CN103797370A - 用于检测抗生素的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测样品中分析物的设备和方法。

Description

用于检测抗生素的免疫测定法
技术领域
本发明公开了用于检测样品中分析物的设备和方法。
背景技术
抗生素用于抗人和动物二者的感染性疾病。人们熟知，抗生素的滥用（比如每当从医学角度来讲不需要却施用了抗生素，或不完整的治疗疗程）是抗生素抗性发展的最重要的原因。因此，用于检测样品中存在抗生素的方法对于预防不希望的抗生素蔓延是最重要的，所述样品例如乳、血、鱼、饲料、肉、血清、尿、水等。在许多区域，如果能够得到快速和简单的测试，可充分地仅进行该检测方法。
一般而言，有适于常规监测样品中抗生素存在与否的两种类型的测试。首先是微生物抑制测试，其中测试微生物与待测试的样品接触并且（例如使用指示剂）观察微生物的生长（或生长的抑制）。这种测试的例子描述在EP0755 456B1中。微生物抑制测试的主要缺点是其花费相对长的时间来获得结果。
第二是竞争性免疫试验，其中待测试的抗生素和测试中存在的参考抗生素竞争结合对抗生素具有亲和性的结合蛋白和/或抗体。通常通过标记的手段进行可视化。这种测试的许多例子之一描述在EP0593112B1中。尽管这些类型的测试通常比微生物抑制测试更快，但是它们仍需要终端使用者的大量处理，并且因而不是使用者友好的。
就上述而言，下述是明确的：存在对抗生素测试领域进行改进的相当大的空间，尤其是在涉及易用性、速度和方便性时。
附图说明
图1是根据本发明的测试设备的一种实施方式的侧视图。该测试设备包括固体支撑物（e），所述固体支撑物包括样品接收区域（a）、检测区域（b）、吸收区域（c）和处理区域（d）。
发明内容
根据本发明的方法、测试设备和试剂盒在整个诊断和分析领域有广泛的应用范围。它们可用来检测样品中任何类型的分析物，包括抗生素、碳水化合物、膳食物质、微生物、（多）核苷酸、（多）肽、类固醇、激素、毒素、（农业）化学试剂（比如杀真菌剂、除草剂和杀虫剂）、维生素、药物、代谢物、受体、抗体、变态反应原等等。在一种优选的实施方式中，根据本发明的方法、测试设备和试剂盒用来检测样品中的抗生素。
如本文所使用的，术语“抗生素”指样品中的展示抗细菌活性的一种或更多种物质或化学成分（或这种物质或化学化合物的代谢物）。在本发明的一种实施方式中，将由根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒检测的抗生素选自由下述组成的组：β-内酰胺抗生素家族、四环素抗生素家族、磺酰胺抗生素家族、氨基糖苷类抗生素家族和喹诺酮抗生素家族。在本发明的一种优选的实施方式中，将由根据本发明的方法、测试设备和/或试剂盒检测的抗生素是β-内酰胺抗生素。术语“β-内酰胺抗生素”指下述化合物（或其代谢物），所述化合物的化学结构中包含β-内酰胺亚结构并且展示抗细菌活性。β-内酰胺抗生素的两个重要亚类是源自头孢菌素的抗生素和源自青霉素的抗生素。源自头孢菌素的抗生素的例子是头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢噻呋、头孢氨苄、头孢吡硫和头孢拉定。源自青霉素的抗生素的例子是阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V和替卡西林。
本发明涉及用于检测样品中抗生素的方法，所述方法包括下述步骤：
a）使液态样品接触标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂以形成液态组合物，
b）提供具有近端和远端的测试设备，所述测试设备配置为允许侧向流从近端流至远端，所述测试设备包括固体支撑物，所述固体支撑物以从近端至远端的顺序包括下列区域：
i.样品接收区域，
ii.检测区域，所述检测区域包括至少两个区：
A.检测区，其包含固定化的抗生素，当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自样品的抗生素结合时，所述固定化的抗生素能够结合标记的抗生素结合蛋白，和
B.对照区，其包含能够结合标记的对照试剂的固定化的结合试剂，
iii.吸收区域，和
iv.任选地，处理区域，
c）使液态组合物与测试设备的样品接收区域接触，
d）允许液态组合物从样品接收区域通过检测区域移动至吸收区域，从而允许包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的液态组合物接触检测区和对照区，
e）检测在检测区的信号和在对照区的信号，其中
i.通过在检测区存在比在对照区的信号更强烈的信号来指示样品中不存在抗生素，和
ii.通过在检测区不存在信号或在检测区存在比在对照区的信号更弱的信号来指示样品中存在抗生素。
在第一步中，样品与至少一种标记的抗生素结合蛋白和至少一种标记的对照试剂接触。在一种实施方式中，样品可与多于一种标记的抗生素结合蛋白和/或多于一种标记的对照试剂接触。与样品接触之前，标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂可以液体或固体形式存在。两种试剂可为液体形式，或两种试剂可为固体形式，或一种可为固体形式且另一试剂可为液体形式。优选地，两种试剂以固体形式存在，优选地为粉末形式。固体形式可通过干燥或冻干化合物制造。粉末可再悬浮在样品中。如果必要的话，获得的液态组合物可（例如通过应用漩涡）被混合，以改善和/或加快粉末在样品中的再悬浮。如果需要的话，可添加有利于标记的抗生素结合蛋白、标记的对照试剂和样品的再悬浮和/或溶解和/或混合的化合物。在优选的一种实施方式中，在与样品接触之前，这些化合物与标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂一起存在。优选地，这些化合物也为固体形式，例如为粉末形式。合适的化合物，包括但不限于缓冲液，例如有机缓冲液比如Tris缓冲液，表面活性剂比如Triton X-100，蛋白质比如牛血清白蛋白，多元醇比如甘油，和糖例如二糖（如蔗糖）。在一种实施方式中，添加至抗生素结合蛋白和标记的对照试剂中的液态样品的量在50和1000μl之间，优选地在75和7500μl之间，更优选地在100和500μl之间，尤其在125和250μl之间。在样品与至少一种标记的抗生素结合蛋白和至少一种标记的对照试剂接触之后，可振荡获得的液态组合物。振荡一般进行1至20秒，优选地5至15秒，优选大约10秒。
在一种实施方式中，标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂存在于容器中。优选地，上述化合物也存在于容器中。标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂可存在于不同的容器中，但是优选地它们存在于一个容器中。可用于本发明的容器可以是任何形状和尺寸的管并且可来自任何合适的可用材料。容器也可以是孔，比如合并在微量滴定板中的孔。在优选的实施方式中，容器包含标记的抗生素结合蛋白、标记的对照试剂、缓冲液，例如有机缓冲液比如Tris缓冲液，表面活性剂比如Triton X-100（优选地浓度在0和0.1%w/v之间）、蛋白质，比如牛血清白蛋白、多元醇比如甘油，和糖，例如二糖，比如蔗糖。
可选地，标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂是测试设备的一部分，例如它们可以液体或固体形式存在于样品接收区域中，或存在于位于样品接收区域前方或位于样品接收区域和检测区域之间的分开的区域中。在该实施方式中，不将预先测量的体积添加至容器，而是可能将测试设备布置为浸入流体样品中以吸收选择量的样品。
在一种实施方式中，样品可以为包含需要从样品中提取的（一种或多种）抗生素的固体和液体。从样品中提取液体的方法取决于样品的类型。用于不同样品类型的合适的提取方法是本领域技术人员已知的，并且包括通过匀化、与珠子一起漩涡、碾磨或超声处理对固体样品进行的崩裂，和/或溶剂提取。在一种优选的实施方式中，与标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂接触的样品是液体。在本发明的一种实施方式中，样品可源自体液、器官、肉或蛋。抗生素也可存在于下述食品产物中，所述食品产物中添加了这些动物产物作为成分。食品产物的例子是牛奶；蜂蜜；牛肉、猪肉、家禽肉和鱼肉；海产食物，比如虾；经加工的肉产物，比如香肠；即食膳食；饲料；和婴儿食品。抗生素也可存在于适于被（例如食品检测机关）检查的体液或动物组织中。例子有血、肝脏组织、肌肉组织、心脏组织、肾脏组织或从肾脏获得的原尿和尿。尿和血适于在屠宰动物之前检查。抗生素也可存在于水比如废水中。在一种优选的实施方式中，样品是乳。乳可获得自牛（例如母牛）、马、绵羊、山羊、牦牛、水牛、人、驴、驯鹿、野牛和骆驼。抗生素也可存在于半加工的或加工的食品中，所述食品比如巴士德消毒的产物、UHT-产物、脱脂或部分脱脂的乳、乳清、新鲜或熟化的乳酪、酸乳酪、奶油、黄油、酸奶油、酪乳等等。
在一种实施方式中，与测试设备接触之前，将液态组合物（即步骤a中获得的液态组合物）孵育30秒至5分钟，优选地45秒至4分钟，更优选地50秒至3分钟，最优选地55秒至2.5分钟和特别地1至2分钟。液态组合物在40和70℃之间的温度，优选地50和65℃之间的温度，更优选地60和64℃之间的温度下孵育。在一种实施方式中，在振荡之后，对步骤a中获得的液态组合物进行孵育。在另一实施方式中，在对步骤a中获得的液态组合物孵育之后进行振荡。仍在另一实施方式中，在孵育之前和之后进行振荡。孵育之前和之后的振荡时间可以相同，但是也可以不同。
在一种优选的实施方式中，在液态组合物与测试设备接触之后，继续孵育。在一种实施方式中，在40至70℃的温度，优选地50和65℃之间的温度，更优选地60和64℃之间的温度下，将测试设备与液态组合物接触1至5分钟，优选地1.5至4分钟，更优选地2至3分钟。可在温度调节设备比如水浴或保温箱的帮助下进行孵育。在一种优选的实施方式中，液态组合物与测试设备接触之前和之后的温度相同。在检测区和/或对照区检测到信号时可立即停止孵育。
标记的抗生素结合蛋白可以是能够与待检测抗生素结合的任何蛋白质。结合蛋白可结合具有类似结构结合位点的抗生素家族。合适的结合蛋白包括但不限于抗体（单克隆、多克隆或重组体）、抗体片段、酶、适配体，和受体比如青霉素结合蛋白。优选地，抗生素结合蛋白是获得自微生物的蛋白。在一种实施方式中，微生物是抗生素敏感性微生物。在本发明的一种实施方式中，生物体选自由下述组成的组：芽孢杆菌属（Bacillus）的物种、埃希氏菌属（Escherichia）的物种和链球菌属（Streptococcus）的物种。在本发明的一种优选的实施方式中，生物体是嗜热生物。例子是Bacillus stearothermophilus或嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），优选Bacillus stearothermophilus。
抗生素结合蛋白和对照试剂的标记可以不同，但是在一种优选的实施方式中，它们相同。可使用可见的和不可见的标记。合适的标记包括但不限于荧光化合物，发色化合物，化学发光化合物，放射性化合物，比色化合物，磁性化合物（例如珠或颗粒），酶，催化化合物，底物，具有标记的囊泡和颗粒，比如染料颗粒、着色的乳胶颗粒、碳颗粒、金属颗粒、非金属颗粒、胶体金属颗粒。在一种优选的实施方式中，标记是可见的标记，优选胶体金属颗粒，最优选金颗粒例如胶体金颗粒。标记可通过任何合适的方式与抗生素结合蛋白和/或对照试剂结合，所述方式包括缀合、共价结合或非共价结合。标记可直接与抗生素结合蛋白和/或对照试剂结合，或标记可通过缀合物，比如生物素-链霉亲和素缀合物或生物素-亲和素缀合物结合。
在一种实施方式中，对照试剂不能与样品中的抗生素结合。在一种实施方式中，对照试剂与在测试设备的检测区域的对照区中固定的结合试剂形成特异性结合对。如本文所使用的，术语“特异性结合对”指彼此特异性结合的两种物质。
在一种实施方式中，测试设备是测试条。鉴于添加至标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的小体积的液态样品，推荐将测试设备这样放置：使得其在底部和壁之间的角中静止。
在本发明的方法中，当检测区中的标记密度（即信号）大于对照区中的标记密度时，样品不含抗生素或含有小于给定阈值的浓度的抗生素（换句话说，抗生素不以足够的量存在，并且测试被认为是“阴性”的）。因此，当在本申请中提及“样品中不存在抗生素”时，意思是样品不含抗生素或含有小于给定阈值的浓度的抗生素。但是，当检测区中的标记密度小于对照区中的标记密度时，抗生素以大于给定阈值的浓度存在于样品中（换句话说，抗生素以超过允许水平的量存在并且测试被认为是“阳性”的）。因此，当本申请提及“样品中存在抗生素”时，意思是样品含浓度大于给定阈值的抗生素。当检测区中的标记密度（即信号）与对照区中的标记密度（即信号）是等强度时，抗生素以大于、等于或小于给定阈值的浓度存在于样品中。这取决于所选择的阈值。如本文所使用的，“阈值”指下述浓度值：大于该值认为存在给定的抗生素；小于该值认为不存在所述抗生素。一般而言，具体样品中具体抗生素的阈值由地方、地区或地区间机关给出，但是对于某些研究目的而言也可预先设定所述阈值。信号可通过眼睛来在视觉上检测，但是也可通过信号读取设备（例如分光光度计、反射系数读取器、荧光计、照相机、磁性探测器、闪烁计数器等等）来检测。
可测量处于检测区的可检测标记的强度，以测定本发明方法的结果。本发明的方法可提供是或否的结果（即存在或不存在抗生素）或可确定存在或不存在大于或小于某阈值的抗生素（实际上也是是或否的结果）。信号的强度可与样品中抗生素的浓度反相关。此外，在检测区的信号强度可与在对照区的信号强度比较，以确定本发明方法的结果。不同区的强度之间的差异甚至可通过信号读取设备来分析，并例如通过比较结果与预定的值，用来计算样品中抗生素的浓度。
本发明进一步涉及用于检测样品中的抗生素的测试设备，所述测试设备具有近端和远端，所述测试设备配置为允许包含液态样品、标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的液态组合物的侧向流从近端流至远端，所述设备包括固体支撑物，所述固体支撑物以从近端至远端的顺序包括下列区域：
-样品接收区域，
-检测区域，所述检测区域包括至少两个区：
i.检测区，其包含固定化的抗生素，当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自样品的抗生素结合时，所述固定化的抗生素能够结合标记的抗生素结合蛋白，和
ii.对照区，其包含能够结合标记的对照试剂的固定化结合试剂，
-吸收区域，和
-任选地，处理区域。
如本文所使用的，“固体支撑物”指用于为测试设备的不同区域提供支撑的材料。当用于根据本发明的测试设备时，固体支撑物通常由相对于将使用的测试设备的应用而言是惰性的材料制造。合适的材料是玻璃、金属、和各种类型的塑料（例如聚苯乙烯）。固体支撑物可具有0.1mm和1mm之间的厚度。在一种实施方式中，测试设备可罩在非吸收剂或层压罩中。换句话说，测试设备包括限定细长腔的外壳，用于接收和容纳测试设备。合适的外壳是本领域技术人员已知的。
可遵循已知的技术（比如胶合、热压缩等），将区域附着至背面。
本发明的测试设备通常具有在10mm和200mm之间，优选地在20mm和150mm之间，更优选地在30mm和100mm之间，和特别地在50mm和75mm之间变化的长度；在1mm和20mm之间，优选地在2mm和15mm之间，更优选地在3mm和10mm之间变化的宽度，和在0.05mm和2mm之间，优选地在0.075mm和1.5mm之间，更优选地在0.1mm和1mm之间变化的厚度。
当在4℃下存储时，本发明的测试设备具有至少6个月，优选地至少9个月的货架期。在另一实施方式中，当在-20℃下存储时，本发明的测试设备具有多达10天，优选地多达20天和更优选地多达28天的货架期。仍在另一实施方式中，当在30℃下存储时，本发明的测试设备具有多达1天，优选地多达4天和更优选地多达7天的货架期。如本文所使用的，“货架期”意思是存储的测试设备的灵敏度不下降。因此，存储的测试设备的灵敏度等于新鲜制备的测试设备的灵敏度。
在一种实施方式中，测试设备可在-20℃和30℃之间的温度下存储。优选地，测试设备在4℃和8℃之间的温度下存储。
如本文所使用的，“样品接收区域”指与液态组合物直接接触的测试设备的一部分。换句话说，样品接收区域是在液态样品已经与标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂接触之后，与液态样品直接接触的测试设备的一部分。如果需要的话，样品接收区域可包含能够与抗生素结合蛋白和/或对照试剂结合的标记试剂，特别是在当抗生素结合蛋白和/或对照试剂与液态样品接触时以未标记的形式存在的情况下。样品接收部分由多孔材料制造。在一种优选的实施方式中，样品接收区域由孔径为3-8μm的材料制造。优选地，样品接收区域是结合聚乙烯醇的玻璃纤维膜，比如VF2膜。
如本文所使用的，“检测区域”指以侧向流与样品接收区域和吸收区域接触的测试设备的一部分。接触可以是端到端连接，但是优选地在检测区域和样品接收区域之间和在检测区域和吸收区域之间有重叠。重叠可在1mm和2mm之间。检测区域由多孔材料制造。优选地，检测区域是HF90膜。检测区域通常包括一个或更多个区，例如，用于检测抗生素存在与否的检测区和起对照位点作用的对照区。检测区域也可具有两个或更多个检测区和/或两个或更多个对照区。检测区可具有相同的功能性或可具有不同的功能性（即，处于不同检测区的捕获试剂可能够结合相同的化合物或可能够结合不同化合物）。对照区同样如此。一个或更多个区可由与检测区域不同的多孔材料制造。分开的区可由不同的多孔材料制造。但是，优选地它们由相同的材料制造。优选地，一个或更多个区由与检测区域相同的材料制造。当液态组合物移动经过检测区域时，其可首先与检测区接触，然后与对照区接触，或反之亦然。在检测区域具有若干个检测区和/或对照区的情况下，可提供任何顺序的区。区可为各种构造，包括线、点或其他构造。在一种优选的实施方式中，区是线。
如本文所使用的，“侧向流”指材料中样品的液体流，其中所有溶解的和/或分散的样品组分以基本上相等的速率被运输并且相对未受损害地侧向流过材料。
每个检测区和对照区可包含至少一种捕获试剂。优选地，通过共价键合或其他键合方法，将适当的捕获试剂或捕获试剂的混合物应用到检测区域，来制造检测区和对照区。如本文所使用的，“捕获试剂”指可用于在检测区和/或对照区中产生需要的功能性的任何试剂。可通过已知的方法将捕获试剂应用到检测区域，所述方法比如喷射、分散、涂抹、拉伸、打印、条纹化（stripping）等。当捕获试剂和其结合伴侣之间存在或不存在络合物时，区能够产生信号，例如视觉彩色信号。
捕获试剂可以是任何天然或非天然化合物。合适的捕获试剂的例子是抗生素、抗体、抗原、配体、蛋白质等等。在一种优选的实施方式中，在根据本发明的测试设备的检测区的捕获试剂是抗生素或其类似物。在一种优选的实施方式中，抗生素以1-3mg/mm的浓度固定在检测区。优选地，当固定在检测区时，抗生素存在于Tris缓冲液中。合适的抗生素或其类似物的例子是β-内酰胺抗生素，例如头孢菌素，例如7-氨基-头孢烷酸（7ACA）。优选地，抗生素固定在测试设备上，并且当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自样品的抗生素结合时，抗生素能够结合标记的抗生素结合蛋白。当标记的抗生素结合蛋白被来自样品的抗生素结合时，固定化的抗生素不能结合标记的抗生素结合蛋白。
在一种优选的实施方式中，在根据本发明的测试设备的对照区的捕获试剂是结合对（例如特异性结合对，比如抗原/抗体对）的一个成员。但是，其也可以是抗体结合蛋白，例如蛋白A。当应用至对照区时，捕获试剂可存在于下述溶液中，所述溶液包含额外的蛋白质例如牛血清白蛋白，糖，例如二糖（比如蔗糖），和盐，比如NaCl。在一种优选的实施方式中，在对照区的捕获试剂不能结合样品中的抗生素和/或标记的抗生素结合蛋白，无论所述蛋白质是否结合了抗生素。
可以本身已知的方式，例如通过共价或非共价吸附至检测区域，将捕获试剂固定到检测区域上。捕获试剂也可通过载体例如牛血清白蛋白（BSA）与检测区域共价轭合。任选地，捕获试剂可经间隔物与载体偶合。许多双功能的化合物适于作为间隔物。可应用对构建键而言可用的所有方法，例如偶合技术，例如从肽化学已知的那些技术，除非它们对捕获试剂有害。合适的间隔物、载体和偶合技术是本领域技术人员熟知的。
无论抗生素是否存在于样品中，对照区产生信号并且根据需要给出测试设备起作用的指示。对照区提供不随着样品中的抗生素的浓度而改变的一致的信号。对照区也可用于通知使用者液态组合物已经流过测试设备。在该意义上，对照区可用作流动对照。此外，对照区可用于与检测区比较。
如本文所使用的，“吸收区域”指测试设备的下述部分，其以侧向流与检测区域接触并发挥促进侧向流经过检测区域的作用，并且能够吸收过多液态样品。接触是端到端连接，但是优选地是检测区域和吸收区域之间的重叠。重叠可在1mm和2mm之间。吸收区域由多孔材料制造。在优选的实施方式中，吸收区域是至少1cm。
如本文所使用的，“处理区域”是指可用来容纳并操作测试设备而不妨碍测试结果的测试设备的区域。处理区域可以是与固体支撑物连接的分开区域，但是处理区域也可以是固体支撑物本身的一部分。如果需要的话，处理区域和吸收区域也可组合成一个区域。
仍在本发明的另一实施方式中，测试设备包括覆盖样品接收区域、检测区域和吸收区域的一个或更多个的元件。可由任何材料、优选地由透明塑料材料制造的所述元件有利地对所述区域提供涉及指纹和/或机械毁坏和/或烟雾等的保护。一个或更多个区域可用单个元件覆盖，但是，也可使用任选地不同材料的多个元件。
如本文所使用的，“多孔材料”指能够提供侧向流的任何材料。合适的多孔材料的例子是聚合材料（比如聚乙烯或聚酯）、棉花、玻璃纤维、硝基纤维素、硝基纤维素和聚合材料的掺混物、尼龙、纸张、人造丝（rayon）等。
在一种实施方式中，测试设备包括比吸收区域更长的检测区域，比处理区域更长的吸收区域，和比样品接收区域更长的处理区域。
根据本发明的测试设备由本领域技术人员已知的制造方法制造。固体支撑物可具有卡片（card）的形式。这些可使用例如商业上可获得的层压机制备。卡片可被层压。在卡片上可连接各种区域。在组装卡片之前或之后，将使用的捕获试剂以溶液形式沉积在检测区域上。这些溶液可使用商业上可获得的装置（比如来自BioDot,Inc.的分散器）非常精确地沉积。在应用检测区和/或对照区之前和/或之后，检测区域可通过例如喷射封闭液来封闭。优选的封闭液包括缓冲液，例如有机缓冲液，比如Tris缓冲液，表面活性剂，例如Tween，比如Tween-20，和蛋白质，比如牛血清白蛋白。优选地，封闭液不直接喷射在检测区和/或对照区上。例如，通过将卡片放置在热空气流中，可以使沉积的溶液立即蒸发。在已经应用所有的区域和区之后，卡片优选地在干燥气氛——即相对湿度<50%、<40%、<30%、<20%、<10%、优选地0%——的气氛下干燥。对于大规模生产，制备卷筒（roll）也是可能的。随后，承载期望的捕获试剂的卡片和卷筒可被切割成条，这些条的每一个构成根据本发明的测试设备。可选地，捕获试剂也可在检测区域上沉积，然后通过简单地将检测区域浸渍在含捕获试剂的溶液中组装卡片或卷筒。
本发明也涉及一种试剂盒，其包括标记的抗生素结合蛋白、标记的对照试剂，和根据本发明的测试设备。测试设备优选地在包括干燥剂的包装中存储。优选地，标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂存在于容器中，优选地存在于单个容器中。优选地，试剂盒包括多于一个容器和多于一个测试设备，例如10、20、30、40、50或甚至100个容器和/或测试设备。根据本发明的试剂盒还可包括取样设备。取样设备是这样的设备：在其帮助下，样品（例如液态样品）可被添加到标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。例子包括但不限于，容器（任选地具有体积记号）、注射器、移液管或自动移液系统。这种注射器或移液管可以如下设计：使得仅用一种操作模式就能够从待分析的液态样品中取出预定的体积。任选地，可使用本领域已知的下述系统，用所述系统可单次处理操作多于一个注射器或移液管。在试剂盒包括取样设备比如移液管的情况下，其可额外地包括移液管端（pipette tip）。优选地，移液管端的量等于容器（即，其中存在标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器）和测试设备的量。以该方式，仅用一个移液管就可将不同的样品应用到不同的容器中。在试剂盒包括一次性移液管作为取样设备的情况下，一次性移液管的量等于容器（即，其中存在标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器）和测试设备的量。
任选地，试剂盒进一步包括使用说明书的插入物和/或设定孵育所需时间的工具。任选地，试剂盒进一步包括温度调节设备，比如保温箱或水浴，在其帮助下样品可保持在预先设定的温度下，比如液态样品、标记的抗生素结合蛋白、标记的对照试剂和任选地测试设备应被孵育的温度下。优选地，所述温度调节设备以下述方式设计，所述方式使得其可容纳装有标记的抗生素结合蛋白、标记的对照试剂、液态样品和任选地测试设备的容器。任选地，温度调节设备与设定孵育所需时间的工具偶联，使得在预先设定的时间过去之后停止加热。任选地，试剂盒也包括样品-读取设备、载有计算机程序的数据载体，所述计算机程序适于指导计算机分析从样品-读取设备获得的数字数据。
上文针对本发明方法公开的实施方式和特征也与本发明的测试设备和试剂盒有关。上文针对本发明测试设备公开的实施方式和特征也与根据本发明的方法和试剂盒有关。上文针对本发明试剂盒公开的实施方式和特征也与根据本发明的测试设备和方法有关。
实施例
实施例1
制备测试设备
硝基纤维素HF90膜（Millipore；长度25mm）用作检测区域。将该膜胶合至聚苯乙烯层压卡（厚度0.254mm）距卡片近端8mm处。接下来，将检测区和对照区应用到硝基纤维素膜上。使用前线（frontline）为0.2μl/cm的Biodot Dispense工作站XYZ3050，通过将1mg/ml的7ACA-间隔物-BSA缀合物分散在20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）中，来应用检测区。用前线为0.8μl/cm的Biodot Dispense工作站XYZ3050，通过将0.15mg/ml的抗IgY抗体分散在包含0.675mg/ml BSA、5%w/v蔗糖和20mMNaCl的20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）中，来应用对照区。在对区干燥之后，使用具有airjet3x的Biodot Dispense工作站XYZ3050，通过喷射包含10mM Tris缓冲液（pH8）的溶液来封闭硝基纤维素膜，所述Tris缓冲液包含2%w/v BSA和0.05%w/v Tween-20。在检测区下方2mm的距离处，将溶液喷射在膜上。其后，将样品接收区域（来自Millipore的VF2膜；长度1cm）胶合在卡片的近端，与硝基纤维素膜重叠2mm。吸收区域（来自Millipore的10038膜；长度20mm）胶合在卡片的远端，在硝基纤维素膜上重叠2mm。使获得的卡片在37℃下在干燥气氛（0%相对湿度）中干燥。将卡片切割成5.2mm宽度的条并且保持在干燥气氛（0%相对湿度）处。
实施例2
制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂
通过胶体金（直径40nm；1OD/ml）与10μg/ml链霉亲和素反应合成链霉亲和素涂布的金颗粒。接下来，将获得的溶液通过切向流过滤来浓缩，冲洗并且存储在包含NaCN的Tris缓冲液（pH8）中。对纯化自Bacillus stearothermophilus的青霉素结合蛋白用D-生物素基-ε-氨基己酸-N-羟基丁二酰亚胺酯进行生物素化（1:4）。接下来，通过使1.5μg生物素化的青霉素结合蛋白与1OD链霉亲和素涂布的金颗粒反应1小时，合成青霉素结合蛋白-金缀合物，随后以10,000xg离心5分钟，并且将获得的小球再悬浮在包含0.1%w/v Triton X-100（pH9.6）的45mM碳酸氢盐缓冲液中。
通过将胶体金（直径40nm；1OD/ml）与10μg/ml IgY反应合成IgY涂布的金颗粒。接下来，获得的溶液在7,500xg下离心10分钟并且获得的小球再悬浮在Tris缓冲液（pH8）中，通过另一轮的离心并且将获得小球再悬浮在Tris缓冲液（pH8）中来冲洗，并且存储在包含NaCN的Tris-缓冲液（pH8）中。
其后，将140-200mOD的青霉素结合蛋白-金缀合物和5-20mOD的IgY-金缀合物溶解在100μl缓冲液（包含0.01%w/v Triton-X-100、0.4%w/v BSA、5%v/v甘油和2%w/v蔗糖的80mM Tris缓冲液（pH8.5））中，并且每管中分散0.75μl的该溶液，并且在40℃下干燥12小时。密封获得的管。
实施例3
用测试设备检测抗生素
对包含干燥缀合物的每个管添加150μl掺混的（spiked）乳。添加的乳中的青霉素G的浓度从0至4ng/g变化（管1：0ng/g；管1：1ng/g；管2：2ng/g；管3：3ng/g；和管4：4ng/g）。获得的液态组合物在64℃下于保温箱中孵育2分钟。将测试设备放入管并且在64℃下于保温箱中孵育3分钟。肉眼读取结果。
结果显示在表1中。结果显示，对于乳中的任何浓度的青霉素G，对照区的强度保持稳定。当乳中青霉素G的浓度是2ng/g或更高时，检测区的信号明显更弱。在0ng/g和1ng/g浓度时，检测区的强度明显高于对照区的强度。在2ng/g和3ng/g的浓度时，检测区的信号强度类似于对照区的信号强度。在4ng/g的浓度时，检测区的强度明显小于对照区的强度。
实施例4
孵育温度对测试设备性能的影响
如实施例1中所述制造测试设备，前提是测试设备不含对照区。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白。
在第一个实验中，将标记的抗生素结合蛋白在200μL鲜奶中稀释（25nM终浓度）并且在64℃下孵育5分钟。在第二个实验中，将标记的抗生素结合蛋白在200μL生乳中稀释（25nM终浓度）并且在47.5℃下孵育5分钟。孵育之后，将测试设备垂直引入每一乳溶液中并且继续孵育另外10分钟。孵育之后，肉眼评估检测区的信号强度和样品接收区域中残留金的量。
样品接收区域中残留的标记的结合蛋白量有显著差异。带有在47.5℃下孵育的乳的样品接收区域显示出比带有在64℃下孵育的乳的样品接收区域更多的标记的结合蛋白。因此，在64℃下比在47.5℃下有更好的乳流动。在检测区的标记的结合蛋白的强度没有显著差异。
实施例5
吸收区域的长度对测试设备性能的影响
如实施例4中所述制备测试设备。制备具有2cm长度、2.5cm长度和5cm长度的吸收区域的测试设备。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白。
标记的抗生素结合蛋白在200μL生乳中稀释（25nM终浓度）并在47.5℃下孵育5分钟。然后，将具有2cm长吸收区域、2.5cm长吸收区域或5cm长吸收区域的测试设备垂直引入乳中并且在47.5℃下孵育10分钟。孵育之后，肉眼检测检测区的信号强度和样品接收区域中残留金的量。
结果显示，样品接收区域中残留的金量和检测区的强度都不受吸收区域长度变化的影响，并且吸收区域的长度可减少至2cm，而不丧失检测区的强度。
另外，如实施例1中所述制备测试设备。制备具有0.5cm长度、1cm长度和2cm长度的吸收区域的测试设备。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白。
标记的抗生素结合蛋白在150μL生乳中稀释并且在64℃下孵育2分钟。然后，将具有0.5cm长吸收区域、1cm长吸收区域或2cm长吸收区域的测试设备垂直引入乳中，并且在64℃下孵育3分钟。孵育之后，肉眼检测检测区的信号强度和样品接收区域中残留金的量。
结果显示，样品接收区域中残留的金量在具有1cm长度的吸收区域的测试设备和具有2cm长度的吸收区域的测试设备之间相等。而且，结果显示，具有1cm或2cm长度的吸收区域的测试设备的对照区和检测区的强度较强。当测试设备的吸收区域的长度减少至0.5cm时，对照区和检测区的信号强度显著下降。因此，测试设备的吸收区域的长度应至少1cm，以在对照区和检测区具有良好信号。
实施例6
样品接收区域的膜类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备。样品接收区域由膜制造，所述膜具有1μm的孔径、范围在3μm和8μm之间的孔径或50μm的孔径。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果显示，当样品接收区域的孔径是1μm或50μm时，在对照区和检测区没有信号。当样品接收区域的孔径在3μm和8μm之间时，在对照区和检测区检测到强烈的信号。具有在3μm和8μm之间孔径的样品接收区域能够从乳中去除负面影响测试结果的颗粒。具有1μm孔径的样品接收区域被乳中的颗粒阻塞，而具有50μm孔径的样品接收区域允许乳中的颗粒流至检测区域并且堵塞检测区域。
实施例7
样品接收区域的膜类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备。样品接收区域由以下制成：结合聚乙烯醇的玻璃纤维膜（VF2膜）、玻璃纤维膜（GBF-R4膜或GBF-R7L膜）、纤维素膜（AP045膜）或聚酯膜（PT-R5膜）。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。完成测试之后，使用ESE-Quant侧向流读出装置（Qiagen），通过535nm处的吸光度测量值，测量检测区的信号强度。
结果在表2中给出。结果显示，较之使用其他膜，使用结合聚乙烯醇的玻璃纤维膜（VF2膜）时，检测区的信号强度更强。结合聚乙烯醇的玻璃纤维膜是优选的，因为其使得在检测区有更好的信号检测。
实施例8
检测区域的膜类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备。检测区域由HF75、HF90或HF120膜制成。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表3中给出。结果显示，HF90膜是用于测试设备的检测区域的优选膜，因为HF90膜上的检测区产生比HF75或HF120膜上检测区更强的信号强度。
实施例9
固定化的抗生素浓度对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备，前提是改变点涂（spotted）在检测区上的抗生素（7ACA-间隔物-BSA缀合物）的浓度。抗生素的浓度计算为每单位长度（以mm计）检测区的抗生素的量（以mg计）。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。分析检测区的信号强度和形状。
结果在表4中给出。结果表明，当测试设备包含在检测区处固定的0.1mg/mm或4mg/mm抗生素时，在检测区的信号难以检测。前者产生尖锐线但是具有低的信号强度，而后者具有强的信号强度，但是具有漫射线（即信号在乳流动方向减弱），使得信号难以检测。相对地，当测试设备包含固定在检测区的2mg/mm抗生素时，线是尖锐的并且信号强度强。这在检测区导致非常好的信号可检测性。
实施例10
固定化的抗生素的缓冲液类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备，前提是点涂在检测区的抗生素存在于20mM KPO4缓冲液（pH7.5）或10mM Tris缓冲液（pH8.0）中。接下来，将测试设备在37℃下存储两周。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。在存储测试设备之后，如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。分析存储之前和之后检测区的信号强度。
结果显示，对点涂在检测区的抗生素存在于磷酸盐缓冲液中的测试设备而言，在37℃下存储两周之后检测区的信号强度下降（与存储之前比较）。对点涂在检测区的抗生素存在于Tris缓冲液中的测试设备而言，在37℃下存储两周之后检测区的信号强度保持恒定（与存储之前比较）。从中得出结论，点涂在检测区的抗生素应优选地存在于有机缓冲液比如Tris缓冲液中，而不是存在于无机缓冲液比如磷酸盐（比如KPO4）缓冲液中。
实施例11
检测区域的封闭液的类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备，前提是对区进行干燥之后，通过用下述喷射来封闭硝基纤维素膜：
a)没有封闭，
b)在10mM Tris（pH8）中的包含2%w/v BSA、0.05%w/vTween-20的溶液，或
c)在2mM KPO4缓冲液（pH7.5）中的包含2%w/v BSA、0.05%w/v Tween-20的溶液，
接下来，将测试设备直接用在测试中（以分析存储之前的信号强度），或将测试设备在37℃下存储两周然后用于测试中（以分析存储之后的信号强度）。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。分析存储之前和之后检测区的信号强度。
结果显示，用溶液b和c封闭的测试设备的检测区的信号强度在存储之前类似，而未封闭的测试设备显示更低的信号强度。当使用存储在37℃下的测试设备时，用溶液c封闭的测试设备的检测区的信号强度更弱。用溶液b封闭的测试设备的检测区的信号强度在测试设备在37℃下存储之前和之后类似。用有机缓冲液（比如Tris）封闭在长时间段内产生稳定的检测区的强度。用有机缓冲液（比如Tris）封闭因此提供具有延长的货架期的测试设备。
实施例12
应用封闭液的位置对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备；或如实施例1中所述制备测试设备，前提是在干燥之后应用至硝基纤维素膜的封闭液直接喷射在检测区上。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果显示，与封闭液没有直接喷射在检测区上相比，当封闭液直接喷射在检测区上时，检测和对照区的信号强度较不强烈（分别为41%和52%）。可得出结论，就检测区的最佳信号强度而言，封闭液不应直接喷射在检测区上。
实施例13
用来应用至对照区的溶液的类型对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备，前提是用于应用至对照区的溶液包含：
a)0.15mg/ml抗IgY抗体、20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）
b)0.15mg/ml抗IgY抗体、0.6mg/ml BSA、5.0%w/v蔗糖，20mMNaCl、20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）
c)0.075mg/ml抗IgY抗体、0.6mg/ml BSA、5.0%w/v蔗糖、20mM NaCl、20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）
d)0.04mg/ml抗IgY抗体、0.7mg/ml BSA、5.0%w/v蔗糖、20mMNaCl、20mM KPO4-缓冲液（pH7.5）。
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。分析对照区的信号强度。
结果显示在表5中。结果表明，当用来应用至对照区的溶液包含与至少一种额外的蛋白质（比如BSA）、至少一种糖（优选二糖，比如蔗糖）和至少一种盐（比如NaCl）组合的IgY时，在对照区的信号容易检测到。
另外，调查了将对照区分散在检测区域上的速度对测试设备的性能是否重要。结果显示当以0.2μl/cm的速度或0.8μl/cm的速度分散对照区时，获得的对照区太薄并且不可检测。当以1.5μl/cm的速度分散对照区时，对照区的可检测性良好。
实施例14
卡片干燥期间的湿度对测试设备的性能的影响
如实施例中所述制备测试设备；或如实施例1中所述制备测试设备，前提是获得的卡片在37℃下在半干燥气氛（大约50%相对湿度）下干燥。制备之后，测试设备在37℃下存储两周。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果显示，当获得的卡片在37℃下在半干燥气氛（大约50%相对湿度）下干燥时，与获得的卡在37℃下在干燥气氛（0%相对湿度）下干燥时相比，检测区的信号强度较不强烈。这表明当测试设备在非常低的相对湿度下干燥时，与测试设备在高相对湿度下干燥时相比，测试设备的货架期更好。
实施例15
包装的测试设备中干燥剂的存在对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备并且分成两部分。第一部分在4℃下在没有干燥剂的密闭包装中存储1年，而第二部分在4℃下在具有干燥剂的密闭包装中存储1年。存储之后，将测试设备用于测试。如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果显示，在具有干燥剂的包装中存储的测试设备比在没有干燥剂的包装中存储的测试设备，检测区的信号强度更强。
实施例16
增溶缓冲液的类型对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂；或如实施例2中描述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，前提是使用70mM MOPS缓冲液代替100mM Tris缓冲液作为增溶缓冲液。使用的所有缓冲液包含0.0025%w/v Triton-X-100、0.4%w/v BSA、5%v/v甘油和2%w/v蔗糖并且pH为8.5，0.75μl的溶液分散在每个管中并在40℃下干燥12小时。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备和如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表6中给出。结果表明，当标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂溶解在Tris缓冲液中时，与它们溶解在MOPS缓冲液中时相比，检测区的信号强度更强。从此可得出结论，在包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中应包括有机缓冲液（比如Tris缓冲液）来代替无机缓冲液例如包含磷酸盐的缓冲液（比如MOPS缓冲液）。
实施例17
增溶缓冲液的Triton X-100浓度对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，前提是使用具有不同浓度的Triton X-100的缓冲液。所有使用的缓冲液包含80mM Tris、0.4%w/v BSA、5%v/v甘油、2%w/v蔗糖并且pH为8.5，0.75μl的溶液分散在每个管中并且在40℃下干燥12小时。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备和如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表7中给出。结果表明，在没有Triton X-100的情况下，信号检测区没有强度。可从该实验得出结论，增溶缓冲液中的Triton X-100的浓度应大于0。从该实施例可进一步得出结论，表面活性剂例如非离子表面活性剂（比如Triton X-100）应包括在包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中。优选地，在包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中应包含浓度大于0.0025%w/v，例如大约0.01%w/v的Triton X-100。
实施例18
增溶缓冲液的BSA浓度对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，前提是使用具有不同BSA量的缓冲液。所有使用的缓冲液包含80mMTris、0.01%w/v Triton X-100、5%v/v甘油、2%w/v蔗糖并且pH为8.5，0.75μl的溶液分散在每个管中并且在40℃下干燥12小时。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备，且如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表8中给出。结果表明，当使用具有低量（例如0.2%w/v）BSA的缓冲液时，检测区的信号强度中等。当使用具有更高量（例如0.4%或0.8%w/v）的BSA的缓冲液时，信号强度更强。从此可得出结论，包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中应包括大于0.2%w/v量的蛋白质，例如白蛋白，如牛血清白蛋白（BSA）。
实施例19
增溶缓冲液的甘油浓度对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，前提是使用具有不同甘油量的缓冲液。所有使用的缓冲液包含80mM Tris、0.01%w/v Triton X-100、0.4%w/v BSA、2%w/v蔗糖并且pH为8.5，0.75μl的溶液分散在每个管中并且在40℃下干燥12小时。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备且如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表9中给出。结果表明，在没有甘油的情况下检测区的信号强度弱，而在存在甘油的情况下，信号强度是中等到强的。结果进一步显示最佳的甘油浓度是5%v/v。从该实施例可得出结论，多元醇（比如甘油）应包括在包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中。优选地，甘油的量是大约5%v/v。
实施例20
增溶缓冲液的蔗糖浓度对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，前提是使用具有不同蔗糖量的缓冲液。所有使用的缓冲液包含80mM Tris、0.01%w/v Triton X-100、0.4%w/v BSA、5%v/v甘油并且pH为8.5，0.75μl的溶液分散在每个管中并且在40℃下干燥12小时。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备且如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。
结果在表10中给出。结果表明，当使用低量的蔗糖时，检测区的信号强度弱。结果进一步显示最佳的蔗糖浓度是2%w/v。从该实施例可得出结论，糖，例如二糖（比如蔗糖）应包括在包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的容器（即测试管）中。优选地，蔗糖的量是大约2%w/v。
实施例21
增溶缓冲液的干燥类型对测试设备的性能的影响
如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，第一个前提是：管中的增溶缓冲液在40℃下干燥24小时或在液氮（-80℃）中冷冻1小时，然后在真空（0.42mbar）下在10℃的温度下干燥20小时；第二个前提是：使用具有不同蔗糖量的缓冲液。密封获得的管。如实施例1中所述制备测试设备并且如实施例3中所述进行测试，前提是乳未与抗生素掺混。完成测试之后，通过ESE-Quant侧向流读出装置（Qiagen），通过535nm处的吸光度测量值，测量检测区的信号强度。
结果显示在表11中。结果显示，当增溶缓冲液包含2%w/v蔗糖时，就在40℃下干燥12小时的增溶缓冲液和冻干的增溶缓冲液而言，检测区的信号强度相同。在高于2%w/v的蔗糖浓度下，冻干产生更高的信号强度，而在小于2%w/v的蔗糖浓度下，晾干产生更高的信号强度。
实施例22
标记的蛋白质的浓度对测试设备的性能的影响
如实施例1中所述制备测试设备和如实施例2中所述制备标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂。在该实施例中，评估乳中标记的抗生素结合蛋白的浓度的影响。标记的抗生素结合蛋白在150μl生乳中稀释至25nM、50nM或100nM的终浓度，并且在64℃下孵育2分钟。然后，将测试设备垂直引入每个乳溶液中并且在64℃下孵育3分钟。孵育之后，视觉检测检测区的信号强度和样品接收区域中残留金的量。
结果显示，随着乳中抗生素结合蛋白的浓度增加，检测区的信号强度显著增加。样品接收区域中残留的标记的抗生素结合蛋白也随着浓度增加而增加。
实施例23
测试设备对不同抗生素的灵敏度
测试基本上如实施例3中所述进行，前提是测试不同浓度下的不同抗生素。
结果显示在表12中。结果表明不同β-内酰胺抗生素可用本发明的测试设备来检测。
实施例24
用测试设备检测不同产物中的抗生素
测试基本上如实施例3中所述进行。代替生乳，测试不同的乳制品基质。同样地，测量所有的液体基质并且所有的粉末首先分散在水中。20g乳粉分散在250g蒸馏水中，7.1g乳清粉末分散在100g蒸馏水中。
结果显示在表13中。结果显示，测试设备可用于检测不同奶制品基质（pH4.5的乳清除外）中的抗生素。
实施例25
测试设备的货架期
如上述实施例1和2中所述生产测试设备并且在4℃下存储。在生产后的不同时间段，测试设备用来测量青霉素G。测试基本上如实施例3中所述进行。
结果显示在表14中。结果显示，在4℃下存储多达大约9个月不影响测试设备的性能。根据本发明的测试设备具有至少9个月的货架期。
实施例26
存储温度对测试设备货架期的影响
如上述实施例1和2中所述生产测试设备并且在不同温度（-20℃和30℃）下存储。在生产后的不同时间段，使用测试设备检测青霉素G。测试基本上如实施例3中所述进行。
结果显示在表15中。结果显示，在-20℃下存储多达28天之后对测试设备的性能没有影响。另外，在30℃下存储多达7天之后对测试设备的性能没有影响。在30℃下存储28天之后，观察到检测区的信号强度稍微下降。
实施例27
乳组合物对测试设备的影响
收集来自比利时的单个农场的不同乳样品并且所述乳样品被宣称无抗生素。使用Fossomatic5000装置（Foss，Denmark），分析pH、体细胞计数和脂肪和蛋白含量。每个样品分成三个亚组。然后对每个亚组掺混0、3或4ng/g青霉素G。其后，测试基本上如实施例3中所述进行。
结果（数据未示出）显示，乳组合物（乳样品的pH从6.57改变至7.15；细胞计数从20,000改变至6,993,000；脂肪含量从0.26%（w/w）改变至8.32%（w/w）；和蛋白含量从3.11%（w/w）改变至4.53%（w/w））不影响测试设备的性能。具有0ng/g青霉素G的没有一个样品被发现是阳性的。
实施例28
振荡步骤对测试设备的影响
测试基本上如实施例3中所述进行，前提是使用不同的振荡步骤。根据下列方法进行振荡步骤：
方法a）没有振荡步骤，
方法b）在将乳添加至标记的抗生素结合蛋白中并随后对获得的液态组合物孵育之后，但是在测试设备接触获得的液态组合物之前进行一个振荡步骤（10秒），
方法c）在将乳添加至标记的抗生素结合蛋白之后，但是在随后的对获得的液态组合物孵育之前进行一个振荡步骤（10秒），
方法d）在将乳添加至标记的抗生素结合蛋白之后，但是在随后的对获得的液态组合物孵育之前进行第一振荡步骤（5秒），和在随后的对获得的液态组合物孵育之后，但是在测试设备接触获得的液态组合物之前进行第二振荡步骤（10秒），
方法e）在将乳添加至标记的抗生素结合蛋白之后，但是在随后的对获得的液态组合物孵育之前进行第一振荡步骤（10秒），和在随后的对获得的液态组合物孵育之后，但是在测试设备接触获得的液态组合物之前进行第二振荡步骤（10秒）。
结果显示在表16中。结果显示没有振荡负面影响对照区和检测区的信号强度。另外，结果显示当进行一个或两个振荡步骤时没有差异。一个以及两个振荡步骤导致对照区和检测区的高信号强度。
实施例29
温度对测试的影响
测试基本上如实施例3中所述进行，前提是在不同温度（4℃、20℃或31.5℃）下进行测试。
结果显示在表17中。结果显示，进行测试的温度不影响检测区和对照区的强度。
实施例30
初始乳温度对测试的影响
测试基本上如实施例3中所述进行，前提是用具有不同初始温度（0℃、4℃、20℃或45℃）的乳进行测试。在进行测试之前允许乳迅速达到室温。
结果显示在表18中。结果显示初始乳温度不影响检测区和对照区的强度。
表1：用根据本发明的测试设备检测抗生素。
青霉素G的浓度（ng/g） 0 1 2 3 4
对照区的强度* 2 2 2 2 2
检测区的强度* 3 3 2 2 1
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表2：通过吸光度测量的针对不同样品接收区域膜的检测区的信号强度。
样品接收区域的膜类型 信号强度（通过在535nm处的吸光度测量的）
VF2 683
GFB-R4 472
GFB-R7L 325
PT-R5 629
AP045 370
表3：针对不同检测区域膜类型的检测区的信号强度和总测试时间。
膜类型 信号强度* 总测试时间（分钟）
HF75 1 4
HF90 4 5
HF120 0 >20
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表4：针对固定在检测区的不同浓度的抗生素的检测区形状和信号强度。
Figure BDA0000477410830000291
10：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
20：不可检测；1：非常差；2：差；3：中等；4：好；5：非常好
表5：针对应用至对照区的不同溶液的对照区的形状和信号强度。
溶液 对照区信号的可检测性1
a 1
b 3
c 4
d 3
10：不可检测；1：非常差；2：差；3：中等；4：好；5：非常好
表6：针对不同增溶缓冲液的检测区的信号强度。
缓冲液类型 信号强度*
Tris/HCl 4
MOPS 3
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表7：针对具有不同Triton X-100浓度的缓冲液的检测区的信号强度。
Triton X-100浓度（w/v） 信号强度*
0 0
0.0025 3
0.01 4
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表8：针对具有不同BSA浓度的缓冲液的检测区的信号强度。
BSA浓度（w/v） 信号强度*
0.2 3
0.4 5
0.8 4
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表9：针对具有不同甘油浓度的缓冲液的检测区的信号强度。
甘油浓度（v/v） 信号强度*
0 2
3 3
5 4
7 3
10 3
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表10：针对具有不同蔗糖浓度的缓冲液的检测区的信号强度。
蔗糖浓度（w/v） 信号强度*
0.1 2
0.2 2
0.5 2
1 2
2 4
4 2
*0：不可见；1：非常弱的信号；2：弱信号；3：中等信号；4：强的信号；5：非常强的信号
表11：通过吸光度测量的、在不同蔗糖浓度下的、针对不同干燥方法的检测区的信号强度.
表12：用根据本发明的测试设备检测若干种抗生素。
抗生素
阿莫西林 浓度（ng/g） 0.0 3.3 4.3 5.3 6.3 7.3
检测区的强度 3 2 1 1 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
氨苄西林 浓度（ng/g） 0.0 5.3 6.9 8.5 10.1 11.7
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢洛宁 浓度（ng/g） 0.0 3.2 4.0 4.8 5.6 6.4
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢喹诺 浓度（ng/g） 0.0 12.5 15.8 19.1 22.4 25.7
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢噻呋 浓度（ng/g） 0.0 4.0 5.1 6.2 7.3 8.4
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
氯唑西林 浓度（ng/g） 0.0 32.5 43.2 53.9 64.6 75.3
检测区的强度 3 1 0 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢氨苄 浓度（ng/g） 0.0 34.0 43.0 52.0 61.0 70.0
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢唑林 浓度（ng/g） 0.0 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
检测区的强度 3 2 1 0 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
头孢哌酮 浓度（ng/g） 0.0 4.0 4.9 5.8 6.7 7.6
检测区的强度 3 2 2 1 1 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
双氯西林 浓度（ng/g） 0.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
检测区的强度 3 3 2 2 1 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
萘夫西林 浓度（ng/g） 0.0 40.0 50.5 61.0 71.5 82.0
检测区的强度 3 3 2 1 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
苯唑西林 浓度（ng/g） 0.0 27.0 34.8 42.6 50.4 58.2
检测区的强度 3 2 2 1 0 0
对照区的强度 2 2 2 2 2 2
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表13：用根据本发明的测试设备检测不同奶制品基质中的青霉素G。
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表14：在4℃下对根据本发明的测试设备存储之后用所述测试设备检测青霉素G。
Figure BDA0000477410830000341
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表15：在-20℃或30℃下对根据本发明的测试设备存储之后用所述测试设备检测青霉素G。
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表16：在不同振荡步骤之后用根据本发明的测试设备检测青霉素G。
Figure BDA0000477410830000343
Figure BDA0000477410830000351
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表17：在不同温度下用根据本发明的测试设备检测青霉素G。
Figure BDA0000477410830000352
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。
表18：用根据本发明的测试设备检测具有不同初始温度的乳的青霉素G。
Figure BDA0000477410830000353
*0：无强度；1:低强度；2：中等强度；3:高强度。

Claims (17)

1.用于检测样品中抗生素的方法，所述方法包括下述步骤：
a）使液态样品接触标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂以形成液态组合物，
b）提供具有近端和远端的测试设备，所述测试设备配置为允许侧向流从近端流至远端，所述测试设备包括固体支撑物，所述固体支撑物以从近端至远端的顺序包括下列区域：
i.样品接收区域，
ii.检测区域，所述检测区域包括至少两个区：
A.检测区，其包含固定化的抗生素，当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自样品的抗生素结合时，所述固定化的抗生素能够结合标记的抗生素结合蛋白，和
B.对照区，其包含能够结合标记的对照试剂的固定化的结合试剂，
iii.吸收区域，和
iv.任选地，处理区域，
c）使液态组合物与测试设备的样品接收区域接触，
d）允许液态组合物从样品接收区域通过检测区域移动至吸收区域，从而允许包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的液态组合物接触检测区和对照区，
e）检测在检测区的信号和在对照区的信号，其中
i.通过在检测区存在比在对照区的信号更强烈的信号来指示样品中不存在抗生素，和
ii.通过在检测区不存在信号或在检测区存在比在对照区的信号更弱的信号来指示样品中存在抗生素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在与测试设备接触之前将所述液态组合物孵育30秒至5分钟。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在与测试设备接触之前将所述液态组合物在40至70℃下孵育。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中在与测试设备接触之前所述标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂以粉末形式存在。
5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述标记的抗生素结合蛋白和所述标记的对照试剂存在于容器中。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述标记的抗生素结合蛋白获得自抗生素敏感性微生物。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述抗生素结合蛋白和所述对照试剂的标记是相同的。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述抗生素结合蛋白和所述对照试剂用金颗粒标记。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述对照试剂不能结合所述样品中的所述抗生素。
10.根据权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述测试设备是测试条。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述固定化的抗生素通过间隔物-蛋白质缀合物与所述固体支撑物结合。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述测试设备在40至70℃的温度下与液态组合物接触1至5分钟。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，其中所述样品是乳。
14.用于检测样品中的抗生素的测试设备，所述测试设备具有近端和远端，所述测试设备配置为允许包含液态样品、标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂的液态组合物的侧向流从近端流至远端，所述设备包括固体支撑物，所述固体支撑物以从近端至远端的顺序包括下列区域：
-样品接收区域，
-检测区域，所述检测区域包括至少两个区：
i.检测区，其包含固定化的抗生素，当所述标记的抗生素结合蛋白未被来自所述样品的抗生素结合时，所述固定化的抗生素能够结合所述标记的抗生素结合蛋白，和
ii.对照区，其包含能够结合所述标记的对照试剂的固定化的结合试剂，
-吸收区域，和
-任选地，处理区域。
15.根据权利要求14所述的测试设备，其中：
-所述检测区域比所述吸收区域更长，和
-所述吸收区域比所述样品接收区域更长。
16.一种试剂盒，其包括：
-容器，其包含标记的抗生素结合蛋白和标记的对照试剂，和
-根据权利要求14或15所述的测试设备。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其进一步包括移液管。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463726A (zh) * 2016-01-15 2018-08-28 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 检测分析物的方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2863223T3 (en) * 2012-06-13 2018-08-13 Asahi Chemical Ind Method for detecting specific substances in milk
US10191046B2 (en) * 2016-05-23 2019-01-29 Se-Hwan Paek Immunobiosensor and sensor system including the same
KR101998795B1 (ko) * 2016-05-23 2019-07-10 고려대학교 세종산학협력단 면역 바이오센서 및 이를 포함하는 센서시스템

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0593112A1 (en) * 1992-10-06 1994-04-20 Gist-Brocades N.V. Detection of antibiotics
WO1996038720A1 (en) * 1995-06-02 1996-12-05 Smithkline Diagnostics, Inc. Competitive immunoassay device
WO1997006439A1 (en) * 1995-08-09 1997-02-20 Quidel Corporation Test strip and method for one step lateral flow assay
IL140258A (en) * 1998-06-25 2005-05-17 Ucb Sa Method for determining antibiotics with beta-lactam core in a biological fluid
CN101633948A (zh) * 2009-08-20 2010-01-27 华南理工大学 牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1393118A (en) 1971-09-16 1975-05-07 Pilkington Brothers Ltd Manufacture of flat glass
US5434053A (en) * 1992-10-06 1995-07-18 Gist-Brocades N.V. Detection of antibiotics
PL184460B1 (pl) 1995-02-01 2002-10-31 Gist Brocades Bv Sposób wykrywania jednego lub większej ilości związków przeciwbakteryjnych i jednostka testowa do przeprowadzania sposobu wykrywania

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0593112A1 (en) * 1992-10-06 1994-04-20 Gist-Brocades N.V. Detection of antibiotics
WO1996038720A1 (en) * 1995-06-02 1996-12-05 Smithkline Diagnostics, Inc. Competitive immunoassay device
WO1997006439A1 (en) * 1995-08-09 1997-02-20 Quidel Corporation Test strip and method for one step lateral flow assay
IL140258A (en) * 1998-06-25 2005-05-17 Ucb Sa Method for determining antibiotics with beta-lactam core in a biological fluid
CN101633948A (zh) * 2009-08-20 2010-01-27 华南理工大学 牛奶中β-内酰胺类抗生素残留试剂盒检测方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108463726A (zh) * 2016-01-15 2018-08-28 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 检测分析物的方法

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