CN103740850A

CN103740850A - 基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103740850A
Application number: CN201410041149.4A
Authority: CN
Inventors: 唐晶; 刘文娟; 张忠英
Original assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Current assignee: Zhongshan Hospital Xiamen University
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: CN103740850B

Abstract

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法，涉及MicroRNA。试剂盒设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶。提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入试剂盒提供的浓度为5n mol的外源性参照cel-miR-395μL，漩涡震荡；若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39；采用试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA；采用试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析。

Description

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及MicroRNA，尤其是涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用，具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与Ago蛋白等形成RISC（RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控（Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297）。

由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义。目前，检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中，northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足地方在于不能准确检测到低表达的miRNA；微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时，费力和标记成本高，检测灵敏度和特异性低等问题。

实时荧光定量技术（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前，用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括miRNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种：同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针（一种适合于扩增短片段的荧光探针），由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA缺点在于合成价格贵，不利于推广。

目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDDmutant using AllGlo^TMprobes[J].Clin Chim Acta,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵袭性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation ofdiagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong huaNei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。

有研究报道表明甲基化miR-9在咽部鳞状细胞癌组织中高表达，miR-9可能通过抑制细胞复制和上调肿瘤抑制因子PTEN的表达从而发挥抑制肿瘤的作（Jacob Minor,Xiaotian,FangZhang,John Song,Antonio Jimeno，et al.Methylation of microRNA-9is a specific and sensitivebiomarker for oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas[J].J Oral Oncology，2012,48：73-78）目前miR-9在生物领域功能越来越得到重视。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有检测miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒。

本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9的检测方法。

所述hsa-miR-9为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.15＇-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3＇。

所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，设有盒体、隔板、外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶；隔板设在盒体内，外源性参照瓶、茎环逆转录试剂瓶、实时荧光定量PCR试剂瓶插在隔板上，外源性参照瓶内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶内装有实时荧光定量PCR试剂。

所述外源性参照可采用cel-miR-39等，所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为：SEQ ID NO.25＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇；其工作浓度可为5nmol。

所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液（所述5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl、375m mol KCl、15m mol MgCl₂、50mmol DTT组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl₂、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100nmol）。

所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-9的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成：

所述hsa-miR-9的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.35＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCATACAG-3＇；

所述外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.45＇-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTGTTCCT-3＇；

所述内源性参照U6的特异逆转录引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.55＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇。

所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100mmol Tris-HCl，500m mol KCl）、10m mol的MgCl₂、5单位/μL的Taq聚合酶、10m moldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。

所述特异正向引物由hsa-miR-9的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成：

所述hsa-miR-9的特异引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.65＇-GGCTGCTCTTTGGTTATCTA-3＇；

所述外源性参照cel-miR-39的特异引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.75＇-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT-3＇；

所述内源性参照U6的特异引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.85＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇。

所述通用反向引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.95＇-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇。

所述AllGlo探针由hsa-miR-9的特异探针、内源性参照U6的特异探针和外源性参照cel-miR-39的特异探针组成；

所述hsa-miR-9的特异探针的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.10MAR-TTGCACTGGATACGACTCATACAGCT-MAR；

所述内源性参照U6的特异探针的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.11JUP-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCC-JUP；

所述外源性参照cel-miR-39的特异探针的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.12JUP-TGCACTGGATACGACCAAGCT-JUP。

所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9的检测方法，其步骤如下：

1）采用常规方法提取样本中miRNA，若为血清/血浆或其他体液样本，则在样本充分裂解后加入所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒提供的浓度为5n mol的外源性参照cel-miR-395μL，立即进行漩涡震荡15s；若为细胞或组织样本，则无需加入外源性参照cel-miR-39；

2）采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒提供的茎环逆转录试剂逆转录miRNA为cDNA；

3）采用所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将cDNA进行实时PCR扩增；

4）综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline），进行结果分析。

所述AllGlo探针可采用美国A1leLogic Biosciences Corporation公司的荧光定量探针，它拥有普通Taqman，Taqman-MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克服了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman一端报告基团一端淬灭基团的限制，利用了美国A1leLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制荧光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm值（退火温度）的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。

所述AllGlo探针具有以下优势：①提高Tm值（可达10℃以上），探针更短可以达到15～16个碱基，可以适用A,T含量比较高的序列设计探针；②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。

本发明采用了AllGlo探针技术，建立了能检测miRNA的实时荧光定量PCR的方法，与taqman-MGB探针法相比，线性范围均能达到7个数量级。本发明建立的实时荧光定量PCR灵敏度最低可达10拷贝/μL，最高可达107拷贝/μL。

本发明采用了AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP),并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探针荧光定量PCR技术检测hsa-miR-9的方法，应用前景广阔。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种基于AllGlo探针RT-qPCR的hsa-miR-9检测试剂盒和检测方法，其特异性和敏感性高，可快速准确检测样本中miRNA的含量，与现有技术相比具有以下优势：

1.与northern blot，miRNA芯片相比，AllGlo探针检测的特异性和敏感性均要高，价格比miRNA芯片要便宜；

2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低；而且合成程序简单，价格仅相当于Taqman-MGB的一半。

3.相比目前普遍采用的基于SYBGreen染料检测miRNA方法，基于AllGlo探针检测miRNA的反应时间大大缩短，而且敏感性与特异性要明显高于基于SYBGreen检测miRNA的方法；

4.本发明建立了基于AllGlo探针的RT-qPCR检测hsa-miR-9的方法，适合于作为筛选miRNA的临床样本验证，为进一步研究miRNA在相关疾病中扮演的作用起到推动作用。

附图说明

图1为本发明基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒实施例的结构组成示意图。

具体实施方式

实施例1

参见图1，本发明所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒实施例，设有盒体1、隔板2、外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5；隔板2设在盒体1内，外源性参照瓶3、茎环逆转录试剂瓶4、实时荧光定量PCR试剂瓶5插在隔板2上，外源性参照瓶3内装有外源性参照，茎环逆转录试剂瓶4内装有茎环逆转录试剂，实时荧光定量PCR试剂瓶5内装有实时荧光定量PCR试剂。

①所述外源性参照可采用cel-miR-39等，所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA，其工作浓度可为5n mol，其作用在于监测从miRNA提取到后续实时荧光定量PCR全过程的反应效率；

②茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液（5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl，375m mol KCl，15m mol MgCl₂，50m mol DTT组成）、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl2、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品（这里的miRNA标准品是指人工合成的miRNA，浓度为100n mol）;

③实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液(10×Taq缓冲液包括100m molTris-HCl，500m mol KCl）、10m mol的MgCl₂、5单位/μL的Taq聚合酶、10m moldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针。

实施例2

血清或血浆hsa-miR-9的检测，包括以下步骤：

1.收集血浆或血清：

抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管或无抗凝剂管中，立即将上述试管颠倒混匀6～8次，然后将上述试管置于离心机3000r离心10min，结束后取出置于试管架上，小心吸取上清置于新的1.5mL的无RNA酶的离心管中，将装有上清的1.5mL的离心管置于离心机中13000r离心10min，结束后将上层血浆或血清转移至新的1.5mL无RNA酶的离心管中（此步骤注意不要吸取到下层的细胞沉淀。），每管分装400～500μL，取200μL用于下一步提取，其余血浆或血清于-80℃冻存。

2.提取microRNA

采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501)，按照操作说明书进行样本（血浆或血清）miRNA提取，其中200μL血浆或血清在加入同等体积的裂解液剧烈震荡30s后静置5min，然后加入外源性参照cel-mir-39(其工作浓度为5n mol)5μL，后按照说明书操作进行，最后用30μL的去核酶水溶解miRNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取纯度A260/A280比值在1.6～2.2之间，取浓度2～20ng/μL的已提取的miRNA用于下游的逆转录，其余的miRNA均于-80℃冻存。

3.miRNA的逆转录：

3.1将逆转录所需成分于室温下溶解，震荡混匀后置于冰上；请按表1配制逆转录反应液。

表1

组分	加入体积（μL）
		MMLV逆转录酶(200单位/μL）（promega公司）	0.4
MMLV5倍逆转录酶缓冲液（promega公司）	8
		脱氧核苷混合液（10mL）	1.6
RNA酶抑制剂（40单位/μL）	0.4
		特异性茎环逆转录引物（1μL)	各1.2,共2.4
无核酶水	25.2
		总体积	38

注：表1中特异性逆转录引物各1.2μL分别是指目的hsa-miR-9的特异逆

转录引物和外源性参照cel-miR-39的特异引物。

3.2将配好的38μL混合液分装于无RNA酶的PCR管中，后加入2μL已提取富集的miRNA溶液，用无RNA酶枪头充分混匀（此操作尽量避免气泡的产生），短暂离心甩至管底后置于普通PCR仪（Biorad公司生产）上，逆转录反应条件如表2。

表2

步骤	条件
		1	25℃5min
2	42℃60min
		3	70℃15min

反应结束后置于4℃或冰上。

4.实时荧光定量PCR检测hsa-miR-9

4.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。

4.2配制PCR反应混合液如表3。

表3

组分	每管体积（μL)
		dNTP混合液（10m mol)	2
MgCl2(25m mol)	2
		10×Taq缓冲液(无Mg²⁺)	2
Taq(5单位/μL)(takara公司)	0.2
		正向引物（10μmol)	0.4
反向引物(10μmol)	0.4
		探针(10μmol)	0.2
去核酶水	10.8
		总体积	18

4.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入2μL的cDNA，充分混匀，整个过程在冰上进行，避免气泡的产生。

4.4荧光定量PCR反应反应条件如表4。

表4

检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300，7500（美国Applied Biosystems公司）等多种仪器。

5.数据分析与标准化处理：应用ABI仪器自带软件以及Excel进行数据分析，用上述方法可测的样本（血清或血浆）中hsa-miR-9和外源性对照cel-mir-39的CT值，根据参照的CT值水平求得hsa-miR-9在血清或血浆中的相对含量，以qPCR中相对定量的2^-ΔCt方式表示血清或血浆中目的hsa-miR-9的水平（ΔCt为hsa-miR-9与外源参照的Ct值之差)。

实施例3.组织或细胞miRNA检测

1.样品处理：

a.组织：将组织在液氮中磨碎。每30～50mg动物组织或者100mg植物组织加1mL裂解液MZ（天根生物科技有限公司生产），用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过裂解液MZ体积的10%。

b.单层培养细胞：直接在培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10cm²面积加1mLMZ。用取样器抽打几次。

c.细胞悬液：离心800r5min取细胞，弃上清。加入1mL裂解液MZ，振荡器振荡或移液器吸打数次混匀。加裂解液MZ前不要洗涤细胞，以免降解RNA。

2.组织，细胞miRNA提取和富集

采用天根生物科技有限公司的生产的miRNA提取试剂盒(DP501),按照操作说明书进行组织或细胞miRNA提取，最后用50μL的去核酶水溶解RNA，于核酸分光光度仪器NanoDrop2000上分别测定浓度和纯度，

3.组织，细胞miRNA的逆转录及实施荧光定量检测。

后续步骤参照实施例2的步骤2～4，但作以下更改：

①在实施例2步骤2中逆转录反应液的混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物要换成U6的特异引物，引物的浓度及体积不变；

②后续实时荧光定量的PCR混合液中外源性参照cel-miR-39的特异引物和探针要换成U6的特异引物和探针。

可应用范围：

基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒及其检测方法可应用于人类组织、血细胞及体液中细胞hsa-miR-9表达水平的检测，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。

Claims

1.基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述hsa-miR-9为一种人源性miRNA，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.15＇-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3＇；

2.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述外源性参照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39为一种线虫类miRNA,其核苷酸序列为：SEQ ID NO.25＇-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3＇；其工作浓度为5nmol。

3.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述茎环逆转录试剂包括以下组份：200单位/μL的MMLV酶、10m mol dNTP混合液、5×RT缓冲液、40单位/μL的RNA酶抑制剂、10m mol的MgCl₂、1μmol的特异的miRNA的逆转录引物、miRNA标准品，浓度为100n mol；所述5×RT缓冲液由250m mol Tris-HCl、375mmol KCl、15m mol MgCl₂、50m mol DTT组成。

4.如权利要求3所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述miRNA的特异逆转录引物由hsa-miR-9的特异逆转录引物、外源性参照cel-miR-39的特异逆转录引物和内源性参照U6的特异逆转录引物组成；

5.如权利要求1所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10×Taq缓冲液、10m mol的MgCl₂、5单位/μL的Taq聚合酶、10m moldNTP混合液、100mL无核酶水、10μmol特异正向引物、10μmol通用反向引物和AllGlo探针；10×Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl，500m mol KCl。

6.如权利要求5所述基于AllGlo探针荧光定量PCR的hsa-miR-9检测试剂盒，其特征在于所述特异正向引物由hsa-miR-9的特异引物、外源性参照cel-miR-39的特异引物和内源性参照U6的特异引物组成；