CN103768044B - 抑制dj-1二聚化的活性化合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一组活性化合物在制备抑制DJ-1二聚化的药物中的应用。通过基于DJ-1蛋白晶体结构的计算机辅助虚拟方法和技术、药物化学知识、和药理活性筛选发现一组抑制DJ-1二聚化的化合物，共23个。根据结构相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物，具有相似的生物活性原理，确定与这组化合物分子结构相似性Tanimoto值大于0.85，也具有相似的抑制DJ-1活性。本发明以与肿瘤发生发展相关的DJ-1蛋白为研究对象，筛选得到具有抑制DJ-1蛋白二聚化和抑制肿瘤细胞增殖的化合物。这些化合物不但能够抑制DJ-1蛋白的二聚化，而且对肿瘤细胞有较强的抑制活性，具有良好的药物开发前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一组抑制DJ-1蛋白二聚化的化合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症，亦称恶性肿瘤，由控制细胞生长增值机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周边正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。不但给病人带来极大的痛苦，而且给家庭带来沉重的经济与精神负担。
DJ-1是由日本学者Hiroyoshi于1997年发现的一种蛋白（Daisuke Nagakubo, et al, Biochemical and Biophysical
Research Communications, 1997, 213, 509-513）。他们从NIH3T3细胞中分离得到了新的cDNA，通过逆转录得到DJ-1。它是一个由189个氨基酸组成二聚体。每个单体二级结构由8个α螺旋，11个β折叠和1个β发夹结构组成。二聚体依靠8对氢键和大量的van der Wall’s形成（K.Honbon, Journal
of Biological Chemistry, 2003, 278(33), 31380-31384）。该蛋白能够促进细胞周期的转化，并且与H-Ras通路相关，最初被认定为癌基因产物。在体内，DJ-1需要与PIASxα和DJBP等蛋白结合，保持活性（Q. Huai, et al, FEBS letters, 2003, 549,
171-175）。研究发现，DJ-1与氧化应激关系密切。其中，Cys106残基对刺激的敏感性最高，是活性的主要位点（T. Kinumi, et al, Biochemical and
Biophysical Research Communications, 2004, 317(3), 722-728）。当DJ-1结构中L166p发生突变，会造成蛋白的降解，失去功能，使得ROS大量蓄积，引起相关疾病，例如，帕金森病和阿尔茨海默病（X,
Tao, L, Tong. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(33):
31372-31379）。最近，发现DJ-1的过量表达与肿瘤发生有关（H.
Ren, et al, Cancer Letter, 2010, 297(1), 101-108）。在卵巢癌细胞中，检测到了DJ-1高表达，并且DJ-1的过表达使得肿瘤生长抑制因子磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）的表达量下降（B.
Davidson, et al, Human Pathology, 2008, 39(1), 87-95）；在乳腺癌细胞中，DJ-1不但抑制PTEN的表达量，而且促进丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PKB/AKT）通路的磷酸化。另外，在肺癌细胞等其它癌症细胞中，都检测到了DJ-1的高表达。最近研究表明，DJ-1的高表达，能够降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性（H.
Ren, et al, Cancer Letter, 2010, 297(1), 101-108）。
目前，临床上用于治疗癌症的药物很多作用于与肿瘤细胞增殖相关的激酶和蛋白。例如，紫杉醇（taxol），作用于微管蛋白；吉非替尼（gefitinib）和埃罗替尼（erlotinib），抑制与肿瘤增殖相关的激酶活性。但是，由于肿瘤细胞易发生突变，产生耐药性，造成药物对突变的肿瘤细胞失去活性。DJ-1与肿瘤的发生和发展有着密切关联，但是，目前仍然没有针对抑制该蛋白活性的化合物或者相关药物报道。因此，开发针对DJ-1的结构新颖的抗肿瘤化合物具有重要的意义。
随着运算功能强大的超级计算机在计算生物学和药物设计中的应用，药物分子设计的速度和准确性均得到了革命性的提高，为合理药物设计提供了有效的技术手段。计算机辅助药物设计基于生物大分子结合位点或药效基团模型，通过对化合物数据库进行虚拟筛选发现潜在的先导化合物并对其进行生物活性测试和化合物结构优化来发展新型药物。在计算机辅助药物设计中，分子模拟、分子结构特征和分子形态相似性比较、及基于分子突变和结构生物学的蛋白质—配体相互作用理论研究起了关键的作用。另外，虚拟筛选在全新先导化合物的发现和结构优化中的作用越来越受到重视，它是通过现有生物大分子的三维结构模型或基于小分子活性配体构建的药效团模型，对化合物库中的上百万个甚至更多的化合物进行筛选，选取打分较高的化合物作为备选先导化合物，进行生物活性筛选等深入开发。虚拟筛选极大地减少了化合物合成及药物筛选的工作量、时间与资金投入，提高了筛选的效率和准确性。虚拟筛选还能完成一些传统方法无法进行的操作，如多条件和限制条件筛选。因此，虚拟筛选在新药开发研究中得到越来越广泛的运用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一组化合物在制备DJ-1二聚化抑制剂中的应用。通过基于DJ-1蛋白晶体结构的计算机辅助虚拟方法和技术、药物化学知识、和药理活性筛选发现一组抑制DJ-1二聚化的活性化合物。具体化合物如下（括号中为本发明的化合物编号）：
2-氯-5-硝基-苯甲酸-N’-(3-羟基-萘-2-羰基)-酰肼(1)
2-(4,5-二苯基-1H-咪唑-2-偶氮基)-苯酚(2)
5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-羧酸-(2,4-二氯-苯基)-酰胺(3)
4-羟基-1-甲基-2-氧-1,2-二氢喹啉-3-羧酸N'-(2-氯-苯甲酰基)-酰肼(4)
(4-溴-苯甲酰基氨基)-乙酸-2-(3-硝基-苯基)-2-氧代-乙基酯(5)
4-溴-2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(5-氯-2-羟基烯苄基)-酰肼(6)
3-羟基萘-2-羧酸[1-(3-硝基-苯基)-乙烯基]-酰肼(7)
1-(2-甲基-苯甲酰基)-3-(4-吗啉-4-甲基-苯基)-硫脲(8)
4-{[(2-甲基-2,3-二氧-1,3-二氢-1H-异吲哚-5-羰基)-氨基]-甲基}-苯甲酸(9)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-(3-甲基-噻吩-2-亚甲基)-酰肼(10)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-吡啶-2-亚甲基-酰肼(11)
5-(4-硝基-1H-吡唑-1-甲基)-呋喃-2-甲酸(3-氨基甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-2-基)-酰胺(12)
2-苯并三氮唑-1-基-乙酰胺-乙基-硫脲(13)
[6-氧-2-(N'-2-甲基-苯基-胍基)-3,6-二氢嘧啶-4-基]-乙酸甲酯(14)
[5-氨基-3-(4-氯苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]-呋喃-2-甲酮(15)
2-(6-甲氧基-苯并噻唑-2-基-氨基)-烟酸(16)
N-(4-氯-苯并噻唑-2-基-2-羟基-烟酰胺(17)
2-甲氧基-N-[5-(3-硝基-苯基)-[1,3,4]噻二唑-2-基]-苯甲酰胺(18)
5-溴呋喃-2-羧酸(2-苯并[1,3]间二氧戊烯-5-基-1-氨基甲酰基乙烯基)-酰胺(19)
2-(4-氯-苯基-5-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸-(4-氟-2-甲基-苯基)-酰胺(20)
5-甲基-1-苯基-1H-[1,2,3]三唑-4-羧酸-(3-三氟甲氧基-苯基)-酰胺(21)
N-{3- [(四氢呋喃-2-亚甲基)-氨基甲酰基]-苯基}-琥珀酰胺酸(22)
1-(4-氟-苯基-3-(2-三氟甲基-苯基-[1,3]-二氧杂环戊烯-2-基)-脲(23)。
根据结构相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物具有相似的生物活性的原理（文献M. A. Johnson, G.M. Maggiora, Eds. Concepts
and Applications of Molecular Similarity; Wiley: New York, 1990.Y.
C. Martin, et al. Do Structurally Similar Molecules Have Similar Biological
Activity Journal
of Medicinal Chemistry, 2002, 45, 4350-4358. J. W. Godden, , et al.Journal
of Chemical Information and Computer Sciences 2000, 40, 163-166和X.-Q. Xie, et al. Journal of Chemical Information and
Modeling 2008, 48, 465-475），本发明确定与这组化合物分子结构相似性Tanimoto值大于0.85的化合物，也具有相似的抑制DJ-1二聚化的活性。
本发明另一个目的是提供一组活性化合物在制备抑制DJ-1二聚化的药物中的应用，所述活性化合物为：
2-氯-5-硝基-苯甲酸-N’-(3-羟基-萘-2-羰基)-酰肼(1)
4-溴-2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(5-氯-2-羟基烯苄基)-酰肼(6)
3-羟基萘-2-羧酸[1-(3-硝基-苯基)-乙烯基]-酰肼(7)
1-(2-甲基-苯甲酰基)-3-(4-吗啉-4-甲基-苯基)-硫脲(8)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-吡啶-2-亚甲基-酰肼(11)
5-(4-硝基-1H-吡唑-1-甲基)-呋喃-2-甲酸(3-氨基甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-2-基)-酰胺(12)
2-苯并三氮唑-1-基-乙酰胺-乙基-硫脲(13)
[5-氨基-3-(4-氯苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]-呋喃-2-甲酮(15)
2-甲氧基-N-[5-(3-硝基-苯基)-[1,3,4]噻二唑-2-基]-苯甲酰胺(18)
5-溴呋喃-2-羧酸(2-苯并[1,3]间二氧戊烯-5-基-1-氨基甲酰基乙烯基)-酰胺(19)
2-(4-氯-苯基-5-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸-(4-氟-2-甲基-苯基)-酰胺(20)
N-{3- [(四氢呋喃-2-亚甲基)-氨基甲酰基]-苯基}-琥珀酰胺酸(22)。
通过针对肿瘤细胞的药理活性实验发现，所述化合物对肿瘤细胞有良好的抑制活性，其中化合物1对人宫颈癌Hela和人骨肉瘤KHOS肿瘤细胞有良好的抑制活性；化合物8对人宫颈癌Hela细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株和人前列腺癌PC3细胞株等肿瘤细胞有良好的抑制活性；化合物11对人宫颈癌Hela细胞株和人骨肉瘤KHOS细胞株等肿瘤细胞有良好的抑制活性；化合物12对人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株等肿瘤细胞有良好的抑制活性；化合物13对人宫颈癌Hela细胞株和人骨肉瘤KHOS细胞株等肿瘤细胞有良好的抑制活性；化合物20对人鼻咽癌KBKB细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株等肿瘤细胞有较好的抑制活性；化合物6、7、15、18、19、22对人肺腺癌A549细胞株、人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株等肿瘤细胞株都有良好的抑制作用。特别地，化合物6对肿瘤细胞人卵巢腺癌SKOV3细胞株和化合物19对肿瘤细胞人结直肠癌HCT116细胞株的抑制活性IC50值分别达到10-6μg/mL，化合物6对人宫颈癌Hela细胞和化合物7对人前列腺癌PC3细胞的抑制活性IC50值分别达到10-3μg/mL。
同样的，根据结构相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物，具有相似的生物活性的原理，本发明确定与上述12个化合物分子结构相似性Tanimoto值大于0.85的化合物，也具有相似的抗肿瘤活性。
本发明的再一个目的是提供计算机辅助虚拟筛选上述23个化合物的方法，通过如下方案实现：利用SybylX1.3药物分子设计及模拟软件包（SYBYL-X, version 1.3; Molecular Modeling Software
Packages, Tripos Associates, Inc., St. Louis, MO63144, USA，2011），基于DJ-1的蛋白晶体结构（PDB ID:1P5F，http://www.pdb.org），开展药物设计和虚拟筛选，其中基于蛋白DJ-1关键氨基酸Cys106残基为中心，周围10Å范围内，选择包括氨基酸Ala14、Glu15、Cys106、Arg48、Ala107、Thr125、和Leu128等在内的关键氨基酸及空间相近氨基酸组成潜在的结合口袋。
本发明在未见文献报道DJ-1抑制剂研究的情况下，首次基于DJ-1的三维晶体结构，运用基于结构的计算机辅助虚拟筛选的方法和技术，通过药理活性测试，发现了具有良好抗肿瘤活性的抑制DJ-1二聚化活性化合物。本发明以与肿瘤发生发展相关的DJ-1蛋白为研究对象，运用计算机辅助药物设计的方法和技术及药物化学相关知识，虚拟筛选得到具有抑制DJ-1蛋白二聚化和抑制肿瘤细胞增殖的化合物。初步药理活性实验表明：这些化合物不但能够抑制DJ-1蛋白的二聚化，而且对肿瘤细胞有较强的抑制活性，并且未见有文献报导相关化合物用于抗肿瘤活性研究。具有良好的药物开发前景。
附图说明
图1和图2为Western blotting的实验结果，表示虚拟筛选得到的23个化合物抑制DJ-1蛋白二聚化的实验。“+DSS”表示加入蛋白交联剂二琥珀酰亚胺辛二酸酯；“-DSS”表示不加入二琥珀酰亚胺辛二酸酯；“-”表示空白对照。当加入DSS，若DJ-1单体没有被化合物降解，会再次形成二聚体；若DJ-1单体被化合物降解，则不会再次形成DJ-1的二聚体，同时DJ-1失去生物活性。图1和图2显示与空白对照比较，各个化合物对DJ-1的二聚化具有明显抑制活性。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明，但不用来限制本发明。
实施例
1
通过文献调研，基于DJ-1的蛋白晶体结构（PDB
ID:1P5F，http://www.pdb.org），以计算图形学分析和推测DJ-1中存在的易于配体结合的空腔。通过文献调研发现，Cys106残基对于蛋白活性至关重要。DJ-1蛋白在体内与机体的氧化应激关系密切，其中Cys106对氧化刺激最为敏感，是活性的主要位点。如果能够占据Cys106催化位点，就有可能抑制DJ-1的活性。因此，本发明以蛋白的Cys106残基为中心，周围10Å范围内寻找潜在的结合口袋。利用Amber12分子动力学模拟软件，对选择的潜在结合口袋进行动力学模拟。经过优化、加热、平衡等，共30ns的分子动力学计算，动力学模拟与DJ-1结合相关的，包括Ala14、Glu15、Cys106、Arg48、Ala107、Thr125、和Leu128等在内的关键氨基酸及空间相近氨基酸组成的潜在DJ-1抑制剂结合口袋。利用Sybyl
X1.3软件，并结合动力学计算的结果，模拟潜在DJ-1活性口袋的结合模式。基于计算模拟得到的与DJ-1活性相关的关键作用和潜在结合口袋，对Specs化合物数据库（http://www. specs, net/）进行基于结构的计算机辅助虚拟筛选。
实施例
2
利用SybylX1.3药物分子设计及模拟软件包（SYBYL-X,
version 1.3; Molecular Modeling Software Packages, Tripos Associates, Inc., St.
Louis, MO63144, USA，2011）中的FlexE-Dock和Surflex-Dock软件，利用分子动力学模拟得到的与DJ-1结合相关的一些关键氨基酸作用和与潜在活性口袋的结合模式，对Specs化合物库进行基于结构的计算机辅助虚拟筛选。通过Sybyl软件自身的打分系统C-Score，对数据库中各个化合物与DJ-1的对接能力进行打分排名，选取排名在前10%的化合物。然后根据化合物的油-水分配系数（ClogP<5）、分子量（M.W.<500）等物理化学性质、化合物与DJ-1的对接结果，以及化合物的结构多样性和药物化学中相关知识选择化合物。根据下列公式（X.-Q. Xie, et
al. Journal of Chemical Information and Modeling 2008, 48, 465-475.）计算两个化合物的结构相似性系数Tanimoto值：
其中Na 为化合物a具有的结构基团，Nb 为化合物b具有的结构基团，Nab 为化合物a和b共同具有的结构基团，分类化合物相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物。同时，考虑选择未在文献报道用于抗肿瘤活性研究和药物开发的化合物。购买虚拟筛选得到化合物结构相似性系数Tanimoto值小于0.85的化合物100个，进行药理活性测试。抑制DJ-1活性筛选得到的活性化合物如下：
2-氯-5-硝基-苯甲酸-N’-(3-羟基-萘-2-羰基)-酰肼(1)
2-(4,5-二苯基-1H-咪唑-2-偶氮基)-苯酚(2)
5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-羧酸-(2,4-二氯-苯基)-酰胺(3)
4-羟基-1-甲基-2-氧-1,2-二氢喹啉-3-羧酸N'-(2-氯-苯甲酰基)-酰肼(4)
(4-溴-苯甲酰基氨基)-乙酸-2-(3-硝基-苯基)-2-氧代-乙基酯(5)
4-溴-2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(5-氯-2-羟基烯苄基)-酰肼(6)
3-羟基萘-2-羧酸[1-(3-硝基-苯基)-乙烯基]-酰肼(7)
1-(2-甲基-苯甲酰基)-3-(4-吗啉-4-甲基-苯基)-硫脲(8)
4-{[(2-甲基-2,3-二氧-1,3-二氢-1H-异吲哚-5-羰基)-氨基]-甲基}-苯甲酸(9)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-(3-甲基-噻吩-2-亚甲基)-酰肼(10)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-吡啶-2-亚甲基-酰肼(11)
5-(4-硝基-1H-吡唑-1-甲基)-呋喃-2-甲酸(3-氨基甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-2-基)-酰胺(12)
2-苯并三氮唑-1-基-乙酰胺-乙基-硫脲(13)
[6-氧-2-(N'-2-甲基-苯基-胍基)-3,6-二氢嘧啶-4-基]-乙酸甲酯(14)
[5-氨基-3-(4-氯苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]-呋喃-2-甲酮(15)
2-(6-甲氧基-苯并噻唑-2-基-氨基)-烟酸(16)
N-(4-氯-苯并噻唑-2-基-2-羟基-烟酰胺(17)
2-甲氧基-N-[5-(3-硝基-苯基)-[1,3,4]噻二唑-2-基]-苯甲酰胺(18)
5-溴呋喃-2-羧酸(2-苯并[1,3]间二氧戊烯-5-基-1-氨基甲酰基乙烯基)-酰胺(19)
2-(4-氯-苯基-5-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸-(4-氟-2-甲基-苯基)-酰胺(20)
5-甲基-1-苯基-1H-[1,2,3]三唑-4-羧酸-(3-三氟甲氧基-苯基)-酰胺(21)
N-{3- [(四氢呋喃-2-亚甲基)-氨基甲酰基]-苯基}-琥珀酰胺酸(22)
1-(4-氟-苯基-3-(2-三氟甲基-苯基-[1,3]-二氧杂环戊烯-2-基)-脲(23)。
实施例 3 化合物抑制DJ-1二聚化的实验：
实验所用抗体购自Santa公司（Santa
Cruz, CA, USA）和Cell signaling公司（Cell signaling Technology）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔的IgG和羊抗鼠的IgG购自Calbiochem公司（Darmstadt, Germany）; ECL
试剂盒购自Pierce 公司（Rockford,
IL, USA）；ECL plus 试剂发色试剂盒购自Amersham
Biosciences公司（Arlington Heights, IL, USA）。
采用Western blotting法测定筛选到的23个化合物抑制DJ-1二聚化的作用：
使用RIPA buffer（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150
mMNaCl，1 mM EDTA，25 mM
β-甘油磷酸，1 mM
PMSF，0.1 mM钒酸钠，5 μg/ml leupeptin，1%
NP40，1% Triton X-100，0.2%SDS）将DJ-1纯化蛋白（4mg/mL）按1:100倍稀释，10μl/EP管分装，分别加入虚拟筛选得到的各个化合物，使得化合物终浓度为10μM。冰上孵育2小时后，加入100μM的分子内交联剂二琥珀酰亚胺辛二酸酯（disuccinimidylsuberate，DSS）,4℃孵育1h，15mM Tris-HCl（pH7.5）15min终止反应。加入5μl loading buffer（5×），煮沸5 min使蛋白变性，Western blotting检测DJ-1二聚体形成情况（见附图1和附图2）。
实施例 4化合物对肿瘤细胞的抑制活性测试：
选取人肺腺癌A549细胞株、人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株，进行肿瘤细胞抑制活性测试。
本发明所用肿瘤细胞株，包括人肺腺癌A549细胞株、人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株等肿瘤细胞株，均购买于上海细胞所；细胞培养所用细胞培养皿、细胞培养板均购自Corning-Costar公司（New York, USA）；磺酰罗丹明B（Sulforhodamine B, SRB）及二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）粉末购自Gibco BRL 公司（Life
Technologies, Grand Island, NY, USA）；胎牛血清（Fetal
Bovine Serum, FBS）购自杭州四季青公司及Gibco BRL 公司（Life Technologies, Grand Island, NY, USA）。
本发明实验操作以人宫颈癌细胞Hela为例，同时测定所有化合物对上述各肿瘤细胞的抑制活性。实验所使用肿瘤细胞株，培养于DMEM培养液，含10%灭活的胎牛血清，青霉素100 IU/ml和链霉素100 /ml，于37℃（5% CO2，95％空气），饱和湿度环境下培养。
磺酰罗丹明B法（SRB法）测定化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用：
取对数生长期的肿瘤细胞株，按4000/孔细胞接种于96孔培养板，设置阴性对照组（DMSO）及化合物处理组。化合物最高浓度为50μg/ml，5倍梯度稀释，总共5个浓度，每个浓度三个复孔。化合物作用细胞72小时后，弃去培养液，每孔加入预冷的10%三氯醋酸（TCA）溶液100 μl固定细胞，4℃冰箱放置1个小时，培养板各孔以去离子水洗涤5遍，以去除三氯醋酸溶液，在空气中干燥后，每孔加入1%乙酸配制的SRB溶液（4mg/ml）50 μl，室温下放置20分钟，弃去各孔内液体后用1%乙酸洗涤5遍，洗净未结合的SRB染料后空气干燥，每孔加入pH=10.5的10 mM Tris-base（三羟甲基胺基甲烷）溶液100 μl溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，酶标仪515 nm波长下测定吸光度OD值。
部分化合物对上述各肿瘤细胞（人肺腺癌A549细胞株、人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株）的IC50（μg/mL）值见表１。
从附图1和表1中看出：（1）所有化合物能够抑制DJ-1的二聚化。（2）大多数筛选得到的化合物对肿瘤细胞有良好的抑制活性。其中，化合物1对Hela和KHOS肿瘤细胞株有较好的抑制活性；化合物8对Hela、KB、KHOS和PC3等肿瘤细胞株有较好的抑制活性；化合物11对Hela和KHOS肿瘤细胞株有较好的抑制活性；化合物12对HCT116、Hela、KHOS、SKOV3和U2OS等肿瘤细胞株有较好的抑制活性；化合物13对Hela和KHOS细胞株有较好的抑制活性；化合物20对KB和U2OS细胞株有较好的抑制活性；（4）化合物6、7、15、18、19、22对所有的肿瘤细胞都有良好的抑制作用。特别地，化合物6对肿瘤细胞SKOV3和化合物19对肿瘤细胞HCT116的抑制活性IC50值分别达到10-6μg/mL，化合物6对肿瘤细胞Hela和化合物7对肿瘤细胞PC3的抑制活性IC50值分别达到10-3μg/mL。（5）总而言之，虚拟筛选得到的化合物具有较好的抗肿瘤应用前景，因而具有良好的潜在商业价值。（6）根据结构相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物，具有相似的生物活性原理（文献M. A. Johnson, G.M. Maggiora, Eds. Concepts
and Applications of Molecular Similarity; Wiley: New York, 1990. Y.
C. Martin, et al. Do Structurally Similar Molecules Have Similar Biological
ActivityJournal
of Medicinal Chemistry, 2002, 45, 4350-4358. J. W.Godden, , et al.Journal of
Chemical Information and Computer Sciences 2000, 40, 163-166和X.-Q. Xie, et al. Journal of Chemical Information and
Modeling 2008, 48, 465-475），与上述化合物结构相似性系数Tanimoto值大于0.85的化合物，具有相似的抗肿瘤活性。
无需进一步阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度的应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (3)
1.一组化合物在制备DJ-1二聚化抑制剂中的应用，具体化合物如下：
2-氯-5-硝基-苯甲酸-N’-(3-羟基-萘-2-羰基)-酰肼(1)
2-(4,5-二苯基-1H-咪唑-2-偶氮基)-苯酚(2)
5-(2-硝基-苯基)-呋喃-2-羧酸-(2,4-二氯-苯基)-酰胺(3)
4-羟基-1-甲基-2-氧-1,2-二氢喹啉-3-羧酸N'-(2-氯-苯甲酰基)-酰肼(4)
(4-溴-苯甲酰基氨基)-乙酸-2-(3-硝基-苯基)-2-氧代-乙基酯(5)
4-溴-2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(5-氯-2-羟基烯苄基)-酰肼(6)
3-羟基萘-2-羧酸[1-(3-硝基-苯基)-乙烯基]-酰肼(7)
1-(2-甲基-苯甲酰基)-3-(4-吗啉-4-甲基-苯基)-硫脲(8)
4-{[(2-甲基-2,3-二氧-1,3-二氢-1H-异吲哚-5-羰基)-氨基]-甲基}-苯甲酸(9)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-(3-甲基-噻吩-2-亚甲基)-酰肼(10)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-吡啶-2-亚甲基-酰肼(11)
5-(4-硝基-1H-吡唑-1-甲基)-呋喃-2-甲酸(3-氨基甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-2-基)-酰胺(12)
2-苯并三氮唑-1-基-乙酰胺-乙基-硫脲(13)
[6-氧-2-(N'-2-甲基-苯基-胍基)-3,6-二氢嘧啶-4-基]-乙酸甲酯(14)
[5-氨基-3-(4-氯苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]-呋喃-2-甲酮(15)
2-(6-甲氧基-苯并噻唑-2-基-氨基)-烟酸(16)
N-(4-氯-苯并噻唑-2-基)-2-羟基-烟酰胺(17)
2-甲氧基-N-[5-(3-硝基-苯基)-[1,3,4]噻二唑-2-基]-苯甲酰胺(18)
5-溴呋喃-2-羧酸(2-苯并[1,3]间二氧戊烯-5-基-1-氨基甲酰基乙烯基)-酰胺(19)
2-(4-氯-苯基)-5-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸-(4-氟-2-甲基-苯基)-酰胺(20)
5-甲基-1-苯基-1H-[1,2,3]三唑-4-羧酸-(3-三氟甲氧基-苯基)-酰胺(21)
N-{3- [(四氢呋喃-2-亚甲基)-氨基甲酰基]-苯基}-琥珀酰胺酸(22)
1-(4-氟-苯基)-3-(2-三氟甲基-苯基-[1,3]-二氧杂环戊烯-2-基)-脲(23)。
2.一组抑制DJ-1二聚化的活性化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，具体化合物如下：
2-氯-5-硝基-苯甲酸-N’-(3-羟基-萘-2-羰基)-酰肼(1)
4-溴-2-甲基-2H-吡唑-3-羧酸(5-氯-2-羟基烯苄基)-酰肼(6)
3-羟基萘-2-羧酸[1-(3-硝基-苯基)-乙烯基]-酰肼(7)
1-(2-甲基-苯甲酰基)-3-(4-吗啉-4-甲基-苯基)-硫脲(8)
2-吡啶-4-基-喹啉-4-羧酸-吡啶-2-亚甲基-酰肼(11)
5-(4-硝基-1H-吡唑-1-甲基)-呋喃-2-甲酸(3-氨基甲酰基-4,5,6,7-四氢苯并噻吩-2-基)-酰胺(12)
2-苯并三氮唑-1-基-乙酰胺-乙基-硫脲(13)
[5-氨基-3-(4-氯苯基)-[1,2,4]三唑-1-基]-呋喃-2-甲酮(15)
2-甲氧基-N-[5-(3-硝基-苯基)-[1,3,4]噻二唑-2-基]-苯甲酰胺(18)
5-溴呋喃-2-羧酸(2-苯并[1,3]间二氧戊烯-5-基-1-氨基甲酰基乙烯基)-酰胺(19)
2-(4-氯-苯基)-5-甲基-1H-[1,2,4]三唑-3-羧酸-(4-氟-2-甲基-苯基)-酰胺(20)
N-{3- [(四氢呋喃-2-亚甲基)-氨基甲酰基]-苯基}-琥珀酰胺酸(22)；
其中，化合物1抗人宫颈癌Hela肿瘤细胞株和人骨肉瘤KHOS肿瘤细胞株；化合物8抗人宫颈癌Hela细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株和人前列腺癌PC3细胞株；化合物11抗人宫颈癌Hela细胞株和人骨肉瘤KHOS细胞株；化合物12抗人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株；化合物13抗人宫颈癌Hela细胞株和人骨肉瘤KHOS细胞株等肿瘤细胞；化合物20抗人鼻咽癌KB细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株；化合物6、7、15、18、19、22抗人肺腺癌A549细胞株、人结直肠癌HCT116细胞株、人宫颈癌Hela细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人鼻咽癌KB细胞株、人骨肉瘤KHOS细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人卵巢腺癌SKOV3细胞株和人骨肉瘤U2OS细胞株。
3.根据权利要求1所述的一组化合物在制备DJ-1二聚化抑制剂中的应用，其特征在于，所述23个化合物的筛选方法，通过以下方案实现：利用SybylX1.3药物分子设计及模拟软件包，基于DJ-1的蛋白晶体结构中，以关键氨基酸Cys106残基为中心，周围10Å范围内，包括氨基酸Ala14、Glu15、Cys106、Arg48、Ala107、Thr125、和Leu128在内的关键氨基酸及空间相近氨基酸组成潜在的结合口袋，开展药物设计和虚拟筛选，获得抑制DJ-1二聚化的活性化合物。
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