CN103819239A - 一种柑橘皮渣生物发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柑橘皮渣生物发酵方法，属于柑橘皮渣无害化处理技术领域。以柑橘皮渣为主要原料，添加液体微生物菌剂，经堆肥前发酵和堆肥腐熟，制备出一种富含有机质和硼、锌、镁等微量元素，N、P、K比例和含量适宜的发酵产物，该产物有机成分含量≥45%，pH值6.5－8.5，氮磷钾总量≥6%，水分≤30%，含有丰富的硼、锌、镁等微量元素，可以直接用作有机肥，也可添加微肥或化肥复配成有机复合肥、有机-无机复混肥等。本发明工艺简单，成本低，生产效率高，不仅处理了大量柑橘皮渣，还带动处理了其它有机质废料，既保护了环境，又增加了经济效益，实现了低碳生产，为柑橘皮渣的无害化处理探索了一种新的处理方法。

Description

一种柑橘皮渣生物发酵方法
技术领域
本发明涉及柑橘皮渣的无害化处理，特别涉及一种柑橘皮渣生物发酵方法。
背景技术
我国是世界第一大柑橘生产国。生产的柑橘除直接食用外，还有相当大的一部分柑橘用于果汁加工，产生大量的柑橘皮渣。目前，柑橘皮渣主要通过简单的卫生填埋处理。但皮渣体积大、含水率高，填埋处理不仅占地多，同时还产生大量的渗漏液和臭气，对周围的空气、土壤和水体等造成一系列环境污染，严重影响人们的生产、生活及健康，柑橘皮渣的无害化处理和资源化利用亟待解决。
柑橘皮渣富含水分、果胶、纤维素和矿质元素，还含有少量蛋白质、香精油和黄酮类物质。自上世纪80年代以来，国内对柑橘皮渣无害化处理和资源化利用技术进行了大量的科学研究，包括提取香精油、果胶、色素、纤维素和黄酮类等物质，以及厌氧沼气发酵等，但都不能对皮渣进行有效减量，甚至增加了皮渣等废弃物的体积，造成更严重的环境污染。目前，比较有效的方法是烘干皮渣做饲料，既能利用柑橘皮渣中的有机物质，又能较好地解决环境污染问题。但是，柑橘皮渣的含水率超过80%，加之富含果胶，大量的水分以结合水的形式存在，烘干皮渣能耗大，成本高，难于广泛应用。此外，柑橘皮渣的蛋白质质量分数不足1%（干质量计），饲料营养价值低。所以，目前国内的柑橘皮渣大部分仍以集中弃置为主，严重增加了企业和环境负担。无害化处理柑橘果汁生产中产生的皮渣，对于保护生态环境，柑橘种植和果汁加工业的可持续发展具有重要意义。
考虑到柑橘皮渣内含丰富的有机质、氮、磷、钾等植物需要的营养元素，兼具营养植物和改良土壤之功能。高温堆肥发酵可无害化处理柑橘皮渣生产有机肥，既可解决环境污染问题，又可实现农业资源的再利用。研究表明，影响有机质高温发酵的关键因素是微生物种类、原料性质（包括水分、酸碱度、原料成分、碳氮比等）和条件控制。由于柑橘皮渣含有大量的果胶、纤维素和水分，故在处理柑橘皮渣生产有机肥的过程中，必须有效地分解果胶、纤维素和脱水，国内也有不少关于处理柑橘皮渣生产有机肥的记载。中国专利CN101857510B公开了一种柑橘专用橘渣有机复合肥及其制备方法，采用由中国专利ZL200710093221.8，名称为“一种巨大芽孢杆菌及其在酵素菌中的应用和应用方法”中公开的，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为CGMCC NO.2267的巨大芽孢杆菌M1（Bac.megatherium.M1）经过常规微生物扩繁培养得到的一种耐酸、耐高温的微生物活性物质—柑橘果渣发酵菌（Orange Slag Fermentation）OSF发酵菌进行发酵处理的，但该菌只能进行糖化分解和氨基酸分解，没有具体公开对柑橘皮渣中的主要成分—果胶和纤维素进行降解，柑橘的有效成分没有得到充分利用。中国专利CN103396235A公开了一种利用柑橘皮渣生产有机肥料的方法，采用枯草芽孢杆菌进行发酵，仅仅能够对柑橘皮渣中的果胶进行处理，柑橘的有效成分仍然没有得到充分利用，可见，柑橘皮渣的生物发酵效果与微生物的种类及其生理特性、代谢特性有密切关系。
综上所述，针对柑橘皮渣的原料特性，探索一种柑橘皮渣的生物发酵方法仍是柑橘皮渣无害化处理过程中的重要手段和方向。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有柑橘皮渣生物发酵方法的的缺陷，以柑橘皮渣和有机质辅料为主要原料，添加液体微生物菌剂，经堆肥前发酵和堆肥腐熟，制备出一种富含有机质和硼、锌、镁等微量元素，N、P、K比例和含量适宜的发酵产物，该产物可以直接用作有机肥，也可添加微肥或化肥复配成有机复合肥、有机-无机复混肥等。
一种柑橘皮渣生物发酵方法，包括如下步骤：
（1）柑橘皮渣降酸
取原料总质量67-73%的柑橘皮渣，粉碎混合均匀，按每吨柑橘皮渣添加10-15公斤生石灰调节pH值6-7；
所述柑橘皮渣为工业化榨汁后的柑橘废渣，水分含量60-80%，pH值＜4；
（2）混料
向步骤(1)经降酸后的柑橘皮渣加入原料总质量27-33%的有机质辅料，均匀混合，调整混合物料的水分含量为40-60%；
所述有机质辅料为经粉碎的小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、谷壳、糠壳、木屑、经提取青蒿素后得到的青蒿渣、经榨油后得到的菜籽渣或桐子渣、草炭、麦麸等廉价有机质中的一种或两种以上以任意比例混合的混合物，粉碎粒度2-5mm，所述有机质辅料的含水量＜5%；
（3）堆肥前发酵
将步骤（2）处理的混合物料加入其质量0.5-1%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行微生物前发酵，当温度升至45-55℃时（发酵2-3天）翻堆一次，如此翻堆1-2次完成堆肥前发酵；
所述液体微生物菌剂由黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC NO.7926和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNO.7928的扩培发酵液组成；其发酵液菌体浓度均为8.0x1010-9.0x1010个/mL；
所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液混合的质量比为5-10:1-3:0.1-0.5；
所述黑曲霉CGMCC NO.7927扩培发酵液的制备方法为：
将保存完好的黑曲霉CGMCC No.7927的斜面菌种经菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-33℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至28-33℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，海藻糖10-30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。
所述发酵培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。
所述枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926扩培发酵液的制备方法为：
枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,(NH3)2SO43-5g，K2HPO46-8g，CaCl21-3g，琼脂15-20g，蒸馏水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1-0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
所述植物乳杆菌CGMCC NO.7928扩培发酵液的制备方法为：
植物乳杆菌CGMCC NO.7928经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏3-10g，氯化钠5-12g，蛋白胨10-20g，葡萄糖2-5g,(NH3)2SO43-5g，K2HPO46-8g，CaCl21-3g，琼脂15-20g，蒸馏水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.3-0.5%，葡萄糖1-1.5%，蛋白胨0.3-0.5%，牛肉膏0.5-0.8%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，海藻糖1-3%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.1-0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精5-15%，酵母粉0.4-0.8%，海藻糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，玉米浆0.1-0.5%，磷酸氢二钾0.8-1.5%，硫酸镁0.05-0.1%，柠檬酸钠0.1-0.5%，不足部分纯净水补足，pH值7.0-7.2，121-123℃灭菌30-40min。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；
（4）堆肥腐熟
向步骤（3）中堆肥前发酵的物料加入混合物料质量1-3%的所述液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行堆肥腐熟，当温度升至65-75℃时（发酵3-4天）翻堆一次，如此翻堆3-4次完成堆肥腐熟；
所述堆肥腐熟后还可以在脱臭槽中进行脱臭处理，脱臭处理可以除去该复合肥不良的气味，使得气体排放更加利于环保，减少空气污染。
（5）腐熟完成
步骤（4）完熟堆水分含量在35％以下，摊开，晾晒两天，使堆肥水分含量降到20-30％，即得柑橘皮渣生物发酵产物；
完熟标准：无臭味；咖啡色；温度在40℃以下，且保持不变；翻堆后不再升温；腐熟完成后，堆肥中的有机质经过炭化、腐殖化过程最后达到稳定的程度，里面的病菌和寄生虫卵等在65-75℃的发酵温度下基本被杀死；
经上述方法制备的柑橘皮渣生物发酵产物有机成分含量≥45%，pH值6.5－8.5，氮磷钾总量≥6%，水分≤30%，含有丰富的硼、锌、镁等微量元素，其它质量指标符合NY525-2012《有机肥料》的质量标准。
所述发酵产物可以直接用作有机肥，也可添加微肥或化肥复配成有机复合肥、有机-无机复混肥等。
本发明提供的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株具体为产高活力纤维素酶的菌株黑曲霉（Aspergillus niger）Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏号为CGMCC NO.7927。具有以下微生物学特征：1、形态学特征：生物学形态包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。2、培养学特征：菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。3、生理生化特征：黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃，最适产酶温度范围28-30℃。
本发明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大实验（发酵性能测定）。
按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus niger Li-2013-03，发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。
本发明提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7926。所述菌株特点如下：所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。
所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No.7926由一株保藏于实验室的产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，
由菌株CGMCC No.7926发酵获得了一种耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：
(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105-115℃之间，且在110℃以下保存的温度稳定性较好，而115℃以上保存长时间温度稳定性较差。
(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。
（3）酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/mL。
本发明所提供的乳杆菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Li-2013-01,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7928，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2013年7月15日。该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。理化特征为：过氧化氢酶（-），明胶液化（-），吲哚实验（+），运动性（-），发酵产气（-），亚硝酸盐还原（-），发酵产气（-），产硫化氢气体（-），pH4.5MRS培养基中生长（+）。
本发明植物乳杆菌CGMCC No.7928采用下述流程进行选育：
原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯（DES）诱变→平板初筛→亚硝基胍（NTG）诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。
原始出发菌种为CICC20242，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
本发明所采用的原始菌株在木聚糖培养基中，乳酸的产量为12.5g/L。为了提高其乳酸产量，依次采用DES和NTG对该菌种进行诱变，诱变采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。菌株CGMCC No.7928遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把菌株CGMCC No.7928作为选育得到的目的菌株。
菌株CGMCC No.7928可高效利用各种生物质原料，不仅可利用常见的淀粉质原料、单糖、双糖、六碳糖等，且可利用五碳糖，代谢速率快，产乳酸浓度高，转化率高，杂酸含量少。发酵72h后，以木聚糖为碳源，植物乳杆菌CGMCC No.7928的乳酸浓度可以达到57g/L，与出发菌株相比提高了356%。发酵72h后，以葡萄糖为碳源，植物乳杆菌CGMCC No.7928的乳酸浓度可以达到68g/L。
有益效果：
1.本发明以产高活力纤维素酶的黑曲霉CGMCC NO.7927、产耐酸性耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌CGMCC No.7926和高效利用有机质的植物乳杆菌CGMCC No.7928为出发菌株，将微生物的培养特性、生理特性和代谢特性与柑橘皮渣及有机质辅料的原料特性紧密结合，制备出科学、高效、实用的液体微生物菌剂，并在制备过程采用梯度降温和升温的培养方法，提高了微生物适应变温发酵的能力，充分适应了堆肥发酵的非恒温发酵过程，提高了微生物的发酵能力，有利于柑橘皮渣及有机质辅料的降解。
2.本发明采用低温（45-55℃）堆肥前发酵和高温(65-75℃)堆肥腐熟两段发酵过程，减缓了突升温度对微生物的刺激效应，有利于微生物的增殖，不仅加快了柑橘皮渣及有机质辅料的充分降解，还提高了发酵产物的有机质含量，缩短了发酵时间，提高了工作效率。
3.本发明以柑橘皮渣和廉价易得的有机质为原料制备出符合有机肥国家标准的发酵产物，成本低，工艺简单，生产效率高，不仅处理了大量柑橘皮渣，还带动处理了其它有机质废料，及保护了环境，又增加了经济效益，实现了低碳生产。
4.采用本发明生物发酵方法制备的发酵产物其有机质含量超过50%，pH值6.5－8.5，氮磷钾总量≥6%，施入土壤后，能有效地改善土壤的水、肥、气、热状况，使土壤变得疏松肥沃，有利于耕作及作物根系的生长发育，促进增产、改善产品品质，特别适合作为脐橙专用生物有机肥。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1液体微生物菌剂的制备
（一）黑曲霉CGMCC NO.7927扩培发酵液的制备
将保存完好的黑曲霉CGMCC No.7927的斜面菌种经菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至3℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养24h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养18h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，海藻糖20g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。
所述成发酵培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，海藻糖30g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。
所述发酵液菌体浓度为9.0x1010个/mL。
（二）枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926扩培发酵液的制备
枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度33℃，搅拌速度500rpm，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至3℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养24h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至33℃，恒温培养18h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏7g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖3g,(NH3)2SO44g，K2HPO47g，CaCl22g，琼脂18g，蒸馏水l000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.4%，葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.1%，海藻糖2%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.2%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，海藻糖2%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.3%，磷酸氢二钾1.1%，硫酸镁0.08%，柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值7.0，123℃灭菌20min；
所述发酵液菌体浓度为9.0x1010个/mL。
（三）植物乳杆菌CGMCC NO.7928扩培发酵液的制备
植物乳杆菌CGMCC NO.7928经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度33℃，搅拌速度500rpm，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至3℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养24h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至33℃，恒温培养18h即得扩培发酵液；
所述斜面培养基组成为：牛肉膏7g，氯化钠8g，蛋白胨15g，葡萄糖3g,(NH3)2SO44g，K2HPO47g，CaCl22g，琼脂18g，蒸馏水l000mL，pH值7.0，121℃灭菌20min；
所述一级、二级、三级种子培养基重量百分比组成为：
酵母粉0.4%，葡萄糖1%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.1%，海藻糖2%，硫酸钙0.1%,氯化镁0.2%,柠檬酸钠0.2%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述种子罐培养基重量百分比组成为：
麦芽糊精10%，酵母粉0.5%，海藻糖2%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.3%，磷酸氢二钾1.1%，硫酸镁0.08%，柠檬酸钠0.3%，不足部分纯净水补足，pH值7.0，121℃灭菌30min。
所述发酵培养基组成为：麦芽糊精100g，玉米粉55g，豆饼粉20g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值7.0，123℃灭菌20min；
所述发酵液菌体浓度为9.0x1010个/mL。
将上述制备的黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCCNO.7928的扩培发酵液按质量比为5-10:1-3:0.1-0.5均匀混合即得液体微生物菌剂。
实施例2
一种柑橘皮渣生物发酵方法，包括如下步骤：
（1）柑橘皮渣降酸
取原料总质量67%的柑橘皮渣，粉碎混合均匀，按每吨柑橘皮渣添加10公斤生石灰调节pH值至7，；
所述柑橘皮渣为工业化榨汁后的柑橘废渣，水分含量60%，pH值3.8；
（2）混料
向步骤(1)经降酸后的柑橘皮渣加入原料总质量33%的玉米秸秆，均匀混合，调整混合物料的水分含量为41.52%；
所述玉米秸秆粉碎粒度为4mm，水分含量4%；
（3）堆肥前发酵
将步骤（2）处理的混合物料加入其质量0.5%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行微生物前发酵，当温度升至45℃时翻堆一次，如此翻堆1次完成堆肥前发酵；
所述液体微生物菌剂由黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC NO.7926和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMC CNO.7928的扩培发酵液组成；其发酵液菌体浓度均为9.0x1010个/mL；
所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液混合的质量比为10:3:0.5；
（4）堆肥腐熟
向步骤（3）中堆肥前发酵的物料加入混合物料质量3%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行堆肥腐熟，当温度升至65℃时翻堆一次，如此翻堆3次完成堆肥腐熟；
（5）腐熟完成
步骤（4）完熟摊开，晾晒两天，使堆肥水分含量降到23％，即得柑橘皮渣生物发酵产物。
实施例3
一种柑橘皮渣生物发酵方法，包括如下步骤：
（1）柑橘皮渣降酸
取原料总质量70%的柑橘皮渣，粉碎混合均匀，按每吨柑橘皮渣添加,12公斤生石灰调节pH值至7；
所述柑橘皮渣为工业化榨汁后的柑橘废渣，水分含量70%，pH值3.8；
（2）混料
向步骤(1)经降酸后的柑橘皮渣加入原料总质量8%的小麦秸秆、7%的水稻秸秆、5%的玉米秸秆、4%的谷壳、3%的糠壳、3%的木屑均匀混合，调整混合物料的水分含量为50.2%；
所述小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、谷壳、糠壳、木屑的粉碎粒度为4mm，水分含量4%；
（3）堆肥前发酵
将步骤（2）处理的混合物料加入其质量0.8%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行微生物前发酵，当温度升至50℃时翻堆一次，如此翻堆2次完成堆肥前发酵；
所述液体微生物菌剂由黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC NO.7926和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNO.7928的扩培发酵液组成；其发酵液菌体浓度均为8.0x1010个/mL；
所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液混合的质量比为8:2:0.3；
（4）堆肥腐熟
向步骤（3）中堆肥前发酵的物料加入混合物料质量2%的所述液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行堆肥腐熟，当温度升至70℃时翻堆一次，如此翻堆4次完成堆肥腐熟；
（5）腐熟完成
步骤（4）完熟摊开，晾晒两天，使堆肥水分含量降到25％，即得柑橘皮渣生物发酵产物。
实施例4
一种柑橘皮渣生物发酵方法，包括如下步骤：
（1）柑橘皮渣降酸
取原料总质量73%的柑橘皮渣，按每吨柑橘皮渣添加15公斤生石灰调节pH值7粉碎混合均匀；
所述柑橘皮渣为工业化榨汁后的柑橘废渣，水分含量80%，pH值3.8；
（2）混料
向步骤(1)经降酸后的柑橘皮渣加入原料总质量10%的小麦秸秆、10%的水稻秸秆、3%的玉米秸秆、3%的菜籽渣、1%的麦麸均匀混合，调整混合物料的水分含量为59.48%；
所述小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、菜籽渣、麦麸的粉碎粒度为4mm，水分含量4%；
（3）堆肥前发酵
将步骤（2）处理的混合物料加入其质量1%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行微生物前发酵，当温度升至55℃时翻堆一次，如此翻堆2次完成堆肥前发酵；
所述液体微生物菌剂由黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC NO.7926和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNO.7928的扩培发酵液组成；其发酵液菌体浓度均为8.0x1010个/mL；
所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液混合的质量比为5:1:0.1；
（4）堆肥腐熟
向步骤（3）中堆肥前发酵的物料加入混合物料质量1%的所述液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行堆肥腐熟，当温度升至75℃时翻堆一次，如此翻堆3次完成堆肥腐熟；
（5）腐熟完成
步骤（4）完熟摊开，晾晒两天，使堆肥水分含量降到28％，即得柑橘皮渣生物发酵产物。

Claims (10)

1.一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：取原料总质量67-73%的柑橘皮渣，粉碎，混合均匀，按每吨柑橘皮渣添加10-15公斤生石灰调节pH值6-7，加入原料总质量27-33%的有机质辅料，均匀混合，调整混合物料的水分含量为40-60%；然后加入混合物料总质量0.5-1%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行微生物前发酵，当温度升至45-55℃时翻堆一次，如此翻堆1-2次完成堆肥前发酵；接着加入混合物料总质量1-3%的液体微生物菌剂，均匀混合，堆积成长垄，盖上草帘进行堆肥腐熟，当温度升至65-75℃时翻堆一次，如此翻堆3-4次完成堆肥腐熟；最后摊开、晾晒两天，使堆肥水分含量降到20-30％，即得柑橘皮渣生物发酵产物；
所述有机质辅料为经粉碎的小麦秸秆、水稻秸秆、玉米秸秆、谷壳、糠壳、木屑、经提取青蒿素后得到的青蒿渣、经榨油后得到的菜籽渣或桐子渣、草炭、麦麸等廉价有机质中的一种或两种以上以任意比例混合的混合物，粉碎粒度2-5mm；
所述液体微生物菌剂由黑曲霉（Aspergillus niger）CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC NO.7926和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCCNO.7928的扩培发酵液组成。
2.如权利要求1所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液菌体浓度均为8.0x1010-9.0x1010个/mL。
3.如权利要求1所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述黑曲霉CGMCC NO.7927、枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926和植物乳杆菌CGMCC NO.7928的扩培发酵液混合的质量比为5-10:1-3:0.1-0.5。
4.如权利要求1所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述黑曲霉CGMCC NO.7927扩培发酵液的制备方法为：将保存完好的黑曲霉CGMCC No.7927的斜面菌种经菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-33℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至28-33℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液。
5.如权利要求1所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌CGMCCNO.7926扩培发酵液的制备方法为：枯草芽孢杆菌CGMCC NO.7926经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液。
6.如权利要求1所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述植物乳杆菌CGMCCNO.7928扩培发酵液的制备方法为：植物乳杆菌CGMCC NO.7928经斜面菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐逐级扩大培养得到液体种子，将液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30-36℃，搅拌速度200-700rpm，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-36℃，恒温培养15-20h即得扩培发酵液。
7.如权利要求4所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7。
8.如权利要求6所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15-25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆1-5g，硫酸铵1-3g，磷酸氢二钾1-2g，磷酸二氢钾1-2g，柠檬酸钠1-5g，消泡剂0.1-1g,纯净水l000mL，pH值7.0-7.2。
9.如权利要求1-8任一所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所述堆肥腐熟后在脱臭槽中进行脱臭处理。
10.如权利要求9所述的一种柑橘皮渣生物发酵方法，其特征在于，所制备的柑橘皮渣生物发酵产物可以直接用作有机肥，也可添加微肥或化肥复配成有机复合肥、有机-无机复混肥等。
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