CN103784479A

CN103784479A - 黄孢原毛平革菌抗氧化提取液及其制备方法

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Publication number: CN103784479A
Application number: CN201410024307.5A
Authority: CN
Inventors: 许飘; 陈明; 曾光明; 黄丹莲; 刘亮; 赵美花; 赖萃; 张辰; 王聪; 冷阳; 程敏
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: CN103784479B

Abstract

本发明涉及抗氧化组合物技术领域，具体是涉及一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，将黄孢原毛平革菌菌体和超纯水混合，研磨，离心分离，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，每10ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中，包含0.1～0.7μmol的谷胱甘肽，0.5～1μmol的黄酮类物质和0.1～0.6μmol的多酚类物质，本发明的抗氧化性能高，具有协同效应；本发明还提供一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的制备方法，步骤是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入超纯水，研磨，离心，得上清液；再加入超纯水至玻璃匀浆器中，研磨，离心，得上清液；将上清液合并，在合并后的上清液中加入超纯水定容，本发明工艺简单。

Description

黄孢原毛平革菌抗氧化提取液及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗氧化组合物技术领域，具体是涉及到一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液及其制备方法。

背景技术

活性氧是微生物生长代谢过程不可避免的产物，细胞内最常见的活性氧包括超氧自由基（O₂ ^·-）、过氧化氢（H₂O₂）以及羟自由基（·OH）。在正常情况下，低水平的活性氧（ROS）是细胞行使生物学功能所必需的，因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。但在某些特殊的情况下，比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚。由于活性氧高度的活泼性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分子，这种过量的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA，细胞内活性氧的积累还会引起膜脂过氧化，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起细胞结构和功能的破坏，导致细胞损伤。

在正常的生理情况下，体内自由基不断产生，同时细胞自身有自由基清除系统，可及时清除代谢产生的自由基而免受伤害，使之维持在一个正常的生理水平上。但在逆境下，比如重金属胁迫条件下，一方面自由基产生过多，另一方面自由基清除系统会发生紊乱，从而使细胞受到伤害。大量研究已经证实，细胞内本身就具有清除多余自由基的能力，这主要是靠内源性自由基清除系统。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效、具有协同效应的抗氧化的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以超纯水为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和超纯水混合，研磨，离心分离，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，每10 ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中，包含0.1～0.7 μmol的谷胱甘肽，0.5～1 μmol的黄酮类物质和0.1～0.6 μmol的多酚类物质。

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的三肽。

黄酮类物质是一类基于2-苯基色原酮-4-酮（2-苯基-1-苯并吡喃-4-酮）骨架的化合物。测定方法为，以1.5ml含有黄酮类物质的溶液为测量物，对照管以1.5 ml超纯水代替，加质量浓度为5%的亚硝酸钠溶液0.25 mL，摇匀，静置6 min，加质量浓度为10%的硝酸铝溶液0.25 mL，摇匀，静置6 min，加质量浓度为4.3%的氢氧化钠溶液2.5 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min。在波长510 nm处测定吸光度。以芸香苷（CAS号为153-18-4）为标准曲线计算黄酮类物质浓度。

多酚类物质含有多个酚基团。测定方法为，将0.5 ml含有多酚类物质的溶液与0.5 ml，质量浓度为50%的福林酚试剂混合，以0.5 ml超纯水代替含有多酚类物质的溶液作为空白对照管，反应3 min后加入2.5 ml质量浓度为2%的Na₂CO₃，室温下孵化45 min，在665 nm处测定吸光度。以没食子酸为标准曲线计算多酚类物质浓度。

黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

所述黄孢原毛平革菌菌体的制备方法为，将黄孢原毛平革菌在30～35℃下培养3～5天，超纯水清洗。

所述黄孢原毛平革菌抗氧化提取液为1ml时，使用的所述黄孢原毛平革菌菌体的质量为10～100 mg。黄孢原毛平革菌菌体质量和黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的体积配比表示为黄孢原毛平革菌菌体浓度。

所述离心分离为，将研磨后的物质在10000～12000 rpm下离心，取上清液，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液。

本发明还提供一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的制备方法，步骤是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入超纯水，充分研磨，离心，得上清液；再加入超纯水至玻璃匀浆器中，充分研磨，离心，得上清液，将上述上清液合并，在合并后的上清液中加入超纯水定容。

本发明的有益效果是，

1、谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。可以通过其巯基氧化-还原态的转换，作为可逆的氢体，参与体内氧化还原过程，和过氧化物及自由基结合，可清除细胞内自发或酶促反应所产生的活性中间产物，保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏，对抗自由基对细胞的损害，从而在活体细胞抗氧化物作用中起重要保护作用。谷胱甘肽还能对抗氧化剂对巯基的破坏。

2、黄酮类物质是一种很强的抗氧剂，可有效清除体内的氧自由基，这种抗氧化作用可以维持细胞体内的氧化还原平衡，抑制脂质过氧化，还可以阻止细胞的退化、衰老。

3、抗氧化性是多酚类物质的一个重要性质，由于多酚类物质的酚羟基中临位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力，因此多酚类物质具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力。

谷胱甘肽（GSH）、黄酮类物质和多酚类物质具有协同效应，可有效提高其抗氧化能力。

本发明的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液具有稳定的抗氧化能力和自由基清除能力，能有效维持细胞内的氧化还原平衡，并能缓解由细胞失去氧化还原平衡而引起的氧化损伤，用于保护细胞以抵抗自由基的毒性。

本发明的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液对活性氧有着独特的亲附性，具有较好的溶解性，分子量小，在细胞的某一氧化损伤位点定点作用，并且能够被细胞再生，从而起到保护作用。

本发明的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的制备方法，工艺简单，操作方便。

本发明的黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为本发明的黄孢原毛平革菌菌体浓度和黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中的抗氧化物质浓度的关系示意图。

图2为本发明的黄孢原毛平革菌菌体浓度和黄孢原毛平革菌抗氧化提取液总抗氧化能力效果关系图。

图3为本发明的黄孢原毛平革菌菌体浓度和黄孢原毛平革菌抗氧化提取液对H₂O₂和·OH的清除效果关系图。

图4为谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷浓度和总抗氧化能力效果关系图。

图5为谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷抗氧化物质混合液浓度和总抗氧化能力效果关系图。

具体实施方式

实施例1

一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，所述黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心；以超纯水为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和超纯水混合，研磨，离心分离，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，每10 mL黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中，包含0.16 μmol的谷胱甘肽，0.89 μmol的黄酮类物质以及0.15 μmol的多酚类物质。

制备方法包括以下步骤：

（1）无菌条件下，在100 ml Kirk培养基中接种2ml黄孢原毛平革菌孢子悬浮液，30～35℃下培养5天。

Kirk培养基的具体成分为，KH₂PO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.71 g，VB₁（维生素B1） 0.01 g，酒石酸铵 0.2 g，葡萄糖10 g；微量元素液70 ml；缓冲溶液 850 ml，缓冲溶液为20 mmol/L的酒石酸钠缓冲液：3.0018 g酒石酸/1000 ml，用3%（m/v）的NaOH溶液调节pH值至4.5；用水定容至1L。

其中，微量元素的成分为：NaCl 1.0 g，CoCl₂·6H₂O 0.18 g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.01 g，ZnSO₄·7H₂O 0.1 g，CaCl₂ 0.1 g，CuSO₄·5H₂O 0.01 g,，MnSO₄·H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.1 g，AlK(SO₄)₂·12H₂O 0.01 g，MgSO₄·7H₂O 3.0 g，H₃BO₃ 0.01g，甘氨酸1.5 g，用水定容至1L。

（2）收集黄孢原毛平革菌菌体，无菌超纯水清洗3～5遍，滤去水分，并用滤纸吸干菌体表面的水分，称取0.1g菌球，转移至玻璃匀浆器中，加入4 ml超纯水提取液，充分研磨，在10000 rpm下高速旋转离心10 min，取上清液。

（3）将上清液转移至离心管中，再加入4 ml超纯水提取液至玻璃匀浆器中，在10000 rpm下高速旋转离心10 min，取上清液，将两次上清液充分混合，加入超纯水定容至10 ml，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液。

实施例2

一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，所述黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心；以超纯水为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和超纯水混合，研磨，离心分离，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，每10ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中，包含0.67μmol的谷胱甘肽，0.58 μmol的黄酮类物质以及0.54μmol的多酚类物质。

制备方法包括以下步骤：

（1）无菌条件下，在100 ml Kirk培养基中接种2ml黄孢原毛平革菌孢子悬浮液，30～35℃下培养3天。

（2）收集黄孢原毛平革菌菌球，无菌超纯水清洗3～5遍，滤去水分，并用滤纸吸干菌体表面的水分，称取1.0g菌球，转移至玻璃匀浆器中，加入4 ml超纯水提取液，充分研磨，在12000 rpm下高速旋转离心5 min，取上清液。

（3）将上清液转移至离心管中，再加入4 ml超纯水提取液至玻璃匀浆器中，在12000 rpm下高速旋转离心5 min，取上清液，将两次上清液充分混合，加入超纯水定容至10 ml，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液。

实施例3

谷胱甘肽的测定

取黄孢原毛平革菌抗氧化提取液0.25 mL，加入0.25 mol/L，pH 为8.0的Tris-HCl缓冲液0.5 mL，摇匀，再加入质量浓度为3 %的甲醛溶液0.25 mL，摇匀，室温下准确静置20 min后，立刻加入预先恒温于25 ℃水浴中的5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)试剂（1 mM）3 mL，摇匀，准确静置5 min后，以磷酸缓冲液代替DTNB 试剂作空白，摇匀，立刻在波长为412 nm处测定吸光度，根据GSH标准曲线计算GSH含量。

谷胱甘肽测定实验结果如图1所示，超纯水可以有效地提取出黄孢原毛平革菌菌体的谷胱甘肽，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中GSH浓度为0.16 μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中GSH浓度为0.27 μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中GSH浓度为0.67 μmol。

多酚类物质的测定

将0.5 ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液与0.5 ml，质量浓度为50%的福林酚试剂（购自上海研拓生物科技有限公司，产品编号为100939-100）混合，以0.5 ml超纯水代替黄孢原毛平革菌抗氧化提取液作为空白对照管，反应3 min后加入2.5 ml 质量浓度为2%的Na₂CO₃，室温下孵化45 min，在665 nm处测定吸光度。以没食子酸为标准曲线计算多酚类物质浓度。

多酚类物质测定实验结果如图1所示，超纯水提取的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中多酚类物质稳定存在，且与黄孢原毛平革菌菌体浓度具有一定的线性关系，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中多酚类物质总浓度为0.15 μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中多酚类物质总浓度为0.23 μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中多酚类物质总浓度为0.54 μmol。

黄酮类物质的测定

取1.5 ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，对照管以1.5 ml超纯水代替，加质量浓度为5%的亚硝酸钠溶液0.25 mL，摇匀，静置6 min，加质量浓度为10%的硝酸铝溶液0.25 mL，摇匀，静置6 min，加质量浓度为4.3%的氢氧化钠溶液2.5 mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min。在波长510 nm处测定吸光度。以芸香苷为标准曲线计算黄酮类物质浓度。

黄酮类物质测定实验结果如图1所示，黄孢原毛平革菌菌体浓度为10 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中黄酮类物质浓度为0.58μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为30 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中黄酮类物质浓度为0.72 μmol；黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中黄酮类物质浓度为0.89 μmol。

实施例4

总抗氧化能力测定

ABTS^·+的生成：

0.549 g 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）溶解在100 ml 配制的过氧化氢溶液中（10 mmol/L)，室温下（25～30℃）避光静置1小时，有特征的蓝绿色的ABTS^·+产生，保存至4℃冰箱中备用。

总抗氧化能力测定步骤：

取10 mmol/L的上述ABTS^·+，用醋酸钠盐缓冲液（pH 3.6）稀释至734 nm下吸光度为0.70±0.02，得到ABTS^·+溶液。取上述制备的不同的黄孢原毛平革菌菌体浓度的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液50ul，加入3ml ABTS^·+溶液，得到反应液，震荡30s，在30℃下测定反应液在734 nm处3 min内吸光度值的变化，以超纯水代替黄孢原毛平革菌抗氧化提取液作为空白对照样，计算黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的总抗氧化能力（ΔA/min）。

总抗氧化能力实验结果如图2所示，显示黄孢原毛平革菌抗氧化提取液具有一定的抗氧化能力，且随着黄孢原毛平革菌菌体浓度的增加，其抗氧化能力得到有效增强。

对羟自由基的清除作用

取1.5 ml FeSO₄ (1.5 mM)，1.05 ml H₂O₂ (6 mM)，1.8 ml水杨酸钠 (20 mM)溶液，以及0.45 ml上述制备得到的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，37 ℃下孵化30 min，生成羟基化的水杨酸，在562 nm下测定吸光度A_sample，以超纯水代替黄孢原毛平革菌抗氧化提取液作为对照样测定吸光度A₀，计算羟基清除能力（%）。

羟基清除能力=（A_sample-A₀）/A₀*100%

羟基自由基清除能力实验结果见附图3，显示组合物对羟基自由基具有很强的清除能力，黄孢原毛平革菌菌体浓度为100 mg/ml时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液对羟基自由基的清除能力可达到83.62%。

H₂O₂清除能力测定

取1 ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，加入到初始浓度为20 mg/L的H₂O₂溶液中，黑暗条件下振荡降解1 h，测定剩余的H₂O₂浓度，计算其清除能力。

H₂O₂清除能力=（C₀-C_t）/ C₀*100%

其中，C₀为H₂O₂初始浓度，C_t为降解1 h后的H₂O₂浓度。

H₂O₂清除能力实验结果见图3所示，显示黄孢原毛平革菌抗氧化提取液对H₂O₂具有很强的清除能力，100 mg/ml的黄孢原毛平革菌菌体浓度时，黄孢原毛平革菌抗氧化提取液对双氧水的清除能力可达到91.37%。

实施例5

抗氧化物质总抗氧化能力研究

取10 mmol/L的ABTS^·+，用醋酸钠盐缓冲液（pH 3.6）稀释至734 nm下吸光度为0.70±0.02。取0.02-0.2 mmol/L浓度范围内的谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷溶液50 ul，加入3 ml ABTS^·+溶液，得反应液，准确震荡30 s，在30℃下测定反应液在734 nm处3 min内吸光度值的变化，以超纯水代替谷胱甘肽、没食子酸或芸香苷溶液作为空白对照样，计算其总抗氧化能力（ΔA/min）。

抗氧化能力实验结果如图4所示，从图中可以发现，谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷都表现出一定的抗氧化能力，其中谷胱甘肽抗氧化能力最强，其次是没食子酸，最后是芸香苷。

抗氧化物质的协同抗氧化能力

配制浓度为0.02-0.2 mmol/L的谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷溶液50 ml，具体操作如下：

称取30.73 mg谷胱甘肽、17.03 mg没食子酸、61.52 mg芸香苷，各自溶解后混合，定容至50 ml，得到2 mmol/L的谷胱甘肽、没食子酸以及芸香苷混合溶液，再分别移取上述混合溶液1 ml、2 ml、4 ml、8 ml、10 ml，定容至100 ml，得到浓度为0.02mmol/L、0.04mmol/L、0.08mmol/L、0.16mmol/L、0.2 mmol/L的小分子抗氧化物质混合溶液。

取10 mmol/L的ABTS^·+，用醋酸钠盐缓冲液（pH 3.6）稀释至734 nm下吸光度为0.70±0.02。取上述不同浓度的小分子抗氧化物质混合溶液50 ul，加入3 ml ABTS^·+溶液，得反应液，准确震荡30 s，在30℃下测定反应液在734 nm处3 min内吸光度值的变化，以超纯水代替小分子抗氧化物质混合溶液作为空白对照样，计算其总抗氧化能力（ΔA/min）。

抗氧化能力实验结果如图5所示，比较图4和图5可以发现，小分子抗氧化物质混合溶液的浓度相较于单独的小分子抗氧化物质表现出更高的抗氧化能力，且不是简单的三种物质单独抗氧化能力的相加。说明谷胱甘肽、多酚类物质以及黄酮类物质在抗氧化能力方面表现出协同效应，共同作用可有效提高其抗氧化能力。

此外，比较图2与图5还可以发现，富含谷胱甘肽、多酚类物质以及黄酮类物质的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的抗氧化能力强于相似浓度范围内的小分子抗氧化物质混合溶液。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，其特征是，以黄孢原毛平革菌菌体为被提取物，以超纯水为提取剂，将黄孢原毛平革菌菌体和超纯水混合，研磨，离心分离，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，每10 ml黄孢原毛平革菌抗氧化提取液中，包含0.1～0.7 μmol的谷胱甘肽，0.5～1 μmol的黄酮类物质和0.1～0.6 μmol的多酚类物质。

2.如权利要求1所述的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，其特征是，黄孢原毛平革菌为黄孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏号为CCTCC AF96007，保藏于中国典型培养物保藏中心。

3.如权利要求1或2所述的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，其特征是，所述黄孢原毛平革菌菌体的制备方法为，将黄孢原毛平革菌在30～35℃下培养3-5天，超纯水清洗。

4.如权利要求1或2所述的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，其特征是，所述黄孢原毛平革菌抗氧化提取液为1ml时，使用的所述黄孢原毛平革菌菌体的质量为10～100 mg。

5.如权利要求1或2所述的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液，其特征是，所述离心分离为，将研磨后的物质在10000～12000 rpm下离心，取上清液，得到黄孢原毛平革菌抗氧化提取液。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的黄孢原毛平革菌抗氧化提取液的制备方法，其特征是，称取黄孢原毛平革菌菌体，转移至玻璃匀浆器中，加入超纯水，充分研磨，离心，得上清液；再加入超纯水至玻璃匀浆器中，充分研磨，离心，得上清液；将上述上清液合并，在合并后的上清液中加入超纯水定容。