CN103820306B - 快速实时dna扩增仪及基因突变检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速实时DNA扩增仪及基因突变检测方法，快速实时DNA扩增仪包括试剂槽和热循环系统，所述试剂槽上具有至少一个用于放置反应管的插孔，所述热循环系统包括发热体和散热器，所述发热体和散热器分布于试剂槽的两侧，并且发热体和散热器能够在驱动机构的带动下交替靠近或远离试剂槽。本发明的快速实时DNA扩增仪通过控制发热体和散热器到试剂槽的距离来实现对试剂的快速升降温，这种设计不仅结构简单，而且可以帮助试剂更快地达到设定温度点，实现快速热循环，同时本发明的基因突变检测方法从取样到成功辨识单核苷酸突变只需要50分钟，而市面上的同类仪器普遍需要2-3小时，大大提高了基因突变的检测效率。

Description

快速实时DNA扩增仪及基因突变检测方法

技术领域

本发明涉及一种快速实时DNA扩增仪及通过该扩增仪进行基因突变检测的方法。

背景技术

在分子生物学领域，PCR 反应是常用的实验技术，PCR 反应即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温重组及适温延伸组成一个周期，重复循环该周期，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。

DNA扩增仪是一种用于进行PCR扩增反应的仪器，在热循环过程中，为了保持加热和冷却的均匀性，仪器的升降温梯度只有0.5-4℃/s，不能在短时间内稳定、快速的调节温度，效率非常低；公开号为US5525300、US5779981和US6054263的专利是运用机械手臂将具有多个纵向插孔的试剂槽来回移动至不同的恒温模块中，以实现DNA从高温变性到低温重组的热循环，而目前市场上以加热块为基础的PCR仪都需要以类似方式来实现DNA从高温变性到低温重组的热循环，而机械手臂的精确移动要求过高，设计条件十分苛刻，并且来回移动的过程会增加热循环的时间，使其不能在短时间内实现快速热循环；公开号为US6174670和US5455175的专利虽然可以实现相对高速的热循环，但由于技术利用了加热块对PCR反应管的高表面积与体积比来达到对试剂的快速梯度升温，所以只有特殊设计的毛细管才能与之搭配使用，而毛细管体积过小，不能运用于对DNA样本的单核苷酸变异分析，而且在通过常规腮膜拭取样后，很难将获取的DNA样本添加到PCR反应管中。

在进行基因突变的检测时，需要采用荧光标记物对野生型基因和突变型基因进行标记，市面上大量使用的荧光标记物有荧光染料和荧光探针两种，其中，荧光染料（如SYBR Green，即核苷酸胶体染料）会嵌入双链DNA进行荧光标记，荧光探针会与互补的基因序列杂合。检测时，通过特定波长的光来激发荧光染料或荧光探针发出的荧光，DNA在经过热循环后会不断被复制，荧光的强度会发生变化，而荧光的强度与DNA扩增量成正比。

发明内容

本发明的目的之一在于弥补现有技术不能快速实现热循环、结构复杂等缺陷，提供一种能够快速实现热循环且结构简单的快速实时DNA扩增仪。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种快速实时DNA扩增仪，其特征在于，包括试剂槽和热循环系统，所述试剂槽上具有至少一个用于放置反应管的插孔，所述热循环系统包括发热体和散热器，所述发热体和散热器分布于试剂槽的两侧，并且发热体和散热器能够在驱动机构的带动下交替靠近或远离试剂槽。

进一步，所述发热体内设置有能够产生热量的电加热棒，电加热棒的热量能够传递到发热体上，并且发热体能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽并且贴紧在试剂槽的一个侧面上；所述散热器包括散热块和散热风扇，所述散热块背离试剂槽的侧面上具有若干块散热鳍片，所述散热风扇固定在散热鳍片上，并且散热块能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽并且贴紧在试剂槽的另一侧面上。

进一步，所述发热体和散热器通过连接机构连接为一体，所述驱动机构包括步进电机、螺纹杆套和平行拉杆，所述螺纹杆套套在步进电机的丝杆上，并且螺纹杆套的内部具有与丝杆相匹配的内螺纹；所述平行拉杆的中部具有能够使步进电机的丝杆穿过的穿孔，步进电机的丝杆由平行拉杆中部的穿孔伸出；螺纹杆套与平行拉杆之间相互连接起来，平行拉杆固定在连接机构上。

进一步，还包括基板，所述试剂槽设置在基板上，基板上具有与所述插孔位置对应的缺口，反应管能够通过该缺口安装到试剂槽的插孔中；基板上设置有两条相互对应的直线滑轨，两条滑轨分布于基板的两侧；所述滑轨由固定构件和滑动构件组成，所述固定构件固定在基板上，所述滑动构件设置在固定构件上并能够沿固定构件的长度方向滑动；滑动构件上设置有呈直角形的角架，所述角架的水平面固定在滑动构件上，角架的垂直面固定在连接机构上。

进一步，所述连接机构包括两个连接座，两个连接座分布于发热体和散热器的两侧，并将发热体和散热器连接起来；所述平行拉杆为矩形块，平行拉杆的两端分别固定在两个连接座上，并且平行拉杆与发热体平行。

进一步，还包括温度控制系统，所述温度控制系统包括单片机、热电偶I和两个热电偶II，所述热电偶I设置在发热体内，用于检测发热体的温度，热电偶I将发热体的温度实时反馈给单片机，单片机根据热电偶I反馈的温度信号来控制发热体保持设定温度；两个热电偶II分别设置在试剂槽的两端，用于检测试剂槽两端的温度，两个热电偶II将试剂槽两端的温度实时反馈给单片机，单片机根据两个热电偶II反馈的温度信号来控制步进电机运动，步进电机通过连接机构带动发热体和散热器移动，从而调节发热体和散热器到试剂槽的距离，使试剂温度达到并保持设定温度。

进一步，还包括荧光探测系统，所述荧光探测系统包括LED灯和摄像头，所述试剂槽的侧面具有与插孔连通的通光孔，LED灯发出的光线经过滤片过滤成能够激发荧光的特定波长的光线，该光线能够通过通光孔照射到透明的反应管中以激发基因探针发出的荧光；所述单片机与LED灯连接，用于对LED灯发出的灯光亮度进行调节；所述插孔为将试剂槽贯穿的通孔，摄像头位于试剂槽的下方，用于对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录，并将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，并生成拟合曲线。

本发明的DNA实时扩增仪具有如下优点：

1、本发明通过控制发热体和散热器到试剂槽的距离来实现对试剂的快速升降温，这种设计不仅结构简单，而且可以帮助试剂更快地达到设定温度点，实现快速热循环，同时还可以有助于缩短基因检测的时间。

2、本发明通过热电偶来间接测量试剂的温度，并将检测的温度信号反馈到单片机，单片机控制步进电机运动，步进电机带动发热体和散热器移动，从而调节发热体和散热器到试剂槽的距离，进而实现对试剂温度的精确控制。

3、本发明在试剂槽的侧面设置通光孔，LED灯发出特定波长的光通过通光孔照射到反应管中以激活基因标记物发出的荧光，而目前多数PCR仪器都是从顶部发射LED光来激活荧光，而且发出的荧光又需要被反射到顶部进行探测和采集。因此本发明相比现有仪器而言，设计更加合理，更利于降低仪器的纵向体积和重量，提高仪器的移动灵活性，打破了检测地点的限制（目前国内的基因检测设备可移动性较差，需要把样本送到指定的检测中心或医院，病人等待的时间很长）。

本发明的目的之二在于提供一种基因突变检测方法，包括步骤如下：

S1-取样：首先通过带有腮膜拭取样头的腮膜拭连接器来获取含有DNA的样本，然后将腮膜拭取样头插入反应管中，腮膜拭取样头将反应管密封并与反应管中的DNA扩增试剂接触，最后再将反应管从腮膜拭连接器上取下并放入试剂槽的插孔中；

S2-热循环：启动程序使发热体靠近试剂槽，将反应管中的试剂预热至95℃，并恒温保持2min；然后进行热循环，热循环的过程是将试剂加热至95℃，恒温保持2s，再将试剂冷却至56℃，恒温保持30s，如此循环35-50次；

S3-荧光探测：DNA扩增试剂内含有两种基因探针，一种基因探针能够与野生型基因杂合，另一种基因探针能够与突变型基因杂合，两种基因探针在与不同的基因杂合后能够被激发释放出两种不同波段的荧光；在每个热循环的尾期，LED灯发光激发反应管中基因探针发出的荧光，摄像头对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录；

S4-拟合曲线分析：DNA在经过热循环后不断被复制，此时基因探针与越来越多的互补基因序列杂合，导致释放的荧光强度随DNA扩增片段的数量成正比增加，摄像头将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，计算出每次热循环后野生型基因和突变型基因的荧光值，并根据每次热循环后荧光值的变化生成两条拟合曲线，两条拟合曲线用于判断DNA样本中是否含有野生型基因和/或突变型基因。

进一步，所述反应管采用透明材料制成，反应管为上端带有开口、下端封闭的管状结构；所述腮膜拭取样头呈柱状，腮膜拭取样头能够插入反应管中将反应管密封，并且腮膜拭取样头能够与反应管中的DNA扩增试剂接触。

进一步，所述反应管采用聚丙烯制成，并且反应管的底部为平面；所述腮膜拭取样头采用热塑性橡胶制成，并且腮膜拭取样头的底部带有皮纹。

本发明的基因突变检测方法具有如下优点：

1、本方法在配合本申请人研制的检测试剂的情况下，采用本申请人研制的这种仪器从取样到成功辨识单核苷酸突变只需要50分钟，而市面上的同类仪器普遍需要2-3小时，这样就大大提高了基因突变的检测效率。

2、本方法通过带有腮膜拭取样头的腮膜拭连接器来进行取样，然后将腮膜拭取样头插入反应管中将反应管密封，同时腮膜拭取样头与反应管中的DNA扩增试剂接触；而传统的取样方式是首先通过腮膜拭进行取样，然后再将取样头截下（取样头的截取需要借助专用工具），并对DNA样本进行提纯处理，最后再将纯化的DNA样本放入反应管中进行分析；两者比较，本方法不仅操作方便，节约了大量的时间，降低了实验设备限制和操作人员的技术要求，而且还能够有效避免样本受到污染。

3、由于腮膜拭取样头深入反应管中，因此在进行加热时，腮膜拭取样头靠近试剂的部分随试剂同时被加热，避免了水蒸气在腮膜拭取样头上凝结，减少了反应液的损失。

附图说明    

图1为本发明快速实时DNA扩增仪的剖面图；

图2为本发明快速实时DNA扩增仪的俯视图；

图3为本发明快速实时DNA扩增仪的立体图；

图4为本发明中试剂槽的立体图；

图5为本发明中试剂槽的俯视图；

图6为图5中A-A线的剖面图；

图7为本发明中反应管的主视图；

图8为图7中B-B线的剖面图；

图9为本发明中腮膜拭连接器的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

参见图1至图9，一种快速实时DNA扩增仪，包括基板1、试剂槽2和热循环系统，其中，试剂槽2的两端通过螺钉固定在基板1上，试剂槽2上具有用于放置反应管的插孔2a，基板1上具有与插孔2a位置对应的缺口，反应管能够通过该缺口安装到试剂槽2的插孔2a中；热循环系统包括发热体3和散热器，发热体3和散热器分布于试剂槽2的两侧，并且发热体3和散热器能够在驱动机构的带动下交替靠近或远离试剂槽2。在本实施例中，试剂槽2上具有十二个插孔，基板1上具有方形孔，操作者能够通过该方形孔向十二个插孔内放置反应管；发热体3内设置有能够产生热量的电加热棒4，电加热棒4的两端通过导线连接电源，电加热棒4通电产生热量，并且产生的热量能够传递到发热体3上，发热体3能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽2并且贴紧在试剂槽2的一个侧面上；散热器包括散热块5和散热风扇6，散热块5背离试剂槽的侧面上具有若干块散热鳍片，散热风扇6固定在散热鳍片上，散热块5能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽2并且贴紧在试剂槽2的另一侧面上。

本发明的DNA扩增仪还包括用于将发热体3和散热器连接起来的连接机构，基板1上设置有两条相互对应的直线滑轨7，两条滑轨7分布于基板1的两侧；滑轨7由固定构件和滑动构件组成，固定构件固定在基板1上，滑动构件设置在固定构件上并能够沿固定构件的长度方向滑动；滑动构件上设置有呈直角形的角架8，角架8的水平面固定在滑动构件上，角架8的垂直面固定在连接机构上。在本实施例中，滑轨7采用滚珠轴承式，这样可以大大降低固定构件和滑动构件的摩擦，提高滑轨的使用寿命和控制精度；连接机构包括两个连接座9和一个紧固连接座10，两个连接座9分布于发热体3的两侧，用于将发热体3和散热器连接为一体，起下紧固作用；紧固连接座10设置在发热体3上，用于将发热体3和散热器连接为一体，起上紧固作用。本发明通过连接机构将发热体3和散热器连接为一体，从而实现发热体3和散热器的联动，这样就不需要通过两个步进电机来分别带动发热体和散热器运动，简化了结构，降低了仪器的制造成本。

作为优选，驱动机构包括步进电机11、螺纹杆套12和平行拉杆13，螺纹杆套12套在步进电机11的丝杆上，并且螺纹杆套12的内部具有与丝杆相匹配的内螺纹；平行拉杆13的中部具有能够使步进电机11的丝杆穿过的穿孔，步进电机11的丝杆由平行拉杆13中部的穿孔伸出；螺纹杆套12与平行拉杆13之间通过螺钉连接起来，平行拉杆13为矩形块，平行拉杆13的两端通过螺钉分别固定在两个连接座9上。在本实施例中，基板1上设置有电机卡座20，电机卡座20呈T字型，其水平面通过螺钉固定在基板1上，步进电机11固定在电机卡座20的垂直面上，电机卡座20的垂直面上具有能够使丝杆穿出的穿孔。

工作时，步进电机11的丝杆转动，丝杆带动螺纹杆套12运动，螺纹杆套12带动平行拉杆13运动，平行拉杆13通过两个连接座9来带动发热体3和散热器运动，当发热体3靠近贴合试剂槽2时，散热器则远离试剂槽2；当散热器靠近贴合试剂槽2时，发热体3则远离试剂槽2，这样就实现了热循环。为了使发热体3和散热器与试剂槽2的侧面能够紧密贴合，保证试剂槽2两端的孔位温度误差较小，平行拉杆13与发热体3保持平行。

作为优选，本发明的DNA扩增仪还包括温度控制系统，温度控制系统包括单片机15、热电偶I和两个热电偶II，其中，单片机15设置在电路板14上，热电偶I设置在发热体3内，用于检测发热体3的温度，热电偶I将发热体3的温度实时反馈给单片机15，单片机15根据热电偶I反馈的温度信号来控制电加热棒4的发热量，使发热体3保持设定温度，在本实施例中，发热体3的设定温度为130℃；两个热电偶II分别设置在试剂槽2的两端，用于检测试剂槽2两端的温度，由于两个温度测量点将试剂槽2上的十二个插孔2a的圆心串连起来，并且发热体3的加热面、散热块5的散热面分别与试剂槽2的两个侧面平行，因此两个温度测量点构成的直线上每个点的区域温度相同，热电偶II检测的温度可视作插孔2a的中心温度，而插孔2a的中心温度即反应管中的试剂温度，因此热电偶II实际是间接检测试剂的温度；两个热电偶II将检测的温度实时反馈给单片机15，单片机15根据两个热电偶II反馈的温度信号来控制步进电机11运动，步进电机通过连接机构带动发热体3和散热器移动，从而调节发热体3和散热器到试剂槽的距离，进而使反应管中的试剂达到并保持设定温度，在本实施例中，试剂的设定温度为95℃和56℃。为了准确控制试剂的温度，单片机15中内置有史密斯预估补偿法，此种算法根据步进电机的丝杆转动一圈能够使发热体和散热器移动相应距离来调节试剂温度，而发热体和散热器移动移动相应距离试剂温度变化多少可根据实验数据分析得出，如步进电机的丝杆转动一圈，能够使发热体向靠近试剂槽的方向移动0.061mm，能够使散热器向远离试剂槽的方向移动0.061mm，此时试剂温度升高0.15℃，单片机15可通过这种算法来对步进电机11进行精确控制，从而准确调节发热体和散热器到试剂槽的距离，实现对试剂温度的精确控制。

作为优选，本发明的DNA扩增仪还包括荧光探测系统，荧光探测系统包括固定在基板1上的LED灯座17、设置在LED灯座17上的LED灯18和设置在电路板14上的摄像头16，试剂槽2的侧面具有与插孔2a连通的通光孔2b，LED灯发出的光线经过滤片过滤成能够激发荧光的特定波长的光线，该光线能够通过通光孔2b照射到透明的反应管中以激发基因探针发出的荧光；单片机15与LED灯18连接，用于对LED灯18发出的灯光亮度进行调节；插孔2a为将试剂槽2贯穿的通孔，摄像头16位于试剂槽2的下方，用于对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录，并将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，并生成拟合曲线。由于通光孔2b设置在试剂槽2的侧面，因此LED灯18发出的光通过试剂槽2侧面的通光孔2b照射到反应管中来激活荧光，此种设计有利于降低仪器的纵向体积和重量，提高仪器的移动灵活性。

当然，本发明的DNA扩增仪还可以设置外壳，DNA扩增仪的零部件设置在外壳内；在本实施例中，基板1通过螺钉固定在外壳顶部的内壁上，为了能够将反应管安装到试剂槽2的插孔2a中，外壳的顶部需要设置与插孔2a位置对应的缺口，同时外壳顶部的内壁上设置有四根向下延伸的连接柱19，连接柱19的底部具有螺纹孔，电路板14通过螺钉固定在四根连接柱19上。

一种采用上述DNA扩增仪进行基因突变检测的方法，步骤如下：

S1-取样：首先通过带有腮膜拭取样头的腮膜拭连接器来获取含有DNA的样本，然后将腮膜拭取样头插入反应管中，腮膜拭取样头将反应管密封并与反应管中的DNA扩增试剂接触，最后再将反应管从腮膜拭连接器上取下并放入试剂槽2的插孔2a中；

S2-热循环：启动程序使电加热棒4产生热量，电加热棒4产生的热量传递到发热体3上，使发热体3达到设定温度130℃，然后使发热体3靠近并贴合试剂槽2，此时发热体3的热量传递到试剂槽2上，将反应管中的试剂预热至95℃，并恒温保持2min；然后进行热循环，热循环的过程是将试剂加热至95℃，恒温保持2s，再将试剂冷却至56℃，恒温保持30s，如此循环35-50次； 

S3-荧光探测：DNA扩增试剂内含有两种基因探针，一种基因探针能够与野生型基因杂合，另一种基因探针能够与突变型基因杂合，两种基因探针在与不同的基因杂合后能够被激发释放出两种不同波段的荧光；在每个热循环的尾期，LED灯发光激发反应管中基因探针发出的荧光，摄像头对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录；

S4-拟合曲线分析：DNA在经过热循环后不断被复制，此时基因探针与越来越多的互补基因序列杂合，导致释放的荧光强度发生变化，摄像头将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，计算出每次热循环后野生型基因和突变型基因的荧光值，并根据每次热循环后荧光值的变化生成两条拟合曲线，操作者根据两条拟合曲线来判断DNA样本中是否含有野生型基因和/或突变型基因，由于两种基因探针发出的荧光不同，为了便于区分，因此两条拟合曲线的颜色不同。若在经过热循环后，只有野生型基因的荧光强度发生变化，则表明DNA样本中只含有野生型基因，没有突变型基因；若在经过热循环后，不仅野生型基因的荧光强度发生变化，而且突变型基因的荧光强度也发生变化，那么则表明DNA样本中既含有野生基因，也含有突变型基因；若在经过热循环后，只有突变型基因的荧光强度发生变化，则表明DNA样本中只含有突变型基因，没有野生型基因。

在PCR反应时，基因片段数以基数的循环数次方在增加（最终数量=初始数量^循环数），所以在经过少数几次热循环后荧光值的变化不够明显，不能辨别DNA样本中是否含有突变型基因，只有通过多次热循环进行大量复制后才能从荧光曲线上看出荧光值的变化；但是如果DNA样本中没有突变型基因，即便是经过无数次热循环，其荧光值也不会发生变化，同时随着热循环次数的增多也会增大基因检测的时间，影响基因检测的效率，因此本发明的DNA扩增仪的热循环次数优选为50次。经检验，本方法在配合本申请人研制的检测试剂的情况下，采用本申请人研制的这种仪器从取样到成功辨识单核苷酸突变只需要50分钟，而市面上的同类仪器普遍需要2-3小时，这样就大大提高了基因突变的检测效率。

作为优选，反应管100采用透明材料制成，并且反应管100为上端带有开口、下端封闭的管状结构；腮膜拭取样头200呈柱状，并且腮膜拭取样头200能够插入反应管100中将反应管100密封，同时由于腮膜拭取样头200深入反应管100内，因此在将腮膜拭取样头200插入反应管100内时，腮膜拭取样头200能够与反应管100内的DNA扩增试剂接触。在进行取样时，操作者可直接将腮膜拭取样头200放入人体开放腔（如口腔）中进行取样，取样完成后，将腮膜拭取样头200插入反应管100内，即可使实验样本与扩增试剂结合，这样就不需要在取样完成后将拭子的取样头截下后放入反应管中，不仅操作方便，而且还能够有效避免样本受外界污染；同时，由于腮膜拭取样头200深入反应管100内，因此在进行PCR反应时，腮膜拭取样头200靠近试剂的部分随试剂同时被加热，避免了水蒸气在管塞上凝结，减少了反应液的损失。

作为优选，反应管100采用聚丙烯制成，并且反应管100的底部为平面，腮膜拭取样头200采用热塑性橡胶制成，并且腮膜拭取样头200的底部带有皮纹200a。由于反应管100的底部为平面，采用这种合理的光学设计有助于减少荧光误差；同时腮膜拭取样头200底部带有细小且不规则的皮纹200a，这种设计相比平滑面设计而言，更有利于提取细胞样本，提高取样效率；反应管100采用聚丙烯制成，聚丙烯具有良好的耐酸碱性，能够防止反应管100被腐蚀，同时聚丙烯还具有良好的透光性，能够降低光的反射和折射，减少荧光误差；腮膜拭取样头200采用热塑性橡胶（简称TPR）制成，由于TPR具有橡胶的特性，这样当腮膜拭取样头200插入反应管100时，腮膜拭取样头200就会受到挤压发生变形，从而与反应管100的内壁之间形成密封，这样就能够避免在进行PCR反应时不必要的热量流失；另外由于TPR安全无毒，这样就能够将腮膜拭取样头200放入口腔进行取样。

作为优选，腮膜拭连接器包括外管302、中间管303和内管304，外管302和中间管303由内至外依次包裹在内管304上，并且三者的左端平齐；内管304的长度大于中间管303的长度，中间管303的长度大于外管304的长度，并且内管304的左端具有1厘米的切口。使用时，操作人员拿着带有腮膜拭取样头200的连接器，取下盖子301，然后对病人进行取样，盖子301用于防止腮膜拭取样头200受到外接污染。取样完成后，操作人员直接将取好样的腮膜拭取样头200插入反应管100中将反应管100密封，最后操作人员再将反应管100插入试剂槽2的插孔2a中，并取下连接器。这里取下连接器的方法很简单，其原理跟普通带有按钮的圆珠笔相同：按下内管304的右端，此时外管302和中间管303相对于内管304向右滑动，同时暴露出 内管304左端的缺口，轻轻掰动连接器，使切口扩大，连接器就脱离下来了。这样的操作便于操作人员取样，也避免了很多在操作上的不卫生和样本被污染的因素。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种快速实时DNA扩增仪，其特征在于，包括试剂槽和热循环系统，所述试剂槽上具有至少一个用于放置反应管的插孔，所述热循环系统包括发热体和散热器，所述发热体和散热器分布于试剂槽的两侧，并且发热体和散热器能够在驱动机构的带动下交替靠近或远离试剂槽。

2.根据权利要求1所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，所述发热体内设置有能够产生热量的电加热棒，电加热棒的热量能够传递到发热体上，并且发热体能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽并且贴紧在试剂槽的一个侧面上；所述散热器包括散热块和散热风扇，所述散热块背离试剂槽的侧面上具有若干块散热鳍片，所述散热风扇固定在散热鳍片上，并且散热块能够在驱动机构的带动下靠近试剂槽并且贴紧在试剂槽的另一侧面上。

3.根据权利要求1所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，所述发热体和散热器通过连接机构连接为一体，所述驱动机构包括步进电机、螺纹杆套和平行拉杆，所述螺纹杆套套在步进电机的丝杆上，并且螺纹杆套的内部具有与丝杆相匹配的内螺纹；所述平行拉杆的中部具有能够使步进电机的丝杆穿过的穿孔，步进电机的丝杆由平行拉杆中部的穿孔伸出；螺纹杆套与平行拉杆之间相互连接起来，平行拉杆固定在连接机构上。

4.根据权利要求3所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，还包括基板，所述试剂槽设置在基板上，基板上具有与所述插孔位置对应的缺口，反应管能够通过该缺口安装到试剂槽的插孔中；基板上设置有两条相互对应的直线滑轨，两条滑轨分布于基板的两侧；所述滑轨由固定构件和滑动构件组成，所述固定构件固定在基板上，所述滑动构件设置在固定构件上并能够沿固定构件的长度方向滑动；滑动构件上设置有呈直角形的角架，所述角架的水平面固定在滑动构件上，角架的垂直面固定在连接机构上。

5.根据权利要求4所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，

所述连接机构包括两个连接座，两个连接座分布于发热体和散热器的两侧，并将发热体和散热器连接起来；所述平行拉杆为矩形块，平行拉杆的两端分别固定在两个连接座上，并且平行拉杆与发热体平行。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，还包括温度控制系统，所述温度控制系统包括单片机、热电偶I和两个热电偶II，所述热电偶I设置在发热体内，用于检测发热体的温度，热电偶I将发热体的温度实时反馈给单片机，单片机根据热电偶I反馈的温度信号来控制发热体保持设定温度；两个热电偶II分别设置在试剂槽的两端，用于检测试剂槽两端的温度，两个热电偶II将试剂槽两端的温度实时反馈给单片机，单片机根据两个热电偶II反馈的温度信号来控制步进电机运动，步进电机通过连接机构带动发热体和散热器移动，从而调节发热体和散热器到试剂槽的距离，使试剂温度达到并保持设定温度。

7.根据权利要求6所述的快速实时DNA扩增仪，其特征在于，还包括荧光探测系统，所述荧光探测系统包括LED灯和摄像头，所述试剂槽的侧面具有与插孔连通的通光孔，LED灯发出的光线经过滤片过滤成能够激发荧光的特定波长的光线，该光线能够通过通光孔照射到透明的反应管中以激发基因探针发出的荧光；所述单片机与LED灯连接，用于对LED灯发出的灯光亮度进行调节；所述插孔为将试剂槽贯穿的通孔，摄像头位于试剂槽的下方，用于对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录，并将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，并生成拟合曲线。

8.一种采用如权利要求7所述DNA扩增仪进行基因突变检测的方法，其特征在于，包括步骤如下：

S1-取样：首先通过带有腮膜拭取样头的腮膜拭连接器来获取含有DNA的样本，然后将腮膜拭取样头插入反应管中，腮膜拭取样头将反应管密封并与反应管中的DNA扩增试剂接触，最后再将反应管从腮膜拭连接器上取下并放入试剂槽的插孔中；

S2-热循环：启动程序使发热体靠近试剂槽，将反应管中的试剂预热至95℃，并恒温保持2min；然后进行热循环，热循环的过程是将试剂加热至95℃，恒温保持2s，再将试剂冷却至56℃，恒温保持30s，如此循环35-50次；

S3-荧光探测：DNA扩增试剂内含有两种基因探针，一种基因探针能够与野生型基因杂合，另一种基因探针能够与突变型基因杂合，两种基因探针在与不同的基因杂合后能够被激发释放出两种不同波段的荧光；在每个热循环的尾期，LED灯发光激发反应管中基因探针发出的荧光，摄像头对反应管中基因探针发出的荧光进行拍照记录；

S4-拟合曲线分析：DNA在经过热循环后不断被复制，此时基因探针与越来越多的互补基因序列杂合，导致释放的荧光强度随DNA扩增片段的数量成正比增加，摄像头将拍照得到的图像信息发送到计算机，计算机通过软件对图像上的像素点进行分析，计算出每次热循环后野生型基因和突变型基因的荧光值，并根据每次热循环后荧光值的变化生成两条拟合曲线，两条拟合曲线用于判断DNA样本中是否含有野生型基因和/或突变型基因。

9.根据权利要求8所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述反应管采用透明材料制成，反应管为上端带有开口、下端封闭的管状结构；所述腮膜拭取样头呈柱状，腮膜拭取样头能够插入反应管中将反应管密封，并且腮膜拭取样头能够与反应管中的DNA扩增试剂接触。

10.根据权利要求9所述的基因突变检测方法，其特征在于，所述反应管采用聚丙烯制成，并且反应管的底部为平面；所述腮膜拭取样头采用热塑性橡胶制成，并且腮膜拭取样头的底部带有皮纹。