CN103760052A - 一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,使用光化学聚合方法或电化学聚合方法进行分子印迹膜合成,提高结合容量、降低延迟时间并增强特异性吸附能力;同时,使用石英晶振片作为传感器的效应器,提高传感器灵敏度、增加稳定性并降低成本。从而增强传感器性能,实现了对微囊藻毒素的痕量检测,建立了高灵敏度、快速、低成本、低操作要求的微囊藻毒素检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及微囊藻毒素检测传感器领域,具体为一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器。
背景技术
长江中下游地区是我国淡水湖泊集中分布的地区之一,在过去的几十年里,人类活动对本地区的湖泊生态系统产生了极大的影响,最突出的是城郊湖泊的日益富营养化。湖泊、水库和河流中接纳过多的氮和磷等营养物质,使水体的生态结构与功能发生变化,导致藻类特别是蓝藻的异常繁殖生长而出现蓝藻水华现象。随着水体富营养化的加剧而引起的有害藻类水华的频繁发生已成为普遍关注的环境问题。当蓝藻水华严重时,不仅影响人的感官、破坏健康平衡的水生生态系统,而且藻细胞破裂后释放出的多种藻毒素对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁。在已发现的各种藻毒素中,微囊藻毒素是目前已知的一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素,因此对微囊藻毒素的检测十分必要。
目前对微囊藻毒素的检测方法主要是化学分析法和免疫学检测法。在化学检测方法中使用较多的是高效液相色谱(HPLC)技术。HPLC技术一般采用正相或反相色谱对毒素进行分离,然后进行紫外(UV)、荧光(FL)或化学发光(CL)检测,可广泛用于微囊藻毒素的分离、鉴定和定量检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定,将两者的峰面积进行比较可对其进行精确定量。但HPLC方法技术含量高,价格昂贵;另外必须备有标准纯毒素或某毒素在相同实验条件下的保留值。由于当前世界塑料制品中塑料添加剂的广泛应用,采集水样的塑料容器中某些塑料添加剂会干扰HPLC 对微囊藻毒素的检测。免疫学检测法主要是酶联免疫分析(ELISA),应用此类分析方法筛选毒素的优点是灵敏度高、在处理大批样品时分析速度快、工作原理简单。在具备微囊藻毒素单克隆抗体、标准纯毒素和有关试剂的前提下,尤其是使用商品化的试剂盒时, ELISA方法是一种非常简便、高效、快速的方法。缺点是不能很好鉴别毒素,会出现假阳性反应。因此,目前缺少一种更好的微囊藻毒素检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,以解决现有检测技术存在的问题。
为了达到上述目的,本发明所采用的技术方案为:
一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:包括石英晶振片,及设置在石英晶振片表面的金基底,所述金基底上通过光聚合或电化学聚合方法修饰有微囊藻毒素分子印迹膜,由石英晶振片、金基底、微囊藻毒素分子印迹膜构成微囊藻毒素检测传感器芯片,所述微囊藻毒素检测传感器芯片封装后构成微囊藻毒素压电检测传感器。
所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:采用光聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用甲基丙烯酸作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯作为交联剂,二苯甲酮作为引发剂,将制备好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩尔浓度比制得的乙醇混合溶液滴加到通过十一硫醇或十二硫醇修饰的金基底上后,使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射进行光交联反应,然后使用乙酸乙醇等体积比混合溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜,所述微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔。
所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:采用电化学聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用3-APBA作为功能单体和交联剂,金基底作为工作电极,铂电极作为负电极,Ag/AgCl作为参比电极,微囊藻毒素、3-APBA和氯化钠按照1:10:10左右的摩尔浓度比制得乙醇混合溶液作为反应溶液,使用范围在0.1V到+1.4V之间并以20mV/s变化的电压循环进行电化学聚合反应,然后使用含3%乙酸和0.1%吐温-20的乙醇溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜,所述微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔。
所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:通过更改功能单体、交联剂及引发剂的种类,可制作其它毒素的检测传感器。
所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:所述微囊藻毒素检测传感器芯片封装时,采用PMMA制作下底及盖合在下底上的上盖,微囊藻毒素检测传感器芯片封装在下底中,在上盖上设置进样管道、出样管道,上盖和进样管道、出样管道使用环氧树脂进行粘合,下底和上盖使用通过螺杆和螺母安装为一体。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)采用了分子印迹技术作为传感器的敏感层,增强了对微囊藻毒素的特异性识别、吸附效率,提高了检测手段的特异性以及缩短了检测时间。
(2)采用光聚合方法和电化学聚合方法合成分子印迹膜,降低了延迟时间、提高了吸附容量、增强了特异性识别能力,提高了传感器的性能。
(3)使用了石英晶振片膜作为传感器的效应器,降低了成本、提高了灵敏度,提高了传感器的性能。
(4)整个传感器操作简单、快速,对操作人员要求低,为实现对微囊藻毒素的实时监测提供了有力帮助。
附图说明
图1为石英晶振片传感芯片示意图,其中:
图1a为整体结构示意图,图1b为微囊藻毒素分子印迹膜的微观结构示意图。
图2为石英晶振片传感芯片封装结构示意图。
图3为本发明应用的测试系统示意图。
图4为本发明测试结果图。
图5为本发明应用的便携小型化测试仪器示意图。
具体实施方式
如图1所示。一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,包括石英晶振片1,及设置在石英晶振片1表面的金基底2,金基底1上通过光聚合或电化学聚合方法修饰有微囊藻毒素分子印迹膜3,由石英晶振片1、金基底2、微囊藻毒素分子印迹膜3构成微囊藻毒素检测传感器芯片6,微囊藻毒素检测传感器芯片6封装后构成微囊藻毒素压电检测传感器。
采用光聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用甲基丙烯酸作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯作为交联剂,二苯甲酮作为引发剂,将制备好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5摩尔比制得的乙醇混合溶液滴加到通过十一硫醇或十二硫醇修饰的金基底上后,使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射进行光交联反应,然后使用乙酸乙醇等体积比混合溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子5,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜3,微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔4。
采用电化学聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用3-APBA作为功能单体和交联剂,金基底作为工作电极,铂电极作为负电极,Ag/AgCl作为参比电极,微囊藻毒素、3-APBA和氯化钠按照1:10:10摩尔浓度比制得的乙醇混合溶液作为反应溶液,使用范围在0.1V到+1.4V之间并以20mV/s变化的电压循环进行电化学聚合反应,然后使用含3%乙酸和0.1%吐温-20的乙醇溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子5,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜3,微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔4。
通过更改功能单体、交联剂及引发剂的种类,可制作其它毒素的检测传感器。
微囊藻毒素检测传感器芯片封装时,采用PMMA制作下底及盖合在下底7上的上盖8,微囊藻毒素检测传感器芯片封装在下底7中,在上盖8上设置进样管道10、出样管道11,上盖8和进样管道10、出样管道11使用环氧树脂进行粘合,下底7和上盖8使用通过螺杆和螺母9安装为一体。
本发明中,针对传感器检测对特异性、检测速度的需要,本发明提出使用分子印迹技术作为传感器的敏感层,分子印迹技术的原理是模板分子与功能单体在分散介质中,依靠相互作用力以及空间位阻效应等,形成可逆结合的复合物,再加入交联剂和引发剂引发聚合形成多孔功能材料,并且将模板分子有规律地包在其中,合成后用特定方法把模板分子去除,从而获得能与模板分子互补、并具有特异识别功能的三维孔穴,从而快速、高特异性的结合模版分子。
本发明中,在传感器上修饰分子印迹膜的传统方法主要是涂布方法,首先制备毫米级或纳米级的分子印迹聚合物颗粒,再将聚合物颗粒包埋于凝胶或膜内,采用旋转涂布或喷雾涂布制得识别层,这种方法带来的问题是传感器响应时间延长、对目标分子产生非特异性吸附和结合容量低。
本发明提出使用原位聚合方法在传感器上修饰分子印迹膜,根据不同情况采用光聚合和电化学聚合。光聚合是把聚合体系混合液涂布在传感器上,在惰性气体的保护下,紫外光引发聚合,除去模板分子后,制得分子印迹膜;电化学方法是在电化学反应池中,在一定的电势下提供电子,引发聚合,制得识别层。这两种方法可以直接在原位制得识别层,避免了传统方法的弊端,而且重复性好、环境友好。
本发明中,针对传感器对高灵敏度、低成本、简便的需要,本发明提出使用石英微天平作为传感器的效应器,这种低成本、高灵敏度的压电感应器件能够快速灵敏的检测到传感器表面低至10ng的质量变化,而且器件稳定,抗干扰能力强。通过在效应器表面修饰的分子印迹膜结合微囊藻毒素引起表面质量的改变,从而引起效应器信号发生改变,利用信号采集系统采集记录信号变化,就能够检测出样品中的微囊藻毒素。
本发明中,针对检测对快捷使用的需求,本发明提出利用该传感器体积小、功耗低的优势,进行封装、集成,制成小型化、便携的检测设备;并且利用低成本的优势,传感器芯片可以一次性使用,降低了对使用人员的要求,方便使用。
具体实施例:
针对微囊藻毒素分子印迹膜3的合成,本发明采用了光聚合合成方法,石英晶振片使用氧气等离子体清洗器清洗2-4分钟,在50-1000 mM十一硫醇的乙醇溶液或十二硫醇的乙醇溶液中浸泡12小时以上,取出后乙醇冲洗,氮气吹干;取0.1-200 umol微囊藻毒素和1-2000 umol甲基丙烯酸于1-2 mL乙醇溶液混合静置3小时以上,加入2-2000 umol二甲基丙烯酸乙二醇酯和0.016-16 mg二苯甲酮,氮气处理10分钟以上;向传感器基底表面滴加100 uL配置好的反应溶液,在氮气保护环境中使用365±10 nm紫外光照射进行光交联反应,待表面微干后继续滴加反应溶液,重复10次以上,再使用乙醇和乙酸等体积比混合溶液流动冲洗12小时以上,完成后乙醇冲洗除去表面洗脱液,氮气吹干。
针对微囊藻毒素分子印迹膜3的合成,本发明还采用了电化学聚合合成方法,石英晶振片使用氧气等离子体清洗器清洗2-4分钟;配置1-100 mmol/L 3-APBA、0.01-1 mg/mL微囊藻毒素和100 mmol 氯化钠混合溶液,氮气处理10分钟以上,室温静置2小时以上;金电极作为工作电极,铂电极作为负电极,Ag/AgCl做参比电极,配置好的溶液为反应溶液,电化学工作站按20mV/s从-0.1V到+1.4V循环5次。使用含3%乙酸和0.1%吐温-20的乙醇溶液流动冲洗基底24小时以上,完成后乙醇冲洗除去表面洗脱液,氮气吹干。
针对石英晶振片传感芯片6的封装,如图2所示,使用PMMA制作下底7,带通道上盖8,使用环氧树脂粘合进样管道10、出样管道11和上盖8,使用螺杆、螺母9固定下底7和上盖8;针对Lamb传感芯片16的封装,使用PMMA制作下底17,上盖18,使用环氧树脂粘合进样管道19、出样管道20和上盖18以及下底17和上盖18。
针对系统测试,如图3所示,使用蠕动泵12作为进样系统,传感器13接入信号分析仪器14进行测试。使用10 umol/L和1 umol/L微囊藻毒素标准溶液样品以及检验特异性效果的一个九肽10 umol/L溶液加入传感器系统进行测试,测试结果如图4所示,在待测微囊藻毒素样品浓度低至1 umol/L时,传感器也表现了30 Hz的显著信号变化,对于非微囊藻毒素样品,传感器未表现信号变化,表现传感器特异性良好。
针对便携小型化的要求,如图5所示,将传感器15、信号分析模块16、显示模块17集成封装。
Claims (5)
1.一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:包括石英晶振片,及设置在石英晶振片表面的金基底,所述金基底上通过光聚合或电化学聚合方法修饰有微囊藻毒素分子印迹膜,由石英晶振片、金基底、微囊藻毒素分子印迹膜构成微囊藻毒素检测传感器芯片,所述微囊藻毒素检测传感器芯片封装后构成微囊藻毒素压电检测传感器。
2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:采用光聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用甲基丙烯酸作为功能单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯作为交联剂,二苯甲酮作为引发剂,将制备好的微囊藻毒素、甲基丙烯酸、二甲基丙烯酸乙二醇酯及二苯甲酮按照1:10:10:5左右的摩尔浓度比制得的乙醇混合溶液滴加到通过十一硫醇或十二硫醇修饰的金基底上后,使用365±10 nm波段2 J/cm2紫外光照射进行光交联反应,然后使用乙酸乙醇等体积比混合溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜,所述微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔。
3.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:采用电化学聚合方法在金基底上修饰微囊藻毒素分子印迹膜过程如下:首先使用3-APBA作为功能单体和交联剂,金基底作为工作电极,铂电极作为负电极,Ag/AgCl作为参比电极,微囊藻毒素、3-APBA和氯化钠按照1:10:10左右摩尔浓度比制得的乙醇混合溶液作为反应溶液,使用范围在0.1V到+1.4V之间并以20mV/s变化的电压循环进行电化学聚合反应,然后使用含3%乙酸和0.1%吐温-20的乙醇溶液做洗脱液洗脱微囊藻毒素分子,在金基底上形成微囊藻毒素分子印迹膜,所述微囊藻毒素分子印迹膜上具有对微囊藻毒素特异性识别并均匀分布的微孔。
4.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:通过更改功能单体、交联剂及引发剂的种类,可制作其它毒素的检测传感器。
5.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术的微囊藻毒素压电检测传感器,其特征在于:所述微囊藻毒素检测传感器芯片封装时,采用PMMA制作下底及盖合在下底上的上盖,微囊藻毒素检测传感器芯片封装在下底中,在上盖上设置进样管道、出样管道,上盖和进样管道、出样管道使用环氧树脂进行粘合,下底和上盖使用通过螺杆和螺母安装为一体。
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