CN103820338B

CN103820338B - 一种用于发酵高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌及其应用

Info

Publication number: CN103820338B
Application number: CN201410058491.5A
Authority: CN
Inventors: 陈晓春; 黄小权; 蔡家栋; 张磊; 盛兵; 汤亦文; 陈勇
Original assignee: NANJING BIO TOGETHER CO Ltd
Current assignee: NANJING BIO TOGETHER CO Ltd
Priority date: 2014-02-20
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-02-20
Also published as: CN103820338A

Abstract

本发明公开了一种用于发酵高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌，其分类命名为产朊假丝酵母（Candida？utilis），菌株号为TKZY-05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.7521，保藏日期为2013年04月26日。本发明还公开了上述产朊假丝酵母菌的应用。本发明的产朊假丝酵母菌TKZY-05菌体RNA含量可达到菌体干重的17%，比出发菌株的RNA产量提高了10%。该菌株经过10代以上传代，生产核糖核酸的性能保持稳定。

Description

一种用于发酵高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌及其应用。

背景技术

核糖核酸（Ribonucleicacid，简称RNA）是一类极为重要的生物大分子物质，属于两大类核酸之一。RNA及其降解物在农业生产、饲料工业等行业都有着重要的作用。近些年研究表明，RNA的降解产物核苷酸能提高植物根系吸收能力、促进代谢、加强CO₂的固定能力、促进光合作用，其可提高种子内含物的转化效率、出苗率以及促进植物根系的生长。适期施用核苷酸，能使农作物早熟、优质、增产，因此核苷酸可作为植物生长调节剂用于农作物的生产。由于核苷酸可提高动物对细菌、真菌感染的抵抗力、增加免疫力等作用，在水产和畜牧生产中核苷酸可明显提高饲料利用率，具有促进动物生长和改善肉质的明显作用。核苷酸在植物生长调节剂和饲料添加剂领域的应用将是一个崭新的巨大的市场，具有广阔的应用。

目前，工业上都是通过微生物发酵法生产RNA。20世纪60年代，日本开始研究通过培养富含RNA的酵母来生产RNA，经过不断改进培养方法，目前酵母发酵生产RNA的工艺已相当成熟。盛建国等（食品工业科技，2007，28(1)：140-142）分别以原糖液、糖化液和废糖蜜作为碳源培养热带假丝酵母K-79株，发现以原糖液为碳源时RNA含量最高为8.6%。在一些发酵液和其他生产废液、废渣中通常有一些富含RNA的菌体，如从啤酒酵母和味精生产废液中的菌体中可提取RNA产品。

离子注入技术作为一种生物品种改良的新技术已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物诱变育种的研究中，离子注入已广泛用于对微生物菌种的诱变育种，并取得了良好效果。

本发明拟通过离子束诱变技术对产朊假丝酵母菌株进行筛选，以得到传代稳定，高含核糖核酸的菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述产朊假丝酵母菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种用于发酵高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌，其分类命名为产朊假丝酵母（Candidautilis），菌株号为TKZY-05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.7521，保藏日期为2013年04月26日。该菌株是通过对土壤筛选到的产朊假丝酵母菌进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于平板培养基中培养，挑选单菌落转接于麦芽汁斜面培养，后经含碳源、氮源、无机盐和水的液体种子培养基和发酵培养基培养从而筛选出的核糖核酸高产菌。

CGMCCNo.7521菌株具有下述性质：

1、菌落形态学特征：

细胞呈圆形、椭圆形或腊肠形，大小为（3.5～4.5）μm×（7～13）μm。液体培养不产醭，管底有菌体沉淀。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状。在加盖片的玉米粉琼脂培养基上，形成原始假菌丝或不发达的假菌丝，或无假菌丝。

2、生理与生化特性：

菌株典型的兼性厌氧型单细胞真菌。在有氧的情况下，它进行有氧呼吸，排出二氧化碳；而在缺氧的条件下，其进行无氧呼吸，分解有机物（主要是葡萄糖），产生酒精和水；该菌的最佳生长温度为32℃，最适pH值为4.0。

3、营养特征：

该菌能利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸盐。

上述产朊假丝酵母菌在发酵生产核糖核酸中的应用。

具体应用方法为，将产朊假丝酵母菌CGMCCNo.7521先经种子培养，再经发酵培养，制备核糖核酸。

其中，所述的种子培养，液体种子培养基配方如下：溶剂水，碳源1～300g/L，氮源1～100g/L，无机盐0.01～100g/L。优选的配方是，溶剂水，碳源10～60g/L，氮源10～30g/L，无机盐0.1～10g/L。更优选的配方是，溶剂水，碳源10～60g/L，氮源10～30g/L，无机盐0.6～1.6g/L。

其中，所述的发酵培养，液体发酵培养基配方如下：溶剂水，碳源1～500g/L，氮源1～10g/L，磷酸0.1～5ml/L，无机盐0.01～10g/L。优选的配方是，溶剂水，碳源10～60g/L，氮源2～5g/L，磷酸0.66～2ml/L，无机盐0.55～2.4g/L。更优选的配方是，溶剂水，碳源30～47g/L，氮源3～4g/L，磷酸1.3～2ml/L，无机盐1～1.5g/L。

其中，所述的碳源选自糖蜜、葡萄糖、甘油、麦芽糖和蔗糖中的任意一种或多种。

其中，所述的氮源选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素和硫酸铵中的任意一种或多种。

其中，所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、盐酸盐和硫酸盐中的任意一种或多种。

其中，所述液体发酵培养基的初始pH为2.5～9.5。优选的pH为4～6；进一步优选的pH为4～5。该pH调节可采用氨水进行。

其中，发酵培养的温度为29～40℃，优选为30～33℃；发酵培养的时间为12～20小时，优选为16～18小时。

发酵培养前按照体积比为1～30:100，优选为8～12:100的接种量接种。

本发明的有益效果包括：

1.与传统的辐射法及化学诱变剂相比，离子束诱变具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定、易于获得理想新品种等特点。

2.本发明的核糖核酸高产菌产朊假丝酵母菌TKZY-05（CGMCCNo.7521）能够利用多种碳源和氮源发酵生产核糖核酸，操作方便简单。具有高产性状稳定的特点，该菌株经过10代以上传代，生产核糖核酸的性能保持稳定。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

以从实验室分离得到的产核糖核酸的菌株为出发菌株，将经N⁺离子束诱变(低能离子注入机靶室内真空度为2×10^－4，注入能量为50kev，剂量为5×10¹³ions·cm^-2·s^-1)后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取0.1ml涂布于麦芽汁平板培养基上30℃下培养3天，从中挑选单菌落在麦芽汁斜面培养3天。转接一环于装有30mL液体种子培养基（糖蜜30g/L，硫酸铵10g/L，酵母膏20g/L，氯化钾1.5g/L，NaCl0.1g/L，pH4.0）的500mL摇瓶中，于32℃下110rpm摇床培养24小时。再转接10mL于装有100mL液体发酵培养基（糖蜜45g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，H₃PO₄0.7ml/L，MgSO₄0.5g/L，FeSO₄0.05g/L，用氨水将培养基pH调节为4.0）的500mL摇瓶中，于32℃下240rpm摇床发酵培养16小时。经过初筛，得到100株比出发菌株产量高的突变株。用同样的条件下进行复筛，最终得到产量最高的菌株TKZY-05，菌体RNA含量可达到菌体干重的13.5%，比原始菌株的7%提高了6.5%。

实施例2：

将菌株TKZY-05从麦芽汁斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基（糖蜜10g/L，硫酸铵5g/L，酵母膏10g/L，氯化钾0.1g/L，NaCl0.5g/L，pH4.0）的500mL摇瓶中，于33℃下110rpm摇床培养24小时。转接8mL于装有100mL液体发酵培养基（糖蜜50g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L，H₃PO₄0.8ml/L，MgSO₄0.2g/L，FeSO₄2.0g/L，用氨水将培养基pH调节为5.0）的500mL摇瓶中，于30℃下240rpm摇床发酵培养16小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的17%。

实施例3：

将菌株TKZY-05从麦芽汁斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基（葡萄糖15g/L，硫酸铵15g/L，玉米浆30g/L，氯化钾6g/L，NaCl8g/L，pH6.0）的500mL摇瓶中，于31℃下110rpm摇床培养24小时。转接10mL于装有100mL液体发酵培养基（麦芽糖40g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，H₃PO₄1ml/L，MgSO₄0.8g/L，FeSO₄1.6g/L，用氨水将培养基pH调节为5.0）的500mL摇瓶中，于32℃下240rpm摇床发酵培养17小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的15%。

实施例4：

将菌株TKZY-05从麦芽汁斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基（甘油40g/L，硫酸铵30g/L，尿素20g/L，氯化钾10g/L，NaCl5g/L，pH4.0）的500mL摇瓶中，于30℃下110rpm摇床培养24小时。转接12mL于装有100mL液体发酵培养基（蔗糖30g/L，(NH₄)₂SO₄4g/L，H₃PO₄1.5ml/L，MgSO₄1.5g/L，FeSO₄0.8g/L，用氨水将培养基pH调节为4.0）的500mL摇瓶中，于32℃下240rpm摇床发酵培养18小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的17.5%。

实施例5：

将菌株TKZY-05从麦芽汁斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基（麦芽糖40g/L，硫酸铵30g/L，蛋白胨30g/L，氯化钾10g/L，NaCl5g/L，pH6.0）的500mL摇瓶中，于33℃下110rpm摇床培养24小时。转接12mL于装有100mL液体发酵培养基（葡萄糖10g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，H₃PO₄2ml/L，MgSO₄2g/L，FeSO₄0.2g/L，用氨水将培养基pH调节为5.0）的500mL摇瓶中，于33℃下240rpm摇床发酵培养18小时。菌体RNA含量可达到菌体干重的15%。

实施例6：

将菌株TKZY-05连续传10代以上，在实施例2的培养条件下进行发酵培养，生产核糖核酸。结果表明（见表1，2和3），连续10代以上遗传培养，菌株TKZY-05生产核糖核酸的性能稳定。

表1连续传1～5代的菌株TKZY-05的生产核糖核酸性能

表2连续传6～10代的菌株TKZY-05的生产核糖核酸性能

表312代、15代、18代、20代的菌株TKZY-05的生产核糖核酸性能

Claims

1.一种用于发酵高产核糖核酸的产朊假丝酵母菌，其分类命名为产朊假丝酵母(Candidautilis)，菌株号为TKZY-05，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7521，保藏日期为2013年04月26日。

2.权利要求1所述的产朊假丝酵母菌在发酵生产核糖核酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将产朊假丝酵母菌CGMCCNo.7521先经种子培养，再经发酵培养，制备核糖核酸。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的种子培养，其中，液体种子培养基配方如下：溶剂水，碳源1～300g/L，氮源1～100g/L，无机盐0.01～100g/L；其中，所述的碳源选自糖蜜、葡萄糖、甘油、麦芽糖和蔗糖中的任意一种或多种；所述的氮源选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素和硫酸铵中的任意一种或多种；所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、盐酸盐和硫酸盐中的任意一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养，其中，液体发酵培养基配方如下：溶剂水，碳源1～500g/L，氮源1～10g/L，磷酸0.1～5ml/L，无机盐0.01～10g/L；其中，所述的碳源选自糖蜜、葡萄糖、甘油、麦芽糖和蔗糖中的任意一种或多种；所述的氮源选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、尿素和硫酸铵中的任意一种或多种；所述无机盐选自钾盐、钠盐、镁盐、铁盐、盐酸盐和硫酸盐中的任意一种或多种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基的初始pH为2.5～9.5。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的温度为29～40℃，发酵培养的时间为12～20小时。