链结构域，其在IgG1的情况下指根据EU索引的第216-230位，或Kabat中的226-243。

本文中使用的“Fc”或“Fc”区表示排除第一恒定区免疫球蛋白结构域的全长免疫球蛋白的恒定区。因此Fc指IgA，IgD,和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域，IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N-端的灵活铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域CH2，CH3和在CH1和CH2之间的下游铰链区。换句话说，IgG1的Fc区由“下游铰链-CH2-CH3”结构域组成，即从氨基酸C226至羧基末端的结构域，其中的编号根据EU索引或是在Kabat中的等同物的编号。通过所述IgG亚类和人IgG1的重链或重链片段的氨基酸序列比对可测定其他IgG亚类的类似结构域。

本文中使用的“Fc多肽”表示包含所有或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括但不限于，抗体、Fc融合物、分离的Fc、Fc缀合物和Fc片段。

本文中使用的“亲本多肽”或“多肽亲本”表示未修饰的多肽，其随后被修饰以生产变体。所述多肽可包含一个单条多肽链或未共价连接在一起的若干条多肽链。所述亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。天然存在多肽的改造的或变体形式是不由天然存在的基因编码的多肽。例如，改造的多肽可为嵌合抗体或人源化的抗体。

亲本多肽可指多肽自身，或编码其的氨基酸序列。在本发明的上下文中，亲本多肽包含选自野生型Fc区、其片段及其突变体的Fc区。因此，亲本多肽可任选地包含与野生型Fc区相比在其Fc区中先已存在的氨基酸修饰(即Fc突变体)。有利地，亲本多肽为抗体、免疫球蛋白、Fc融合多肽、Fc缀合物，此列表不是限制性的。

本文中使用的“变体多肽”、“多肽变体”或“变体”表示由于在Fc区中的至少一个氨基酸修饰与亲本多肽序列的多肽序列不同的多肽序列。

本文中的“野生型或WT”表示在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，即其是天然存在的，包括等位变异。WT蛋白质、多肽、抗体、免疫球蛋白、IgG等具有未经分子生物学技术例如诱变有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。例如，“野生型Fc区”包括但不限于，具有序列SEQ ID NO：1的IgG1的Fc区，具有序列SEQ ID NO：2的IgG2的Fc区，具有序列SEQID NO：3的IgG3的Fc区，和具有序列SEQ ID NO：4的IgG4的Fc区。

使用术语“Fc受体”或“FcR”描述结合Fc区(例如，抗体的Fc区)的受体。

术语“Fcγ受体”或“FcγR”指结合IgG抗体的Fc区的人受体。本文中使用的FcγR包括FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)，FcγRIII(CD16)亚类，包括其等位变体和这些受体的可变剪切形式。

这些FcγR也被定义为激活受体(FcγRI，FcγRIIa／c，FcγRIIIa／b)或抑制性受体(FcγRIIb)，因为其引起或抑制免疫功能。

FcγRI家族由3种基因(FCGRIA，FCGRIB和FCGRIC)组成，但只有FCGRIA的产物已被鉴定为全长表面受体。所述产物，即FcγRI，由树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及活化的嗜中性粒细胞表达。

FcγRII家族由3种基因(FCGR2A，FCGR2B和FCGR2C)组成，所述基因编码FcγRIIa，FcγRIIb和FcγRIIc蛋白。FcγRIIa在单核细胞、某些树突状细胞和嗜中性粒细胞上表达。FcγRIIc在自然杀伤(NK)细胞上表达。FcγRIIb是广泛表达的FcγR。FcγRIIb几乎存在于除了NK细胞和T细胞以外的所有白细胞上。

FcγRIII由2个基因FCGR3A和FCGR3B组成，所述基因编码FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγRIIIa蛋白在单核细胞、组织特异性巨噬细胞、树突状细胞、δ／γT细胞和自然杀伤细胞上作为跨膜蛋白表达。FcγRIIIb是在嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞表面上表达的GPI锚定的受体。

编码FcγRIIa的基因的2个等位基因产生在第131位不同的2种变体(低效应器FcγRIIaR131和高效应器FcγRIIaH131)。类似地，编码FcγRIIIa基因的2个等位基因产生在第158位不同的2种变体(低效应器FcγRIIIaF158和高效应器FcγRIIIaV158)。

引人注意地是，被认为是抗体依赖性细胞毒性的关键介体的NK细胞仅表达FcγRIIIa和FcγRIIc而不表达其他FcγR，特别是抑制性的FcγRIIb。

每种FcγR蛋白具有对IgG亚类的差异的配体结合偏好和对IgG亚类的不同的亲和力。

激活的FcγR触发多种免疫反应，例如吞噬作用，呼吸爆发和抗原呈递细胞(APC)的细胞因子产生(TNF-α，IL-6)，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和嗜中性粒细胞和NK细胞的脱粒。激活的FcγR也在免疫复合物的清除中起重要作用。另一方面，抑制性受体FcγRIIb是B细胞内稳态中的关键调节元素。其控制细胞激活的阈值和程度。

本文中使用的“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC指细胞介导的免疫机制，藉此免疫系统的效应细胞主动地裂解已被特异性抗体结合的靶细胞。ADCC主要由NK细胞介导，但也可由其他免疫细胞，例如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞介导。一般ADCC由NK细胞的激活引起。NK细胞的激活涉及其Fc受体与IgG的Fc区的结合，所述IgG与靶细胞表面上呈现的抗原结合。这样的相互作用包括NK细胞释放细胞因子和细胞毒性颗粒。为了评估抗体诱导ADCC的能力，可进行在de Romeuf等人Br J Haemato1.2008Mar；140(6)：635-43中描述的测定。

本文中使用的C1q是具有约460,000kDa分子量和被比作郁金香束的结构的六价分子，其中6个胶原“秆”连接6个球状头部区域。C1q与2个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s形成复合物C1，其是补体级联途径的第一组分。

“补体依赖性细胞毒性”或CDC指在补体存在下裂解靶细胞。经典补体途径的激活通过C1q与抗体的结合起始，所述抗体与其关联抗原结合。为了激活补体级联，C1q必须结合至少2分子的IgG1、IgG2或IgG3，但仅结合1分子IgM。为了评估抗体诱导CDC的能力，可进行在Romeuf等人，Br J Haemato1.2008Mar；140(6)：635-43中描述的测定。

在Nimmerjahn和Ravetch，Nature reviews Immunology，2008，8，34-47中综述了Fcγ受体及其功能。

在例如Kishore等人，Immunopharmacology，2000,49：159-170和

等人Trends Immuno1.200930(2)：83-90中综述了C1q及其功能。

本文中使用的“FcRn”或“新生Fc受体”表示结合IgG抗体Fc区且至少部分由FCRN基因编码的蛋白质。如本领域公知的，功能性FcRn蛋白包含2条多肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FCRN基因编码。FcRn或FcRn蛋白指α-链与β-2-微球蛋白的复合物。在人中，编码FcRn的基因被称为FCGRT。FcRn涉及母亲至其胎儿的被动体液免疫的转移以及对IgG清除的控制。

在例如Roopenian，Nature Reviews Immunology，2007，7，715-725中综述了FcRn及其功能。

b.降低Fc结合C1g和FcγR的方法

本发明涉及制备Fc变体的方法，所述Fc变体展示出相比其亲本多肽降低的对C1q和／或对至少一种Fcγ受体的亲和力。

本申请人显示，在野生型和改造的IgG二者的Fc区中引入单个氨基酸突变能够显著降低所述IgG与蛋白质C1q和Fcγ受体的结合。所述单个突变对应于第294位氨基酸的缺失(下文中称294Del)，氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

更准确地说，本申请人显示，通过在包含野生型Fc区(即具有SEQ IDNO：1的氨基酸序列的Fc区)的IgG1的氨基酸序列中引入294Del得到的IgG1变体在ELISA测定中不能结合C1q蛋白，FcγRIIb(又称CD32b)，FcγRIIa(又称CD32a)，FcγRIIIa(又称CD16a)和FcγRI(又称CD64)，或相比对应的野生型IgG1变体展示降低的结合(见实施例中的III.2.1和III.2.2)。引人注目地是，在IgG1多肽中引入294Del突变也能够消除或限制与C1q和Fcγ受体的结合亲和力，所述IgG1多肽初始被改造相比野生型IgG1展示对FcRn提高的亲和力。

例如，相比野生型IgG1，具有突变294Del/256N／378V／383N／434Y的IgG1变体不能结合C1q和FcγR受体。

相反地，因此具有突变256N／378V／383N／434Y的其IgG1亲本相比野生型IgG1具有提高的结合C1q和FcγRIIIa的能力。

相比其包含氨基酸修饰2591／315D／434Y的亲本多肽，变体294Del／259I／315D／434Y得到类似的结果。所述亲本多肽相比IgG1野生型具有类似的结合C1q和FcγRIIIa的能力。

类似地，294Del，293Del，293Del／294Del，294Del／256N／378V／383N／434Y，294Del／259I／315D／434Y，294Del／397M，294Del／302A，294Del／434S，294Del／315D，294Del／230S，294Del／307A，294Del/228R,230S／315D／428L／434Y，294Del／378V和294Del／434Y变体相比其对应的亲本多肽展示了降低的与选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的结合。相反地，所述亲本多肽相比野生型IgG1具有提高的结合选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的能力。申请人还显示，通过在包含野生型Fc区的IgG1的氨基酸序列中引入294Del得到的IgG1变体展示出相比其对应的亲本IgG1类似的与FcRn的结合。类似的结合旨在指，引入294Del氨基酸修饰，所述突变，仅导致相比其亲本IgG1，变体与FcRn结合的小于35％的改变。小于35％旨在指，小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％和小于5％。

期望通过结合C1q和FcγR的能力降低，突变294Del的引入可分别影响IgG1变体相比亲本IgG1的CDC和ADCC活性。

第293位的氨基酸也是谷氨酸。其缺失导致与第294位的谷氨酸缺失相同的核苷酸和氨基酸序列。因此，变体293Del和294Del是相同的多肽。因此，本发明的第一目的是提供制备包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del或293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，在Fc区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。

在优选的实施方案中，变体展示出相比所述亲本多肽降低的与C1q和与至少一种Fcγ受体的结合。

如在标题为“定义”的上文部分中所解释的，亲本多肽指包含Fc区的多肽。所述亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。亲本多肽包括但不限于，抗体、Fc融合蛋白、Fc缀合物、Fc衍生的多肽、分离的Fc及其片段。例如，改造的多肽可为嵌合抗体或人源化的抗体。

亲本多肽的Fc区优选地选自人IgG亚类的野生型Fc区，其片段和其突变体。在本文中，人IgG的Fc区对应“下游铰链”-CH2-CH3结构域。野生型人IgG1的“下游铰链”-CH2-CH3结构域指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号第226位至第447位的氨基酸。通过所述IgG亚类与人IgG1的重链的氨基酸序列比对可测定其他人IgG亚类的类似结构域，如图1中显示。

人IgG亚类包含IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，包括其多种同种异型。IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的Fc区的序列分别对应SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列。

将Fc区片段定义为包含一个或多个源自野生型Fc区的多肽的多肽。所述Fc区的片段优选地包含来自野生型Fc区的至少100个连续的残基。来自野生型Fc区的至少100个连续的残基涵盖所述野生型Fc区的至少140，至少160，至少200，至少210个连续的残基。

如上所述，亲本多肽可包含野生型Fc突变体，即相比野生型Fc区已包含已有的氨基酸突变(例如添加、插入和／或替换)的Fc区。

如前所述，本文中使用的“变体多肽”或“变体”表示与亲本多肽的多肽序列相差至少一个氨基酸修饰的多肽序列。在目前的情况下，所述至少一个氨基酸修饰必然涵盖选自突变294Del，突变293Del和突变293Del／294Del的组合的氨基酸修饰。

根据本发明的变体多肽可展示出相比其亲本多肽降低的与第一补体组分C1q的结合。换句话说，变体对C1q的亲和力比亲本多肽对C1q的亲和力低。

根据本发明的变体多肽也可展示对至少一种Fcγ受体的亲和力，所述亲和力比其亲本多肽对至少一种Fcγ受体的亲和力低。本文中使用的Fcγ受体包括FcγRI，FcγRIII和FcγRII受体。优选地，至少一种FcγR选自FcγRIIIa，FcγRIIa，FcγRI和FcγRIIb。

在一些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与C1q和FcγRIIIa的结合。

在某些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与C1q，FcγRIIa和FcγRIIIa的结合。

在其他实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与C1q，FcγRIIIa，FcγRIIa和FcγRI的结合。

在其他实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与C1q，FcγRIIIa，FcγRIIa，FcγRI和FcγRIIb的结合。

可通过现有技术熟知的方法例如ELISA测定、流式细胞术和表面等离子共振(SPR)评估与C1q或与任一Fcγ受体的结合。

例如，如在实施例的章节III中描述的，通过计算由ELISA测定得到的其特异性信号的比例，可比较本发明的变体与目的蛋白质(例如C1q或FcγR)的结合强度与其亲本多肽与目的蛋白质的结合强度。如本文使用的，如果通过变体的特异性信号除以亲本多肽的特异性信号得到的比例小于0.50，则变体展示出相比其亲本多肽降低的与目的蛋白质例如C1q或FcγR的结合，所述特异性信号由ELISA测定法测定。换句话说，变体的特异性信号比其亲本多肽的特异性信号低0.50倍。低于0.50的比例包括低于0.45，低于0.40，低于0.35，低于0.30，低于0.25，低于0.20，低于0.15，低于0.10，低于0.05，低于0.01的比例。

在优选的实施方案中，所述比例低于0.20。

ELISA测定的优选形式包括包被目的蛋白质。

作为替代方案，可通过合适的ELISA测定经测定EC50比较变体及其多肽亲本与目的蛋白质的结合。EC50指提供信号的变体浓度，所述信号代表关于结合的目的蛋白质百分比对变体浓度的log值的曲线的50％饱和。一般认为，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与目的蛋白质的结合如果其EC50比其多肽亲本的EC50高至少1.5倍，。

也可通过SPR测定解离常数(Kd)评估变体与目的蛋白质的结合亲和力。一般认为，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与目的蛋白质的降低如果其Kd比其多肽亲本的Kd高至少1.5倍。

变体对C1q或对FcγR的亲和力可能太弱以致于无法通过ELISA测定的特异性信号，甚至SPR的Kd或ELISA测定的EC50准确测定，因为结合信号处于背景噪音中或在检测阈值以下。在这样的情况下，认为变体不结合目的蛋白质。

例如，根据本发明的方法得到的变体可能不结合至少一种FcγR并展示出降低的与C1q的结合。在本申请的实施例中清楚地说明了这样的变体。

在一些实施方案中，本发明的变体不结合选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质。

申请人显示，引入294Del足以显著削弱变体与C1q和与Fcγ受体的结合。换句话说，为了得到具有适当降低的与C1q和／或Fcγ受体的结合的变体，不需要引入除了294Del以外的突变。

这样的结果特别惊人，因为据申请人所知，现有技术主要描述的展示出降低的与C1q和Fcγ受体的结合的Fc变体相比其多肽亲本在其Fc区中具有至少2个氨基酸修饰。

在一些实施方案中，突变294Del因此是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰。

在一些其他实施方案中，突变293Del是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰。

在一些另外的实施方案中，氨基酸修饰de1293／del294是为了得到所述变体引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰。

因此，本发明的某些实施方案涵盖生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和／或与至少一种受体FcγR的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自下述的氨基酸修饰：

(i)294del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰，

(ii)293del，和

(iii)293del/294del，

Fc区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。

本发明的其他实施方案涵盖生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和／或与至少一种受体FcγR的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自下述的氨基酸修饰：

(i)294del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰，

(ii)293del，其中所述氨基酸修饰293del是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰和

(iii)293del/294del，

Fc区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。

在特别的实施方案中，本发明的方法提供了与包含E294Del／T307P／N434γ的变体不同的变体。

不与任何理论结合，申请人认为本发明提供的方法不显著导致Fc区中的主要结构重排使得在一些情况下，不由与Clq和FcγR结合介导的其他功能相比多肽亲本没有显著改变。引人注目地是，申请人显示对多种不同的亲本多肽，在其Fc区中引入突变294Del没有显著削弱其对新生Fc受体(FcRn)的亲和力。例如，IgG1变体256N／294Del／378V／383N／434Y的特异性信号等于其多肽亲本256N／378V／383N／434Y的特异性信号的0.75倍，而IgG1变体307A／294Del的特异性信号等于其多肽亲本307A的特异性信号的0.97倍。引人注目地是，所述变体展示出相比野生型IgGl提高的与FcRn的结合(见实施例中的表1-4)。换句话说，在一些情况下，Fc多肽亲本和通过本发明的方法得到的变体可显示接近的对FcRn的结合性能。

如本文使用的，当变体的特异性信号至少等于其亲本多肽的特异性信号的0.6倍时，通过本发明的方法得到的变体具有与其多肽亲本接近的与FcRn的结合，所述特异性信号通过ELISA测定法测定，其中如在实施例的章节III中描述的优选地固定FcRn分子。至少等于0.6倍在本文中旨在指0.6倍，0.65倍，0.70倍，0.75倍，0.80倍，0.85倍，0.90倍和0.95倍。

如上所述，亲本多肽的Fc区可选自人IgG的野生型Fc区，其片段及其突变体。

人IgG的野生型Fc区涵盖SEQ ID NO：1的多肽，SEQ ID NO：2的多肽，SEQ ID NO：3的多肽，SEQ ID NO：4的多肽，SEQ ID NO：5的多肽。

在优选的实施方案中，亲本多肽的Fc区选自来自IgG1和IgG2的野生型Fc区，其片段及其突变体。在更优选的实施方案中，多肽亲本的Fc区是野生型人IgG1的Fc区，其片段及其突变体。

如上所示，亲本多肽的Fc区可包含已有的选自一个或多个氨基酸的缺失、插入和替换的氨基酸修饰。换句话说，亲本多肽的Fc区可为野生型Fc区的突变体，优选人IgG，即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的野生型Fc区的突变体。

在一些实施方案中，多肽亲本的Fc区相比其对应的野生型Fc区包含约1至约20个氨基酸突变，优选地约1至约10个氨基酸突变。

约1至约20个氨基酸突变涵盖1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19和20个氨基酸突变。

多肽亲本的Fc区与其对应的野生型Fc区一般具有至少约90％的氨基酸同一性。至少90％的氨基酸同一性涵盖至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和99.5％。

为了测定第一多肽(A)和第二多肽(B)之间的同一性百分比，使用现有技术熟知的方法比对其序列，例如考虑最终缺口(即相比多肽(B)在多肽(A)的序列中存在的最终缺失和插入)的Needleman-Wunsch全局比对算法。可使用EMBL-EBI网站上可获得的比对工具《EMBOSS成对比对算法》，使用以下参数：(i)方法：EMBOSS：Needle(全局)；(ii)缺口延伸：0.5；(iii)缺口开放：10.0；(iv)分子：蛋白质；(v)矩阵：Blosum62。

一旦得到全局比对，可通过常规方法测定同一性百分比，优选地用从(A)和(B)的比对中得到的匹配残基数除以在(A)和(B)之间较长的多肽序列中的氨基酸数。

当亲本多肽包含已有的氨基酸突变时，所述亲本多肽可展示出相比其参考多肽，即包含野生型Fc区的类似多肽一种或多种降低或提高的效应子功能。本文中使用的效应子功能包括但不限于ADCC，ADCP，CDC和与FcRn的结合。

本领域技术人员可参考以前的研究以根据寻找的效应子功能谱测定可能存在于亲本多肽中的已有的氨基酸突变。例如，亲本多肽可包含在选自Fc区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，438，439，440，443，444，445，446和447上的至少一个氨基酸突变，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

亲本多肽也可包含在选自Fc区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，307，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，434，438，439，440，443，444，445，446和447上的仅一个氨基酸突变，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。“仅一个氨基酸突变”表示亲本多肽在上述位置上不含有多于一个修饰。例如，亲本多肽在Fc区的第307和434位上不都包含氨基酸修饰。因此，在多肽亲本的Fc区中引入的唯一突变是294Del或293Del的方法的实施方案中，得到的变体在上述氨基酸位置上不能包含多于一个氨基酸突变，特别地变体在Fc区的第307和434位上不都包含氨基酸修饰，在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

因此本发明的某些实施方案涵盖生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del或293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是得到的变体不包含294Del／T307P／N434Y或293Del／T307P／N434Y突变。

在其他实施方案中，本发明涵盖生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del或293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是得到的变体不在于294Del／T307P／N434Y或293Del／T307P／N434Y变体。

本发明的其他实施方案涵盖生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自C1q和Fcγ受体的至少一种蛋白质的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del或293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不包含在于294Del或293Del与在第307和434位上的突变的组合的氨基酸修饰，在Fc区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。同样地，多肽亲本可包含或可不包含在从Fc区的第290至292位和从第295至300位上的至少一个氨基酸修饰，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

因此，在一些实施方案中，多肽亲本不包含在从Fc区的第290至292位和从第295至300位的任意氨基酸位置上的氨基酸修饰，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

从第290至292位和从第295至300位的氨基酸位置涵盖第290，291,292,295,296,297,298,299和300位。

在其他实施方案中，相比野生型Fc区多肽亲本在其Fc区中不包含任何突变。在这样的实施方案中，亲本多肽包含选自人IgG及其片段的野生型Fc区。

提醒一下，人IgG的野生型Fc区涵盖SEQ ID NO：1的Fc区，SEQ IDNO：2的Fc区，SEQ ID NO：3的Fc区和SEQ ID NO：4的Fc区。

在一些其他实施方案中，亲本多肽的Fc区是包含选自434Y，378V，397M，302A，434S，315D，230S，307A，228R，230S／315D／428L／434Y，，259I／315D／434Y和256N／378V／383N／434Y的至少一个氨基酸修饰的野生型IgG Fc区的变体。

在某些实施方案中，亲本多肽的Fc区是选自434Y，378V，397M，302A，434S，315D，230S，307A，228R，230S／315D／428L／434Y，259I／315D／434Y和256N／378V／383N／434Y的野生型IgG Fc区的变体。

在特别的实施方案中，生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法的特征如下，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合：

(i)在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，

(ii)选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰是为了得到所述变体在亲本多肽的Fc区中引入的唯一氨基酸修饰，和

(iii)亲本多肽的Fc区选自IgG及其片段的野生型Fc区；

在Fc区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

在一些实施方案中，在亲本多肽的Fc区中引入选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰的步骤包括以下步骤：

(a)提供编码亲本多肽的核酸，

(b)修饰在步骤(i)中提供的核酸以得到编码所述变体的核酸，和

(c)在宿主细胞中表达在步骤(ii)中得到的核酸并回收所述变体。

在根据本发明的方法的一些实施方案中，在亲本多肽的Fc区中引入的氨基酸修饰是294Del。在其他实施方案中，所述修饰是293Del。

这样的方法可通过分子生物学常规作法进行。为了实施本发明的方法，本领域技术人员可参考在现有技术中描述的熟知程序，其可见于例如Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第三版(Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，2001)，The condensed protocols fromMolecular cloning：a laboratory manual(Sambrook，Russell，CSHL Press，2006)，和Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons，2004)。

亲本多肽的核酸可为市售的或可通过分子生物学或化学合成的经典程序得到。可通过使用现有技术中已知的多种方法修饰亲本多肽的核酸取得如在步骤(b)中提到的编码变体的核酸。这些方法包括但不限于定点诱变、随机诱变、PCR诱变和盒式诱变。

考虑到其在宿主细胞中的表达，可将编码所述变体的核酸掺入表达载体中。

表达载体一般包括有效连接的，即置于与控制或调控序列、可选择标签、任意融合伙伴，和／或额外的元件的功能关系中的蛋白质。可通过在合适的条件下，培养用核酸，优选含有编码变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞以诱导或导致蛋白质的表达，产生本发明的变体。可使用多种合适的宿主细胞系，包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。也可在无细胞翻译系统中实现体外合成，所述无细胞翻译系统包括但不限于来自兔网织红细胞、小麦胚芽和大肠杆菌的提取物。

例如，在可从美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)获得的ATCC细胞系目录中描述了可使用的多种哺乳动物细胞系。宿主细胞可为，但不限于，YB2／0(YB2／3HL.P2.GII.IGAg.20细胞，保藏在美国模式培养物保藏所，ATCC nOCRL-1662)，SP2／0，YE2／0，1R983F，Namalwa，PERC6，CHO细胞系，特别是CHO-K-1，CHO-Lec10，CHO-Lecl，CHOLecl3，CHO Pro-5，CHO dhfr-，Wil-2，Jurkat，Vero，Molt-4，COS-7，293-HEK，BHK，KGH6，NSO，SP2／0-Ag14，P3X63Ag8.653，C127，JC，LA7，ZR-45-30，hTERT，NM2C5，UACC-812等等。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域熟知的，并将根据使用的宿主细胞而变化。

宿主细胞可属于转基因非人动物或转基因植物自身。在这种情况下，因此从转基因生物得到变体。

可通过将想要的基因直接注射进受精卵得到转基因非人动物(Gordon等人，1980Proc Natl Acad Sci USA.；77：7380-4)。转基因非人动物包括小鼠、兔、大鼠、山羊、母牛、牛或家禽等等。可通过将想要的基因引入胚胎干细胞并通过聚集嵌合体法或注射嵌合体法制备动物得到具有想要的基因的转基因非人动物(Manipulating the Mouse Embryo，A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；GeneTargeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993))。胚胎干细胞的例子包括小鼠(Evans和Kaufman，1981，Nature；292：154-156)、大鼠、山羊、兔、猴、家禽、家畜等等的胚胎干细胞。此外，也可使用克隆技术制备转基因非人动物，其中将引入想要的基因的细胞核移植入无核的卵(Ryan等人，1997Science；278：873-876；Cibelli等人，1998Science，280：1256-1258)。可通过将编码变体分子的DNA引入通过上述方法制备的动物，由此在动物中形成和积累变体分子，然后收集动物中的多肽变体来生产多肽变体。可使多肽变体在动物的乳、卵等中形成和积累。

在所有上述实施方案中，亲本多肽可为天然存在的多肽(野生型多肽)，天然存在多肽的变体或改造的形式，或合成的多肽。

在一些实施方案中，亲本多肽选自Fc融合蛋白、Fc缀合物和抗体。

如本文中所使用的，Fc融合蛋白的Fc缀合物由与伙伴连接的Fc区组成。Fc区与伙伴的连接可具有或不具有间隔子区。

根据本发明，Fc融合蛋白是由单个基因编码的蛋白质，并包含与Fc区连接的蛋白质、多肽或小肽。Fc融合蛋白任选地包含肽间隔子区。几乎任意蛋白质或小肽可与Fc区连接生成Fc融合物。蛋白质融合伙伴可包括但不限于，受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子或一些其他蛋白质或蛋白质结构域。

特别地，Fc融合蛋白可为免疫粘附素，即组合了异源“粘附”蛋白质(即受体、配体或酶)的结合结构域和免疫球蛋白恒定结构域的片段(即Fc区)的抗体样蛋白质(有关免疫粘附素的综述见Ashkenazi A，Chamow SM.1997，Curr Opin Immuno1.；9(2)：195-200)。

小肽可包括但不限于将Fc融合物引导至治疗靶的任意治疗剂。

根据本发明，Fc缀合物由Fc区与缀合伙伴的化学偶联形成，并任选地包含连接Fc区和缀合伙伴的间隔子区。缀合伙伴可为蛋白质或非蛋白质。偶联反应一般使用Fc区上的和缀合伙伴上的官能团。

合适的缀合伙伴包括但不限于，治疗多肽、标签(标签的例子见下文)、药物、细胞毒性剂、细胞毒性药物(例如化学治疗剂)、毒素和这些毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括但不限于，白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链等等。细胞毒性剂可为能够直接与Fc变体缀合或通过与Fc变体共价附着的螯合剂螯合的任意放射性核素，其。在额外的实施方案中，缀合伙伴可选自卡里奇霉素，auristatin，格尔德霉素，美登素，和倍癌霉素和类似物。

如上所述，本文中在最广泛的意义上使用术语“抗体”。根据本发明，“抗体”指至少包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域的任意多肽。所述结合多肽结构域能够特异性地结合一种给定的靶抗原或一组靶抗原。源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域包含至少一个或多个CDR。在本文中，抗体包括但不限于全长抗体、多特异性抗体、包含至少一个可变区的Fc融合蛋白或合成抗体(本文中有时称为“抗体模拟物”)、抗体融合蛋白、抗体缀合物和分别各自的片段。

包含至少一个可变区的Fc融合蛋白意为包含(i)Fc区和(ii)源自免疫球蛋白的可变结构域的结合多肽结构域的经改造的蛋白质。特别感兴趣的是这样的抗体，所述抗体包含(a)本发明的Fc变体，和(b)以下源自免疫球蛋白可变区的结合多肽结构域中的一种(即其包含至少一个CDR)：(i)由VL，VH，CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)分离的CDR区，(v)F(ab′)2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段，(vi)单链Fv分子(seFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许2个结构域缔合形成抗原结合位点，(vii)双特异性单链Fv和(viii)通过基因融合构建的“双抗体”或“三抗体”，多价或多特异性片段，此列表不是限制性的。

本文中的“全长抗体”意为具有抗体的天然存在的生物学形式的抗体，包括可变和恒定区。全长抗体可为野生型抗体，野生型抗体的突变体(例如包含已有的修饰)，野生型抗体的经改造的形式(例如嵌合的，人源化的抗体或全人抗体，见下文)，此列表不是限制性的。众所周知，全长抗体的结构一般是四聚体，一些哺乳动物例外，例如美洲驼和骆驼，其中一些免疫球蛋白是二聚体。

全长抗体的脚手架组分可为来自不同物种的混合物。这样的抗体变体可为嵌合抗体和／或人源化的抗体。一般地，“嵌合抗体”和“人源化的抗体”都指组合了来自多于一种物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”传统上包含来自非人动物，一般是小鼠(或有时是大鼠)的可变区和来自人的恒定区。多数情况下，人源化的抗体是含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。通常在人源化的抗体中，除了CDR以外，整个抗体由人来源的多核苷酸编码，或除了其CDR中以外与人抗体相同。由来源于非人生物的核酸编码的一些或全部CDR被移植进人抗体可变区的β-片层框架中以产生抗体，所述抗体的特异性由植入的CDR决定。制备这样的抗体的方法是周所周知的并在例如WO92／11018；Jones，1986，Nature321：522-525；Verhoeyen等人，1988，Science239：1534-1536，Tsurushita&Vasquez，2004，Humanization of Monoclonal Antibodies，MolecularBiology of B Cells，533-545，Elsevier Science(USA))中描述。

如本文中使用的，“全人抗体”或“完全的人抗体”指完全包含来源于人基因的序列的抗体。有些情况下，这可为人抗体，所述人抗体具有源自人染色体的具有上述修饰的抗体基因序列。可选地，抗体的组分可为人的，但不来源于单个基因。因此，例如，来自一种抗体的人CDR可与来自一种或多种人抗体的序列，例如脚手架序列组合。例如，可组合多个种系序列以形成人抗体或人脚手架。

在本发明的范围内也包括包含共价修饰的全长抗体。这样的修饰包括但不限于糖基化、标记和缀合。

标记指可检测的标签和全长抗体的偶联。如本文中使用的，标签包括但不限于：a)同位素标签，其可为放射性的或为重同位素；b)磁性标签(例如磁性颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料，例如发色团、磷光体和荧光团；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化的基团；和f)由第二报告物识别的预先确定的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签等等)。

缀合指全长抗体与多肽或非肽分子，例如受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、药物、细胞毒性剂(例如化学治疗剂)或毒素的偶联。

在某些实施方案中，多肽亲本选自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白、全人免疫球蛋白，免疫球蛋白优选地选自IgG并且任选地是被缀合或被标记的。

c.发明的变体

本发明的另一个目的是包含Fc区的亲本多肽的变体，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质C1q和受体FcγR的至少一种蛋白质的结合，并相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰。所述变体可通过本发明的方法得到。

所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质C1q和受体FcγR的至少一种蛋白质的结合，并相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与C1q和至少一种Fcγ受体的结合。

在一些实施方案中，相比亲本多肽的Fc区，突变294Del是变体的Fc区含有的唯一突变。

在其他实施方案中，相比亲本多肽的Fc区，突变293Del是变体的Fc区含有的唯一突变。

在一些其他实施方案中，相比亲本多肽的Fc区，氨基酸修饰293Del／294Del是变体的Fc区含有的唯一修饰。

所述变体的结构和功能性质直接来自用于制备其的方法的特征，所述方法在标题为“降低Fc与C1q和FcγR的结合的方法”的部分b.中完整地描述。

应当强调，一般可从亲本多肽的性质推断出变体的性质，除了关于与Clq和Fcγ受体的结合以外，因为变体与Clq和FcγR的结合是由第294位和／或第293位上的氨基酸修饰控制的。

因此，在一些实施方案中，变体多肽展示出相比其多肽亲本降低的与C1q和与选自FcγRIIIa，FcγRIIa，FcγRI和FcγRIIb的至少一种Fcγ受体的结合。

如本文使用的，如果通过用变体的特异性信号除以亲本多肽的特异性信号得到的比例小于0.5，则所述变体展示出相比其亲本多肽降低的与目的蛋白质例如Clq或FcγR的结合，所述特异性信号通过ELISA测定法测定。换句话说，变体的特异性信号至多等于其亲本多肽的特异性信号的0.5倍。

相比野生型Fc区，变体的Fc区可包含除了294Del和293Del以外的一个或多个氨基酸修饰。通常，相比其对应的野生型Fc区，变体的Fc区包含从约1至约21个氨基酸修饰，优选地从约1至约11个氨基酸修饰，所述修饰包括294Del，293Del或293Del／294Del。

与亲本多肽类似，相比野生型Fc区，变体可还包含在选自Fc区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，438，439，440，443，444，445，446和447上的至少一个氨基酸修饰，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

相比野生型Fc区，变体可还包含在选自Fc区的氨基酸位置227，228，230，231，233，234，239，241，243，246，250，252，256，259，264，265，267，269，270，276，284，285，288，289，301，302，303，305，307，308，309，311，315，317，320，322，325，327，330，332，334，335，338，340，342，343，345，347，350，352，354，355，356，359，360，361，362，369，370，371，375，378，380，382，383，384，385，386，387，389，390，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，403，404，408，411，412，414，415，416，418，419，420，421，422，424，426，428，433，434，438，439，440，443，444，445，446和447上的仅一个氨基酸修饰，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。“仅一个氨基酸突变”意为变体在上述位置上不含有多于一个修饰。例如，相比野生型Fc区，变体在Fc区的第307和434位上不都含有氨基酸修饰。因此，在本发明的某些实施方案中，变体不含有在于294Del／T307P/N434Y或293Del／T307P／N434Y的氨基酸修饰。在本发明的特别的实施方案中，变体不在于294Del／T307P／N434Y20或293Del／T307P／N434Y变体。

在本发明的其他实施方案中，变体不包含在于294del或293del和第307和434位的突变的组合的氨基酸修饰。因此本发明的实施方案在于包含Fc区的亲本多肽的变体，其相比所述亲本多肽与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR，且相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是所述亲本多肽的变体不包含在于294del或293del和第307和434位的突变的组合的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，本发明的变体在Fc区中还至少包含选自378V，434Y，397M，302A，434S，315D，230S，307A，228R，230S／315D／428L／434Y，259I／315D／434Y的氨基酸修饰和氨基酸修饰256N／378V／383N／434Y。

在一些特别的实施方案中，本发明的变体的Fc区是野生型IgG Fc区的变体，其包含选自Fc区的294Del，293Del，293Del／294Del，294Del／256N／378V／383N／434Y，294Del／259I／315D／434Y，294Del／397M，294Del／302A，294Del／434S，294Del/315D，294Del／230S，294Del／307A，294Del／228R，230S／315D／428L／434Y，294Del／378V和294Del／434Y的至少一个突变，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

同样地，相比野生型Fc区，变体可包含或可不包含在从Fc区的第290至292位和从第295至300位的任一位置上的一个氨基酸修饰，其中在Fc区中的氨基酸编号为EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

在某些实施方案中，相比野生型Fc区，变体在其Fc区中不包含除了294Del或293Del以外的可降低与C1q和与至少一种FcγR的结合的任意突变。

在其他实施方案中，相比野生型Fc区，变体在其Fc区中不包含除了294Del或293Del以外的任意突变。

在一些实施方案中，变体的Fc区源自IgG的野生型Fc区。

在一些其他实施方案中，变体的Fc区选自IgG野生型Fc区的变体的组，所述组由293Del，294Del，293Del／294Del，378V／294Del，434Y／294Del，294Del／397M，294Del/302A，294Del/434S，294Del／315D，294Del／230S，294Del／307A，294Del／228R，230S／315D／428L／434Y，259I／315D／434Y／294Del和256N／378V／383N／434Y／294Del组成，其中氨基酸编号指EU索引或在Kabat中的等同物的Fc氨基酸编号。

在其他实施方案中，变体选自Fc融合蛋白、Fc缀合物和抗体。

在一些实施方案中，变体是选自嵌合免疫球蛋白、人源化的免疫球蛋白和全人免疫球蛋白的抗体，免疫球蛋白优选地在IgG中选择。

本发明的另外的目的是编码如上定义的变体的分离的核酸。本发明也涉及包含编码所述变体的核酸的载体和包含所述载体的宿主细胞。在优选的实施方案中，编码所述载体的核酸已被稳定地整合进宿主细胞的基因组中。本发明也涉及非人转基因动物，其包含稳定整合在其基因组中的所述核酸或所述载体。

d.根据本发明的方法和变体的用途

本申请人显示，Fc区的突变294Del大大削弱了Fc变体对C1q和对Fcγ受体例如FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIb和FcγRIIIa的亲和力。对这些效应分子的亲和力的降低如此重大，以致于在某些情况下，通过常规ELISA测定法在体外无法观察到Fc变体与C1q和／或与某些FcγR的结合。Fc区与C1q的结合对体内诱导CDC是基本的。同样地，Fc区与FcγRIIa和FcγRIIIa的结合是体内诱导ADCC和ADCP的关键步骤。

因此，由于其对C1q的低亲和力，预期本发明的变体没有CDC活性或相比其亲本多肽和一般地相比包含没有突变294Del或突变293Del的Fc区的多肽，所述变体诱导显著较低的体内CDC应答。同样地，由于其对某些FcγR(特别是FcγRIIa和FcγRIIIa)的低亲和力，预期本发明的变体相比其亲本多肽和一般地相比包含没有突变294Del或突变293Del的Fc区的多肽没有ADCC活性或诱导显著较低的体内ADCC应答。预期在体外CDC和ADCC测定中也有相同的结果。

申请人确实已经显示，通过在包含野生型Fc区(即具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的Fc区)的IgG1的氨基酸序列中引入294Del得到的IgG1变体不展示，或展示降低的ADCC和／或CDC活性。

引人注目地，在最初改造的相比野生型IgG1展示对FcRn提高的亲和力的IgG1多肽中引入突变294Del也使得能够限制或消除ADCC和／或CDC活性，同时优先地保留对FcRn的亲和力。

例如，具有突变294Del／256N／378V／383N／434Y的IgG1变体不展示ADCC和CDC活性，但展示至少与其IgG1亲本类似的对FcRn的亲和力(见实施例章节III和IV中的ELISA和SPR结果)。

变体294Del／259I／315D／434Y相比其包含氨基酸修饰259I／315D／434Y的亲本多肽得到类似的结果。

由于其效应子活性谱，本发明的变体可用于广泛的科学领域。特别地，本发明的变体可用作研究试剂、诊断剂或治疗剂。

例如可用荧光团或用同位素例如铟-111或锝-99m标记变体并用于体内影像，因为在这样的应用中不需要激活ADCC或CDC。

当用作治疗剂时，可使用变体运送治疗剂例如放射性核素、毒素、细胞因子或酶至靶细胞，例如癌细胞。在此情况下，变体可为抗体和细胞毒性剂之间的缀合物，并且其治疗活性依赖于细胞毒性剂(例如Gilliland等人，PNAS，1980，77，4539-4543)。

多肽变体也可作为靶分子的阻断剂或中和剂发挥作用，但不杀死具有靶抗原的细胞。其也可激动、拮抗或抑制靶分子。

在这些情况下，靶细胞的消耗是不理想的并可被认为是副作用。例如，抗CD4抗体阻断T细胞上的CD4受体的能力使其成为有效的抗炎剂，但其募集FcγR的能力也导致针对靶细胞的免疫攻击，导致T细胞消耗。效应子功能对经放射性标记的抗体(被称为放射性缀合物)和与毒素缀合的抗体(被称为免疫毒素)也可以是问题。这些药物可用于破坏癌细胞，但是通过Fc与FcγR的相互作用募集免疫细胞将健康的免疫细胞带到致命的有效负荷(放射物或毒素)附近，导致正常淋巴组织连同被靶向的癌细胞一起消耗。申请人显示，根据本发明的变体尽管展示了改变的与C1q和与至少Fcγ受体的结合，其显示了类似的其他功能特征，例如抗原识别或FcRn亲和力。因此不干扰其他重要的抗体性能，例如抗体稳定性、结构完整性或与其他重要的Fc配体例如FcRn和蛋白质A和G相互作用的能力。

靶分子可为任意类型，并且包括外源和内源分子。靶分子(当多肽变体是抗体时也称抗原)包括但不限于，病毒、细菌和真菌蛋白，朊病毒，毒素，酶，膜受体，药物和可溶性蛋白质。

膜受体包括但不限于，RhD抗原，CD3，CD4，CD19，CD20，CD22，CD25，CD28，CD32B，CD33，CD38，CD40，CD44，CD52，CD71(转铁蛋白受体)，CD80，CD86，CTLA-4，CD147，CD160，CD224，生长因子受体，如属于ErbB家族的受体ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4(EGFR，HER2／neu，HER3，HER4)，VEGF-R1，VEGF-R2，IGF-R1，PIGF-R，MHCI型和MHCII型分子，例如HLA-DR，I型干扰素受体，白介素受体如IL-1R，IL-2Rα，IL-2Rβ和IL-2Rγ，IL-6R，激素受体如Müllerian抑制物质II型受体，LDL受体，NKp44L，趋化因子受体如CXCR4，CCR5，TNFR，CD137，整合素。粘附分子如CD2，ICAM，EpCAM，，G蛋白偶联受体。

膜蛋白也包括肿瘤标记物如GD2，GD3，CA125，MUC-1，MUC-16，癌胚抗原(CEA)，Tn，糖蛋白72，PSMA，HMW-MAA其他蛋白质例如DC细胞特异性的BDCA-2，胰高血糖素样肽(例如，GLP-1，等等)，酶(例如，葡糖脑苷脂酶，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，α-半乳糖苷酶-A，agalsidaseα和β，α-L-艾杜糖醛酸酶，丁酰胆碱酯酶，几丁质酶，谷氨酸脱羧酶，伊米苷酶，脂肪酶，尿酸酶，血小板激活因子乙酰基水解酶，中性内肽酶，髓过氧化物酶，等等)，白介素和细胞因子结合蛋白(例如，IL-18bp，TNF结合蛋白，等等)，巨噬细胞激活因子，巨噬细胞肽，B细胞因子，T细胞因子，蛋白质A，变态反应抑制剂，细胞坏死糖蛋白，免疫毒素，淋巴毒素，肿瘤坏死因子，肿瘤抑制剂。

可溶性蛋白质包括但不限于，细胞因子例如IL-1β，IL-2，IL-6，IL-12，IL-23，TGFβ，TNFα，IFNγ，趋化因子，生长因子如VEGF，G-CSF，GM-CSF，EGF，PIGF，PDGF，IGF，激素和抑制性抗体例如FVIII抑制性抗体，转移生长因子，α-1抗胰蛋白酶，白蛋白，α-乳白蛋白，载脂蛋白E，红细胞生成素，高度糖基化的红细胞生成素，血管生成素，血红蛋白，凝血酶，抗凝血酶III，凝血酶受体激活肽，血栓调节蛋白，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子IX，因子XIII，血纤维蛋白溶酶原激活因子，纤维蛋白结合肽，尿激酶，链激酶，水蛭素，蛋白质C，C反应蛋白，B细胞激活因子受体，受体拮抗剂(例如，IL1-Ra)，补体蛋白，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，因子H，因子I，因子P，其他蛋白质例如CSAP，CD137配体，凝集素，唾液酸化的蛋白质。

根据本发明的变体可用于微生物毒素中和(例如破伤风毒素或炭疽)或预防病毒感染例如肝炎，由乳头瘤病毒或呼吸道合胞体病毒介导的感染。根据本发明的中和变体也可用在中毒的情况下使用。最后，根据本发明的中和变体也可针对自身抗原例如VEGF用于治疗癌症或其他病理学，例如由于年龄的黄斑变性。

根据本发明的变体也可用于拮抗膜受体例如细胞因子受体、生长因子受体、整合素。例如所述变体可用作移植中的免疫抑制剂，例如可抑制T淋巴细胞增殖的抗IL-2R(CD25)。所述变体也可用于限制炎性过程(炎性肠病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎)，例如在类风湿性关节炎的情况下针对IL-6受体α链的抗体。本发明的变体也可用于抑制肿瘤生长，例如抗EGFR抗体或抗HER-2受体抗体。根据本发明的抗整合素变体也可用于限制血栓形成，例如急性冠脉综合症，或用于治疗银屑病。在其他实施方案中，根据本发明的变体也可用于治疗多发性硬化。

因此本发明的变体可用作靶分子的中和剂、拮抗剂或激动剂，用于治疗或预防癌症、炎性病症、传染病、自身免疫疾病或中毒。

本文中的“自身免疫疾病”包括同种异体胰岛移植排斥、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合症、自身免疫性阿狄森氏病、抗嗜中性粒细胞胞质自身抗体(ANCA)、肾上腺的自身免疫疾病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少、自身免疫性荨麻疹、白塞氏病(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮、心肌症、卡斯尔曼综合症(Castleman’s syndrome)、celiac spruce、皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合症、慢性炎性脱髓鞘多发性神经病、Churg-strauss综合症、瘢痕性类天疱疮、CREST综合症、冷凝集素病、克罗恩氏病、皮肌炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、因子VIII缺陷、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病(Grave’s disease)、Guillain-Barre、古德帕斯丘综合症(Goodpasture’s syndrome)、移植物抗宿主病(GVHD)、桥本氏甲状腺炎、A型血友病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA神经病、IgM多发性神经病、免疫介导的血小板减少、青少年关节炎、川崎病、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、1型糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合症、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、银屑病性关节炎、Reynauld现象、莱特尔氏综合症(Reiter’s syndrome)、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、Siorgen综合症、实体器官移植排斥、僵人综合症、全身性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎／巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎例如疱疹样皮炎、血管炎、白癜风、和韦格纳肉芽肿病(Wegner’s granulomatosis)。

本文中的“炎性病症”包括急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、急性脓毒性关节炎、佐剂性关节炎、变应性脑脊髓炎、变应性鼻炎、变应性血管炎、变态反应、哮喘、动脉粥样硬化、由慢性细菌或病毒感染的慢性炎症、慢性阻塞性肺病(COPD)、冠状动脉疾病、脑炎、炎性肠病、炎性骨质溶解、与急性和延迟的超敏反应相关的炎症、与肿瘤相关的炎症、外周神经损伤或脱髓鞘病、与组织创伤例如烧伤和局部缺血有关的炎症、由脑膜炎引起的炎症、多器官损伤综合症、肺纤维化、败血症和败血性休克、Stevens-Johnson综合症、未分化关节病和未分化脊柱关节病。

本文中的“传染病”包括由病原体例如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫引起的疾病。传染病可由包括腺病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、Epstein-Barr病毒、汉坦病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、I型单纯性疱疹病毒、II型单纯性疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、乳多空病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞体病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS病毒、天花病毒、病毒性脑膜炎病毒等病毒导致。传染病也可由包括炭疽杆菌(Bacillus antracis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、白喉、大肠杆菌(E.Coli)、军团杆菌属、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、立克次式体分支杆菌(Mycobacteriumrickettsia)、支原体奈瑟氏菌(Mycoplasma nesisseria)、百日咳(Pertussis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(S.Pneumonia)、链球菌属、葡萄球菌属、霍乱弧菌(Vibria cholerae)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)等的细菌导致。传染病还可由例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)等的真菌导致。传染病还可由原生动物和寄生虫引起，例如衣原体、kokzidioa、利什曼原虫、疟原虫、立克次氏体、锥虫属等等。

此外，本发明的变体可用于预防或治疗另外的病况，包括但不限于心脏病况例如充血性心力衰竭(CHF)、心肌炎和其它心肌病况；皮肤病况例如蔷薇疹(rosecea)、痤疮和湿疹；骨和牙病况例如骨损失、骨质疏松、佩吉特(Paget)氏病、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、牙周病、废用性骨量减少、骨软化症、单骨纤维性骨发育不良、多发性骨纤维性发育不良、骨转移、骨痛管理、体液恶性高钙血症、牙周重建、脊髓损伤和骨折；代谢病况例如高歇(Gaucher)氏病；内分泌病况例如库欣(Cushing)氏综合症；和神经学病况。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的抗RhD变体可用于治疗或预防Rh不相容。

在其他实施方案中，根据本发明的抗CD20变体可用于治疗淋巴性白血病。

在其他实施方案中，根据本发明的变体可用于治疗和／或预防自身免疫疾病，例如免疫性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性多发性关节炎和红斑狼疮。

在一些实施方案中，亲本多肽可选自商业抗体，例如抗RhD抗体(见在FR0951412中描述的

或ZLB，Zurich的

)或抗CD20(见W02006064121)。

亲本多肽也可为

(抗VEGF)，

(抗TNF-α)，(抗EGFR)，

(抗EGFR)，(抗整合素的α4链)，(抗HER2／neu)，此列表不是限制性的。

在一些实施方案中，变体是针对选自膜受体、人可溶性蛋白质、毒素、病毒、细菌和真菌蛋白质的靶分子的中和抗体。

由于其与C1q和一些FcγR的低结合，本发明的变体特别适合用于治疗下述病况，所述病况中通过ADCC或CDC的免疫系统的募集对治疗效力不是关键的。

预期本发明的多肽变体的施用比大多数在其Fc区中不包含294Del或293Del的抗体和免疫粘附素引起较少的副作用和较少的IgG介导的细胞毒性。

因此本发明的另外的目的是本发明的变体用于预防或治疗病理学病况的用途，其中不希望诱导ADCC和／或CDC应答。

因此本发明的某些实施方案涉及亲本多肽的变体用于预防或治疗病理学病况，其中不希望诱导ADCC和／或CDC应答，包含Fc区的所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合，且相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del/294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不包含在于294Del或293Del与在第307和434位上的突变的组合的氨基酸修饰，在Fc区中的氨基酸编号指根据EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

其他实施方案涉及亲本多肽变体用于预防或治疗病理学病况，其中不希望诱导ADCC和／或CDC应答，包含Fc区的所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合，且相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不在于294Del／T307P／N434Y或293Del／T307P／N434Y变体。

当变体的治疗效力不需要效应细胞激活或CDC激活时，不希望诱导ADCC和CDC应答。这样的变体包括例如阻断或中和抗体。

治疗或预防不需要诱导CDC和ADCC的病理学病况包括但不限于，移植排斥、自身免疫疾病、炎性病症、传染病或癌症。本发明的另一个目的是本发明的变体在制备药物组合物中的用途。

在本发明的某些实施方案中，待如上所述使用的变体是这样的变体，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与选自蛋白质C1q和受体FcγR的至少一种蛋白质的结合，且相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰。

在本发明的特别的实施方案中，变体不在于294Del／T307P／N434Y或293Del／T307P／N434Y变体。

在一些实施方案中，本发明的变体在Fc区中还至少包含选自378V，434Y，397M，302A，434S，315D，230S，307A，228R，230S／315D／428L／434Y，259I／315D／434Y的氨基酸修饰和氨基酸修饰256N／378V／383N／434Y。

在一些特别的实施方案中，本发明的变体的Fc区是包含选自Fc区的294Del，293Del，293Del／294Del，294Del／256N／378V／383N／434Y，294Del／259I／315D／434Y，294Del／397M，294Del／302A，294Del／434S，294Del／315D，294Del／230S，294Del／307A，294Del／228R，230S／315D／428L／434Y，294Del/378V和294Del／434Y的至少一个突变的野生型IgG Fc区的变体，其中Fc区中的氨基酸编号是EU索引或在Kabat中的等同物的编号。

在一些其他实施方案中，变体的Fc区选自IgG野生型Fc区的变体的组，所述组由294Del，293Del，293Del／294Del，378V／294Del，434Y／294Del，294Del／397M，294Del／302A，294Del／434S，294Del／315D，294Del／230S，294Del／307A，294Del／228R，230S／315D／428L／434Y，259I／315D／434Y／294Del和256N／378V／383N／434Y／294Del组成，其中氨基酸编号指EU索引或在Kabat中的等同物的Fc氨基酸编号。

本发明的另外的目的是提供包含所述变体的药物组合物。当所述变体是抗体时，变体可以单克隆或多克隆抗体的形式存在。通过混合具有期望的纯度的多肽变体和任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以冻干的制剂或水溶液的形式制备药物组合物。

可根据标准方法，例如在Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Lippincott Williams&Wilkins；第21版，2005)中描述的方法配制本发明的药物组合物。

可使用的可药用的赋形剂特别地在Handbook of PharmaceuticalsExcipients，American Pharmaceutical Association(Pharmaceutical Press；第6次修订版，2009)中描述。

为了治疗有需要的患者，可施用治疗有效剂量的变体。本文中“治疗有效剂量”指所施用的产生效力的剂量。准确的剂量将取决于治疗目的，并可由本领域技术人员使用公知技术来确定。剂量范围可从0.001至100mg／kg体重或更大，例如0.1、1.0、10或50mg／kg体重，优选l-10mg／kg。本领域公知，可能必须对蛋白质降解、全身对局部递送、和新蛋白酶合成速率，以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重程度进行调整，并可由本领域技术人员通过常规实验方法来确定。

可以多种方式进行包含变体的药物组合物的施用，包括但不限于口服、皮下、静脉内、胃肠外、鼻内、intraortically、眼内、经直肠、经阴道、经皮、局部(如凝胶剂)、腹膜内、肌内、肺内。

本文描述的变体可与其他治疗剂相伴施用，即本文描述的治疗剂可与其他疗法或治疗剂，包括例如小分子、其他生物制剂、放射疗法、手术等共同施用。

下面的实施例进一步说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例：基于Fc变体的IgG变体生产和所述IgG的表征

I在293-F哺乳动物细胞中生产IgG变体

I.1载体构建

使用标准PCR方案，将源自人IgG1重链的编码氨基酸残基226-447(EU索引，或在Kabat中的等同物)即Fc片段(Fc226，SEQ ID NO：1)的人Fc基因(Poul MA等人，Eur.J.Immunol.25(7)：2005-20091995)作为BamHI／NotI片段克隆进真核表达载体pMGM05-R603(图2)中。pMGM05-R603载体源自pCEP4(Invitrogen)并含有R603嵌合抗CD20抗体(LFB-R603)的重链。将此抗体的轻链插入源自pCEP4的类似载体中(pMGM01-R603)。通过重叠PCR将Fc片段中的所有突变插入pMGM05-R603载体。例如，使用2组引物得到变体294Del。为了进行第一个PCR，使用5′引物MG_6195′-AGTACTGACTCTACCTAGGATCCTGCCCACCGTGC-3′(SEQ IDNO：10)和3′引物MG_9345′-GCTGTTGTACTGCTCCCGCGGCTT-3′(SEQ ID NO：11)，对于第二个PCR，使用5′引物MG_9335′-AAGCCGCGGGAGCAGTACAACAGC-3′(SEQ ID NO：12)和3′引物MG_6215′-ACTGCTCGA TGTCCGTACTATGCGGCCGCGAATTC-3′(SEQ ID NO：13)(其中用下划线标示BamHI和NotI限制位点，斜体字符对应在克隆步骤期间去除的非特异性尾巴)。然后缔合每种PCR片段的一部分，并使用引物MG_619和MG_621使用标准方案通过PCR扩增得到的延长的片段。在1％(w／v)琼脂糖凝胶上纯化PCR产物，用BamHI和NotI限制酶消化并克隆进pMGM05-R603载体中。可选地，可使用相同的引物(MG_933和MG_934)使用Quick change Multi试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行诱变。

I.2细胞培养物生产

用FreeStyle^TM MAX试剂(1μl／ml)使用标准方案(Invitrogen)，用等摩尔量(250ng／m1)的pMGM01-R603和pMGM05-R603载体共转染FreeStyle^TM293-F细胞(Invitrogen)。转染后在无血清培养基中悬浮培养细胞7天，并在以100g离心细胞10分钟后收获含有IgG的上清。然后滴定(I.3)上清(1ml)，并在通过ELISA(III.1.1)表征结合前冷冻在-20℃。

I.3生产的IgG变体的滴定

使用ELISA测定对重组蛋白L(Pierce)定量分泌在之前收获的上清中的IgG变体，使用纯化的R603抗体作为标准物。在Maxisorp免疫板(Nunc)上检测在PBS／0.05％Tween-20中连续稀释的上清和标准抗体，所述免疫板之前用0.25／μg蛋白质L／孔包被并用在PBS中的5％脱脂奶粉封闭。在37℃孵育1小时后，用PBS／0.05％Tween-20洗3次孔。用HRP山羊抗人IgG(γ链特异性)F(ab′)2片段(Sigma)检测结合的IgG变体。使用用纯化的R603抗体得到的标准曲线定量生产的IgG变体(1-4μg／ml)。

II在Y2B／O细胞中生产IgG变体

II.1载体构建

在YB2／0细胞系中以IgG形式制备具有抗CD20(R603)或抗RhD⁺(R593)特异性的Fc变体259I／315D／434Y259I／315D／434Y_294Del，256N／378V／383N／434Y和256N／378V／383N／434Y_Del294。为了最大化在YB2／0细胞系中的生产力，新合成(neosynthesize)全长重和轻链cDNA以及编码259I／315D／434Y和256N／378V／383N／434Y变体的Fc片段并针对褐家鼠(Rattus norvegicus)进行密码子优化。去除不想要的特征，例如隐藏的剪接位点或限制位点。仅在连接可变／恒定区处存在限制位点(ApaI)。

需要时，通过在PCR1中使用DELl294P1(5′引物5′-CAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGCAGTACAACAGCACCTACAGGG-3′，SEQ ID NO14)+HCH20GA-AscI(3′引物5′-AGCGGCGCGCCTCATCA-3′，SEQ ID NO15)导致501bp的扩增子，在PCR2中使用DEL294P2(5′引物5′ACCAAGGGCCCAAGCGTGT-3′，SEQ ID NO17)+HCH20GA-ApaI(3′引物5′-5CCCTGTAGGTGCTGTTGTACTGCTCCCGGGGCTTGGTCTTGGCGTTG-3′，SEQ ID NO16)导致541bp的扩增子，和最后在PCR3中使用HCH20GA-AscI和HCH20GA-ApaI导致998bp的PCR产物，通过组装PCR引入294Del突变。用AscI和ApaI消化PCR产物并将纯化的979bp片段插入表达构建体，替换亲本DNA序列。

II.2细胞培养物生产

在YB2／0稳定合并物(pool)中实现转染。用每种线性化的表达载体电穿孔来自YB2／0细胞系的细胞，然后以25，000细胞／mL在EMS培养基+5％v／v经透析的FCS(InvitroGen)中稀释，并以1ml／孔分配在24孔板中。在细胞恢复3天后，通过在EMS+5％FCS培养基中加入终浓度2g／l的G418和终浓度1％的酚红施加选择压力。孵育10天后，制备8个P24孔的3份合并物，并在F25中以2.10⁵cv／ml分散细胞。在滚动细胞培养瓶中在具有0.5g／l G418的EMS+5％FCS中以在2-810⁵cv／ml之间的起始浓度进行抗体的生产，在第5天得到最大的细胞生产，然后收集上清并在FastElysa(RD Biotech)中滴定。

在蛋白质A琼脂糖型HiTrap蛋白质A FF(GE Helthcare)上纯化抗体，然后在25mM，pH3.0的柠檬酸钠缓冲液中洗脱，级分被中和，在4℃透析进入PBS，pH6.0过夜。

通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE表征纯化的IgG，并使用凝胶过滤以估计聚集物含量。无论是何种突变，IgG被纯化至超过85％并常常超过95％，并展示每种IgG的特征重和轻链带。还使用LAL内毒素测试(鲎变形细胞溶解物(Limulus Amebocyte Lysate))胶凝法(gel clotmethod)检测纯化的IgG是否存在内毒素。低内毒素水平以及低聚集物含量证明生产的抗体因此适用于功能性测试。

III.通过ELISA的IgG变体的结合表征

III.1材料与方法

III.1.1在293-F细胞上清中生产的IgG变体的ELISA测试

通过ELISA测试IgG变体与若干受体的结合：C1q补体(Calbiochem)，FcγRIIIaV158(R&D system)，FcRn-p3(FcRn-p3指包含与噬菌体蛋白p3和CVDE蛋白融合的β2微球蛋白链和α链的融合蛋白，并在如Popov等人，Mol.Immunol.，1996，33：521-530中描述的杆状病毒系统中生产)，FcγRIIaR131(R＆D system)，FcγRI(R&D system)和FcγRIIb(R&Dsystem)。在PBS中进行所有受体的ELISA测试，除了FcRn以外，所述FcRn的ELISA测试在P6(磷酸钠100mM，氯化钠50mM pH6.0)中实现，因为FcRn／IgG结合是pH依赖的，在pH6.0最优。用PBS中的0.5μg C1q补体／孔，PBS中的0.25μg FcγRIIIaV158／孔或PBS中的0.1μg FcγRI／孔或P6中的0.1μg FcRn-p3／孔包被Maxisorp免疫板。用在0.01M KCl中的0.1μg FcγRIIaR131／孔或0.4μg FcγRIIb／孔包被Immobilizer镍螯合板(Nunc)。在4℃包被过夜后，用PBS／0.05％Tween-20(或P6／0.05％Tween-20，用于FcRn)洗2次板并用PBS／4％BSA(或P6／4％BSA，用于FcRn)在37℃饱和2小时。平行地，在PBS中将上清稀释为0.5μg／ml的最终IgG浓度(或在P6中稀释为0.3μg／ml，用于FcRn结合检测)并与相同浓度的HRP F(ab′)2山羊抗人F(ab′)2在室温混合2小时。然后在温和搅拌下，在饱和的ELISA板上孵育F(ab′)2聚集的IgG1小时，对于C1q，FcγRIIaR131和FcγRIIb未稀释(即0.5μg／ml的IgG)，对于FcγRIIIaV158和FcγRI在PBS中稀释为0.25μg／ml，或对于FcRn-p3在P6中稀释为0.0375μg／ml。然后用TMB(Pierce)使板显色并读取450nm处的吸光度。

III.1.2纯化的IgG变体的ELISA测试

通过ELISA检测了在Y2B／0中生产的IgG变体对若干受体的结合：FcRn-p3(如II.1.1中)，FcγRI(R＆D system)，FcγRIIIaV158(R&D system)，FcγRIIIaF158(作为His标记的蛋白质通过PX Therapeutics在HEK293F细胞中瞬时生产)，FcγRIIaR131(R&D system)，FcγRIIaH131(作为His标记的蛋白质通过PX Therapeutics在HEK293F细胞中瞬时生产)和FcγRIIb(R＆D system)。在PBS中进行所有受体的ELISA检测，除了FcRn以外，所述FcRn的ELISA测试在P6(磷酸钠100mM，氯化钠50mM pH6.0)中实现。对于FcγRI，FcγRIIIaV158，FcγRIIIaF158和FcγRIIaH131，用在PBS中的100ng重组蛋白质／孔包被Maxisorp免疫板(Nunc)，或用P6中的200ng FcRn-p3／孔包被板。用在0.01M KCl中的100ng FcγRIIaR131／孔或400ng FcγRIIb／孔包被Immobilizer镍螯合板(Nunc)。在4℃包被过夜后，用PBS／0.05％Tween-20(或P6／0.05％Tween-20，用于FcRn)洗2次板并用PBS／4％BSA(或PBS／4％脱脂奶粉用于FcγRI，或P6／4％脱脂奶粉用于FcRn)在37℃饱和2小时。

对于FcγRIIIaV158，FcγRIIIaF158，FcγRIIaR131，FcγRIIaH131和FcγRIIb结合检测测试，在PBS中将纯化的IgG稀释为2-4μg／ml的终浓度并与相同浓度的HRP F(ab′)2山羊抗人F(ab′)2室温混合2小时。在PBS中系列稀释后，然后在温和搅拌下在30℃在饱和的ELISA板上孵育1小时F(ab′)2聚集的IgG。然后用TMB(Pierce)显色板并在450nm处读取吸光度。对FcγRI和FcRn进行直接的ELISA。在补充4％脱脂奶粉和0.01％Tween20的PBS中(或在P6中，对于FcRn)稀释纯化的IgG并在板上孵育2小时。然后用在相同的缓冲液中稀释的HRP F(ab′)2山羊抗人F(ab′)2(1／2500)检测结合的抗体。在37℃孵育2小时后，用TMB(Pierce)使板显色并读取450nm处的吸光度。

III.2结果

III.2.1在293-F细胞的上清中生产的IgG

对每种IgG变体，进行2次独立的实验(生产、上清滴定和5个受体上的ELISA)。将ELISA结果表示为IgG变体得到的特异性信号(OD450nm)相对IgG-WT的信号的比例。这些ELISA测试显示突变294Del大大削弱了变体相比其分别的亲本多肽结合C1q(比例／IgG-WT<0.50)和FcγR(比例／IgG-WT<0.25)的能力。相反地，所述突变仅导致组合294Del和至少另一个突变的变体约0-35％的FcRn结合的损失。下面以表1和2显示结果。

表1：在对于靶蛋白C1q，FcγRIIaR131，FcγRIIb，FcγRIIIaV158，FcγRI和FcRn的ELISA测定中，IgG1变体的特异性信号与野生型IgG1得到的特异性信号的比例

表2：294Del对IgG1变体与FcγR，C1q和FcRn受体的影响：在下表中显示了对于各个目的蛋白的比例，所述比例是用通过引入294Del得到的变体的特异性信号除以不含294Del的对应IgG1的特异性信号得到的。

突变	C1q	FcγRI	FcγRllaR131	FcγRllb	FcγRlllaV158	FcRn
							294Del	0.10	0.37	0.01	0.01	0.01	0.44
259I/294Del/315D/434Y	0.10	0.41	0.01	0.01	0.02	0.66
							256N／294Del/378V/383N/434Y	0.04	0.66	0.004	0.002	0.01	0.75
294DEL/307A	0.21	0.29	0.08	0.14	0.009	0.97
							228R/294DEL	0.56	0.46	0.01	0.02	0.01	1.24
230S/294DEL	0.64	0.42	0.01	0.05	0.01	1.06
							230S/294DEL／315D/428L/434Y	0.31	0.27	0.007	0.02	0.03	0.98
294DEL/315D	0.31	0.56	0.01	0.21	0.008	1.06
							294DEL/378V	0.22	0.29	0.02	0.01	0.003	0.80
294DEL/434S	0.29	0.52	0.02	0.03	0.008	0.99
							294DEL／302A	0.24	0.06	0.01	0.02	0.02	0.73
294DEL/397M	0.07	0.40	0.008	0.01	0.005	0.83
							294DEL/434Y	0.24	0.46	0.02	0.02	0.01	1.33

III.2.2纯化IgG的ELISA结果

将ELISA结果表达为在单个抗体浓度(0.5μg／ml对于FcγRIa和FcγRIIIaV158，1μg／ml对于FcγRIIIaF158，FcγRIIaR131和FcγRIIaH131，2μg／ml对于FcγRIIb和5μg／ml对于FcRn)从Y2B／O细胞获得的纯化的IgG变体得到的特异性信号(OD450nm)相比IgG-wT(R603，嵌合抗CD20抗体和R593，人抗RhD⁺抗体)的信号的比例。这些ELISA测试显示，相比对应的野生型IgG，突变294Del没有显著改变变体与FcRn的结合。当与包含各自的亲本多肽(R603或R593259I／315D／434Y和R603或R593256N／378V／383N／434Y)的变体IgG比较时，所述突变仅导致变体259I／294Del／315D／434Y和256N／294Del／378V／383N／434Y约0-30％的FcRn结合的损失(表4)。相反地，相比其各自的亲本多肽，突变294Del大大削弱了变体结合FcγR的能力。

表3：在对于靶蛋白FcγRIa，FcγRIIIaV158，FcγRIIIaF158，FcγRIIaR131，FcγRIIaH131，FcγRIIb和FcRn的ELISA测定中，IgG1变体的特异性信号与野生型IgG1得到的特异性信号的比例。

变体	FcgRI	FcgRIIIaV158	FcgRIIIaF158	FcgRIIaR131	FcgRIIaH131	FcgRIIb	FcRn
								R603-294Del	0.15	0.07	0.09	0.07	0.10	0.42	0.71
R603-256N／378V／383N／434Y	2.19	1.22	1.25	1.40	0.93	1.83	8.51
								R603-256N／294Del／378V／383N／434Y	0.15	0.07	0.08	0.08	0.08	0.46	8.89
R603-259I／315D／434Y	1.12	1.11	1.11	1.11	0.99	1.54	6.93
								R603-259I／294Del／315D／434Y	0.10	0.05	0.08	0.07	0.08	0.41	5.97
R593-294Del	0.08	0.07	0.06	0.10	0.10	0.18	0.91
								R593-256N／378V／383N／434Y	2.19	0.98	0.92	1.08	1.01	1.55	7.49
R593-256N／294Del／378V／383N／434Y	0.12	0.10	0.10	0.17	0.17	0.27	7.48
								R593-259I／315D／434Y	1.08	0.95	0.94	1.05	0.94	1.41	7.93
R593-259I／294Del／315D／434Y	0.13	0.07	0.07	0.12	0.10	0.18	7.19

表4：294Del对IgG1变体结合FcγR和FcRn的影响：用通过引入294Del得到的变体的特异性信号除以不含294Del的对应IgG1的特异性信号计算比例。

变体	FcgRI	FcgRIIIaV158	FcgRIIIaF158	FcgRIIaR131	FcgRIIaH131	FcgRIIb	FcRn
								R603-294Del	0.15	0.07	0.09	0.07	0.10	0.42	0.71
R603-256N／294Del／378V／383N／434Y	0.07	0.06	0.06	0.06	0.09	0.25	1.04
								R603-259I／294Del／315D／434Y	0.09	0.05	0.07	0.06	0.08	0.27	0.86
R593-294Del	0.08	0.07	0.06	0.10	0.10	0.18	0.91
								R593-256N／294Del／378V／383N／434Y	0.05	0.10	0.11	0.16	0.17	0.17	1.00
R593-259I／294Del／315D／434Y	0.12	0.07	0.07	0.11	0.11	0.13	0.91

IV通过SPR(表面等离子共振)测定的结合表征

IV.1材料与方法

在BIAcore X100仪器上使用CM5传感器芯片(Biacore，GEHealthcare)监控IgG变体(见II.2)与固定化的FcRn的相互作用。方法与以前描述的分析Fc-FcRn相互作用的方法类似(Popov S.等人，MolImmunol.33(6)：521-530(1996)。使用胺偶联化学将重组的可溶性FcRn连与传感芯片的流动池2偶联。用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3(N，N-二甲氨基)丙基-N-乙基碳化二亚胺的1∶1混合物以30μl/分钟的流速活化流动池3分钟。以10μl/分钟，3分钟将重组人FcRn(5μg／ml，在10mM乙酸钠中，pH5.0)注入流动池2，这导致236应答单位(RU)的表面密度。用1M乙醇胺-HCl，pH8.5以30μl／分钟，注射3分钟封闭表面。使用流动池1作为没有FcRn的对照表面，并与样品流动池类似地制备。将从此空白流动池得到的数据从样品数据中减去。

在PBS／Tween-20(50mM磷酸缓冲液，pH6.0，150mM NaC1，0.02％NaN3，0.05％Tween-20)中稀释IgG变体，将其用作平衡结合实验中的运行缓冲液。所有测量在25℃进行，Fc片段浓度一般为0，8.75，35，70和200nM，流速为10μl/分钟。收集8分钟数据，使用含有0.05％Tween-20的PBS，pH7.5的30s脉冲再生表面。

产生传感图并使用BIA评估软件版本3.1分析。将每次注射观察到的平衡RU对Fc的浓度作图。通过使用在BIA评估软件中包括的动力学亲和力模型分析图得到平衡KD值。

IV.2结果

R593和R603抗体的结合亲和力(KD值)分别是190和99nM。在R603的情况下比较，259V／315D／的KD值和在R603的情况下，对于259V／315D／434Y为26nM，说明在pH6.0对FcRn的亲和力增加3至6倍之间。259V／294Del／315D／434Y的KD值对于R593和R603分别为28nM和20nM，显示294Del相比各自的亲本多肽变体没有显著改变对FcRn的亲和力。

表5：Del294对抗RhD⁺(R593)或抗CD20(R603)IgG1变体与FcRn之间的结合亲和力(KD值)的影响。用通过引入294Del得到的对应变体的KD值除以对应的KD值计算比例。

	KD(M)	比例WT／IgG
			R603	9,90E-08	1，00
R603294Del	1,9E-07	0,52
			R603-259I／315D／434Y	2,69E-08	3,68
R603-259I／294Del／315D／434Y	2,80E-08	3,54
			R593	1,9E-07	1，00
R593-Del294	2,04E-07	0,93
			R593-256N／378A／383N／434Y	4,20E-08	4,52
R593-256N／294Del／378A／383N／434Y	4,23E-09	44,92
			R593-259I／315D／434Y	2,04E-08	9,31
R593-259I／294Del／315D／434Y	2,02E-08	9，41

V功能表征

IV.1材料与方法

IV.1.1抗原结合

将2x105细胞(RhD⁺红细胞或Raji)与100μl的不同浓度的抗体(终浓度0至100μl／ml)在4℃孵育30分钟。

洗涤后，用与藻红蛋白偶联的山羊抗人Fcγ(100μl1：100的稀释物)在4℃显现mAb30分钟。洗细胞并用流式细胞仪(FC500，Beckman Coulter)研究。

IV.1.2ADCC测定抗RhD⁺

从单核细胞级分制备淋巴细胞，所述单核细胞级分通过在Ficoll.PackPlus(Pharmacia)上的密度梯度离心获得自3个个体的血沉棕黄层(buffycoat)。通过离心(190g，15分钟)去除血小板，并在NH4Cl中裂解剩余细胞。通过在37℃在IMDM／FCS25％中2次连续粘附(2X30分钟)于塑料组织培养瓶消耗单核细胞。单核细胞的最终百分比应低于总细胞计数的15％。在以8x10⁷细胞／ml重悬于IMDM之前洗未粘附的淋巴细胞。用

(1mg／ml)处理10分钟来自治疗浓缩物的红细胞(O组，Rh+)，然后用盐溶液洗3次，之后以4x10⁷细胞／ml重悬于IMDM中。在IMDM中将来自治疗剂IV Ig(Tégéline，LFB)的人免疫球蛋白溶液稀释为2和10mg／ml。在96孔微滴定板(NUNC)中进行测定。在湿润的、CO2％富集的大气下在37℃孵育16小时培养物上清或纯化的抗D抗体(100μl，200ng／ml在含有0.5％FCS的IMDM中)，效应细胞(25μl)，红细胞(25μl)和人免疫球蛋白(50μl)。对于测试的每种样品，包括由IMDM替换效应细胞悬液组成的非特异性释放。在离心板后，每孔收集60μl上清，然后与60μl2,7-芴二氨基(DAF，Sigma)混合。5分钟后在620nm处测量OD。使用校准曲线评估裂解百分比，校准曲线用分别对应100，75，50，25和0％裂解的裂解的红细胞的多个稀释物(NH4Cl)重构。

IV.1.3ADCC测定抗CD20

从单核细胞级分制备淋巴细胞，所述单核细胞级分通过在Ficoll PackPlus(Pharmacia)上的密度梯度离心获得自1个个体的血沉棕黄层。通过离心(190g，15分钟)去除血小板，并在NH4C1中裂解剩余的红细胞。使用阴性选择分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)纯化NK细胞。纯化的细胞至少90％为CD56+的。用PE缀合的抗CD14，抗CD3或抗CD19抗体对少于3％的细胞进行染色。如以前描述地测定FcγRIIIA多态性(Dall′Ozzo等人，2003)。在补充了10％FCS，2mmol／1L-谷氨酰胺，和1mmol／l丙酮酸钠的RPMI-1640(完全培养基)中培养Raji成淋巴细胞样B细胞(靶)。在存在单克隆抗体(范围从500-5ng／ml)时，以15／1的效应细胞-靶(E／T)比例混合靶细胞和NK细胞。通过荧光测定法(Roche AppliedSciences Cytotoxicity Detection Kit réf11644793001)，使用微板荧光分光计(Tecan，Mannedorf-Zurich，瑞士)测量上清中LDH的释放。以任意光密度或荧光单位(AFU)表示数据，并根据以下公式计算百分比裂解：％裂解=100x(ER-SR)／(MR-SR)，其中ER，SR，和MR分别代表实验的、自发的，和最大释放。将ADCC值表示为：％ADCC=(在存在mAb时的％裂解)-(没有mAb时的％裂解)。

IV.1.4CDC测定

在存在作为补体来源的幼兔血清时(1／10稀释)用浓度增加的抗AMHRII抗体(0至2500ng／ml)孵育靶ASC-1细胞系。在37℃孵育1小时后，通过荧光测定法(Roche Applied Sciences Cytotoxicity Detection Kit ref11644793001)测量裂解的靶细胞在上清中释放的LDH的量并用于计算由不同抗体介导的补体依赖性细胞毒性百分比。根据以下公式计算百分比裂解：％裂解=ER-SA，其中ER是实验应答，SA是当在存在补体而没有抗体时孵育靶细胞得到的自发活性。将结果表示为裂解百分比作为抗体浓度的函数。使用PRISM软件计算Emax(最大裂解百分比)和EC50(诱导50％最大裂解的抗体量)。

抗原识别测试显示，在野生型(wt)或在变体亲本抗RhD⁺IgG1中引入Del294突变不影响得到的IgG1变体的抗原结合性能。事实上如在下表6中所示，所有抗RhD⁺(R593)IgG变体结合RhD⁺RBC(红细胞)。

表6：抗RhD⁺IgG1wt(R593)和变体与表达RhD⁺抗原的RBC的结合

	Ag结合
		抗RhD+IgG1变体	MFI(任意单位)
T256N/A378V/S383N/N434Y	49,6
		V259I／N315D／N434Y	47,2
E294Del	52,6
		E294Del/T256N/A378V/S383N/N434Y	44,7
E294Del／V259I／N315D／N434Y	47,9
		R593	31,7

此外，与259I／294DeL/315D／434Y和256N／294Del／378V／383N／434Y和294Del变体对Fcγ受体的非常低的亲和力一致，相比R593或亲本变体IgG所述变体不显示ADCC活性，如在表7中所示。

表7：抗RhD⁺294Del变体不展示ADCC活性。如在IV.1.2中估计的，在存在抗CD20变体和wt时诱导靶细胞50％裂解的半最大有效浓度(EC50，ng／ml)和最大靶细胞裂解百分比。

研究还显示(见下表8)，引入Del294突变不影响wt抗CD20(R603)IgG1或V259I／N315D/N434Y抗CD20(R603)IgG1变体与CD20抗原的结合。

表8：抗CD20IgG1wt(R603)和R603_259I／315D／434Y，R603_259I／294Del/315D／434Y和R603_294Del IgG变体与表达CD20抗原的Raji成淋巴细胞样B细胞的结合。

	Ag结合
		抗CD20IgG1变体	MFI(任意单位)
Fcwt	123
		V259I／N315D／N434Y	137
E294Del	126
		E294Del／V259I／N315D／N434Y	96

如预期地，鉴于R603_259I/294Del/315D／434Y和R603_294Del IgG变体与C1q蛋白和Fcγ受体的非常低的亲和力，相比R603或亲本变体IgG，所述变体既不展示ADCC活性又不展示CDC活性，如在下表9和10中所示。

表9：抗CD20294Del变体不展示ADCC活性。如在IV.1.3中估计的，在存在抗CD20变体和wt时诱导靶细胞50％裂解的半最大有效浓度(EC50，ng／ml)和最大靶细胞裂解百分比。

表10：抗CD20294Del变体不展示CDC活性。如在IV.1.4中估计的，在存在抗CD20变体和wt时诱导靶细胞50％裂解的半最大有效浓度(EC50，ng／ml)和最大靶细胞裂解百分比。

	CDC
		抗CD20IgG1变体	EC50(ng／ml)
Fcwt	464
		V259I／N315D／N434Y	410
E294Del	NA
		E294Del/V259I／N315D／N434Y	NA

表11：在序列表中引用的序列

Claims (14)

1.生产包含Fc区的亲本多肽的变体的方法，所述变体展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和／或与至少一种受体FcγR的结合，其中在亲本多肽的Fc区中引入氨基酸修饰，所述氨基酸修饰选自由下述组成的组：

(i)294Del，其中所述氨基酸修饰294del是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰，

(ii)293Del，和

(iii)293Del／294Del，

Fc区中的氨基酸的编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。

2.根据权利要求1的方法，其中氨基酸修饰293Del是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰。

3.根据权利要求1的方法，其中氨基酸修饰del293／del294是引入亲本多肽的Fc区中的唯一氨基酸修饰。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中亲本多肽的Fc区是IgGFc区，所述IgG Fc区选自由SEQ ID NO：1的Fc区，SEQ ID NO：2的Fc区，SEQ ID NO：3的Fc区和SEQ ID NO：4的Fc区及其片段组成的组。

5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中亲本多肽的Fc区是包含氨基酸修饰的野生型IgG Fc区的变体，所述氨基酸修饰选自由434Y，378V，259I／315D／434Y和256N／378V／383N／434Y组成的组。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中变体选自由Fc融合蛋白、Fc缀合物和抗体组成的组。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中在亲本多肽的Fc区中引入所述氨基酸修饰的步骤包括：

(i)提供编码亲本多肽的核酸，

(ii)修饰在步骤(i)中提供的核酸以得到编码所述变体的核酸，和

(iii)在宿主细胞中表达在步骤(ii)中得到的核酸并回收所述变体。

8.包含Fc区的亲本多肽的变体，所述变体由如在权利要求1至8的任一项中定义的方法得到，且展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合。

9.根据权利要求8的变体，其中变体是针对靶分子的中和抗体，所述靶分子选自由膜受体，人可溶性蛋白质，毒素，病毒、细菌和真菌蛋白质组成的组。

10.分离的核酸，其编码如在权利要求8至9的任一项中定义的变体。

11.载体，其包含权利要求10的核酸。

12.宿主细胞，其含有权利要求11的载体。

13.亲本多肽变体，其用于预防或治疗病理学病况，所述病理学病况中不希望诱导ADCC和／或CDC应答，所述变体包含Fc区，展示出相比所述亲本多肽降低的与蛋白质C1q和与至少一种受体FcγR的结合，且相比其多肽亲本的Fc区在其Fc区中包含选自294Del，293Del和293Del／294Del的氨基酸修饰，附带条件是亲本多肽的所述变体不在于294Del／T307P／N434Y或293Del／T307P／N434Y变体，在Fc区中的氨基酸编号指根据EU索引，或在Kabat中的等同物的编号。

14.药物组合物，其包含如在权利要求8，9或13的任一项中定义的变体。

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